زمینه وهدف : اهداف این پژوهش بررسی شیوع سویه های مایکوباکتریوم بویس در انسان و مقایسه تنوع ژنتیکی جدایه های مایکوباکتریوم بوویس از انسان و گاو است وهمچنین شناسایی زیر گونه های م.بوویس(م.بوویس ساب تایپ بوویس و م.بوویس ساب تایپ کاپریه ) در انسان و دام انجام گردید. به علت متفاوت بودن درمان سل در موارد درگیری فرد با گونه های م.بوویس در انسان بررسی این زیر گونه ها با کمک تکنیک های مولکولار اپیدمیولوژی اهمیت ویژه ای پیدا می کند . مواد و روش: پس از انتخاب نمونه ها و جداسازی از محیط کشت لوان اشتاین جانسون و انجام تست های افتراقی (تست نیاسین،احیاء نیترات،تست کاتالاز وتست مهار رشد بوسیله tch) م.بوویس ها از م.توبرکلوزیس ها تمایز داده شد. سپس استخراج dna برای نمونه های انسانی به روش کیت کیاژن و برای نمونه های دامی از کلنی های رشد کرده در محیط کشت سوسپانسیونی در بافر لیز کننده مایکوباکتریوم ها تهیه و به روش جوشانیدن dna آن استخراج گردید. سپس اسپولیگوتایپینگ با استفاده ازپرایمرهای dra و drb انجام شد و نتایج حاصله در سایت 4spoldb آنالیز شدند. واز روش rflpـpcr برای ژن pnca جهت بررسی مقاومت به پیرازینامد استفاده شد. یافته ها و نتایج: از ???? نمونه کشت مثبت بیماران مسلول تعداد ? بیمار (6/0 ?) مبتلا به م.بوویس بودندکه دارای st??? و st??? بودند. و از ?? نمونه دامی مبتلا به م.بوویس با کمک روش اسپولیگوتایپینگ ?? سویه (1/91 ?) در ? کلاستر طبقه بندی شدند: کلاستر?: ?? سویه(5/45 ?) با st??? ، کلاستر?: ??سویه (1/19 ?) با st????، کلاستر?: ??سویه (6/17 ?) با st ناشناخته، کلاستر?:?سویه(9/2 ?) با st??? ، کلاستر? و? : هرکدام ?سویه (9/2 ?) با st ناشناخته، و باقی ? سویه (?/? ?) به صورت منفرد بودند و در هیچ کلاستر طبقه بندی نشدند که ? سویه دارای st??? بود. بحث و نتیجه گیری: م.بوویس ساب تایپ بوویس در جمعیت ایرانی با فراوانی 0.6 ? گزارش شد که پایین تر از میانگین موارد بررسی شده پیشین است.در این مطالعه همه سویه ها م.بوویس ساب تایپ بوویس بودند که مقاوم به پیرازینامید بودند و هیچ سویه م.بوویس ساب تایپ کاپریه یافت نشد.همچنین تنها stمشترک بین سویه های دامی و انسانی st ??? بود و م.بوویس ساب تایپ بوویس با st ??? شاخص بوویس انسانی گزارش شد.

هدف این مطالعه بررسی نشانه های بالینی، یافته های کالبدگشایی، آسیب شناسی، جداسازی، تعیین هویت مولکولی، انگشت نگاری ژنومی و حساسیت دارویی ، مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه اویوم در گله های کبوتر مشکوک به بیماری سل می باشد. به این منظور بر اساس نشانه های بالینی، 80 کبوتر از بین بیش از 600 کبوتر انتخاب شدند و همه ی آن ها پس از آسان کشی، کالبدگشایی شدند. هم چنین 10 تخم از این گله ها جمع آوری گردید. بعد از ثبت جراحات ماکروسکپی در کار برگ، نمونه های بافتی دارای جراحت و در صورت عدم وجود جراحت، کبد به صورت استریل برداشته شد و در ظرف استریل درب دار قرار می گرفتند و همراه با تخم ها در کنار یخ خشک به آزمایشگاه مرجع سل موسسه واکسن و سرم سازی رازی (حصارک) جهت تشخیص قطعی ارسال می شدند. هم زمان جهت مطالعات هیستوپاتولوژی قسمتی از آن ها در داخل بافر فرمالین 10% با حجم حداقل 10 برابر قرار داده شدند و به آزمایشگاه پاتولوژی دانشکده دامپزشکی اهواز ارسال شد. در آزمایشگاه مرجع بافت های هر پرنده پس از مخلوط و خرد شدن و آلودگی زدایی مطابق روش nalc-naoh، بروی محیط های اختصاصی لونشتاین جانسون و هرولداگ کشت داده شدند. ژنوم dna همه جدایه ها بر اساس روش ون سولینگن استخراج شد. همه باسیل های اسید فست جدا شده، به وسیله آزمایش pcr با پرایمرهای s rrna16 و 1245is و 901is مورد بررسی قرار گرفتند. انگشت نگاری ژنومی توسط آنزیم هضم کننده pvuii و پروب 901is بر روی 40 جدایه انجام گرفت و آزمایش حساسیت دارویی بر روی 20 جدایه صورت گرفت. این بررسی نشان داد تورم مفاصل پاها، بال ها و تحلیل عضله سینه از مهم ترین نشانه های بالینی بیماری سل می باشند و در کالبدگشایی بیشترین جراحات در کبد مشاهده شد. از 51 کبوتر و از یک تخم مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه اویوم جدا گردید. بر مبنای نشانه های بالینی، یافته های کالبدگشایی و جداسازی باکتری تفاوت معنی داری در حساسیت به عفونت و بیماری بین کبوتران نر و ماده مشاهده نشد. بر مبنای یافته های کالبدگشایی اشکال کلاسیک، روده ای، کبدی و غیر سلی شرح داده شد. در بررسی های هیستوپاتولوژی اندام های دارای جراحت، جراحات گرانولوماتوزی که توسط ماکروفاژها، لنفوسیت ها و سلول های غول پیکر احاطه شده اند مشاهده گردید ولی کلسیفیکاسیون وجود نداشت. همچنین رسوب آمیلوئید در دیواره مجاری صفراوی در کبد و در دیواره لوله های ادراری کلیه مشاهده گردید. در مجموع در این تحقیق با به کارگیری آنزیم pvuii و پروب 901is از 40 جدایه انگشت نگاری شده، تعداد 7 الگوی مختلف تشخیص داده شد،. تمام 20 جدایه مورد آزمایش در آزمایش حساسیت دارویی به داروهای استرپتومایسین، کانامایسین، اتیوناماید و تیوفن کربوکسیلیک اسید هیدرازید مقاوم بودند، اما به داروهای ایزونیازید، ریمفامپین و اتامبوتول به ترتیب 3، 2 و 1 جدایه حساس بودند. بررسی های هیستوپاتولوژیک، رنگ آمیزی زل نلسون و تعیین هویت مولکولی تایید کننده آلودگی کبوتران مورد مطالعه به مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه اویوم بود و بیانگر فراوانی این بیماری در منطقه می باشد، همچنین با توجه به مشترک بودن این بیماری و نگه-داری کبوتران در منازل مسکونی توجه بیشتر به این بیماری و مطالعات وسیع تر به خصوص در زمینه مولکولار اپیدمیولوژی حائز اهمیت است.

علی رغم استفاده از واکسن ب.ث.ژ از سال 1921 تا به حال، هنوز بیماری سل به عنوان دومین عامل مرگ ومیر در بین بیماریهای عفونی محسوب می گردد. با افزایش مقاومت عامل مولد سل (mycobacterium tuberculosis) به آنتی بیوتیک های معمول و وسیع الطیف و همچنین با ظهور hiv و عفونت این ویروس با مایکوباکتریوم توبرکولوزیس، مقابله با این بیماری بیشتر به چالش کشیده شده است. شناخت آنتی ژنهای موثر در ایمنی زایی محافظتی می تواند به عنوان کاندیدی برای طراحی واکسنهای نوین باشد. از جمله این آنتی ژنها ag85b و tb10.4 می باشد که با وزن مولکولی به ترتیب 30 و 10کیلودالتون توسط لنفوسیتهای t شناخته شده و سبب القاء پاسخ قوی th1 و درنتیجه بالا بردن تولید if-? می گردند. هدف از این تحقیق، ساخت کاست ژنی حاصل از تلفیق دو ژن فوق در درون وکتور pcdna3 می باشد. dna متعلق به مایکوباکتریوم توبرکولوزیس سویه h37rv به روش روتین استخراج گردید. ژنوم کدکننده این دو آنتی ژن توسط پرایمرهای اختصاصی به روش pcr تکثیر و سپس تلفیق گردید و پس از هضم آنزیمی درون وکتور یوکاریوتی pcdna3 کلون گردید. پلاسمید نوترکیب فوق در باکتری e.coli dh5? ترنسفورم گردید و پس از تخلیص، توسط آنالیز آنزیمی و توالی یابی مورد تایید واقع شد. نتایج تعیین توالی و آنالیز آنزیمی تایید نمود که کلونینگ با موفقیت انجام شده است. قطعات tb10.4 و ag85b ترکیب گردید و در وکتور pcdna3 با موفقیت کلون گردید. در مطالعات بعدی می توان بیان ژن را در رده سلولی ارزیابی نمود و از این کاست ژنی به عنوان واکسن dna استفاده نمود.

تلاش های بیشماری جهت تهیه واکسن موثر علیه بیماری سل گاوی انجام شده است که در این راستا ایمن سازی با پلاسمید نوترکیب حاوی آنتی ژن های هدف، راهکاری امید بخش به شمار می آید. این مطالعه با هدف کلونینگ، تایید بیان و ارزیابی ایمنی زایی پلاسمیدهای یوکاریوتی کد کننده ایمونوژن های هدف در مدل موش balb/c مورد بررسی قرار گرفت. آنتی ژن های 6 esat-و cfp-10 در پلاسمید بیانی یوکاریوتی pcdna3.1(+) کلون شدند. صحت و عملکرد پلاسمیدهای نوترکیب pcdna3.1(+)/esat-6 و pcdna3.1(+)/cfp-10در سطح dna با روش کلونی pcr، نقشه یابی آنزیمی و توالی یابی، در سطح rna باrt-pcr ژن esat-6 و cfp-10 از بافت ماهیچه مورد تزریق و در سطح پروتئین با وسترن بلات تایید شد. سپس موش هایbalb/c به 7 گروه تقسیم شدند و با تیمارهای پلاسمید نوترکیبesat-6 ، cfp-10، ترکیب دو پلاسمید، ppd، pbs، pcdna3.1(+) و گروه بدون تزریق ایمن شدند. بیست روز پس از تزریق، موش ها کشته و طحال و نمونه بافت ماهیچه آنها جدا شد. سپس سوسپانسیون لنفوسیتی تهیه و با ppd گاوی ppdانسانی مواجهه شد و پس از 72 ساعت به منظور سنجش تحریک سلول های لنفوسیت، تست mtt انجام شد. مایع رویی کشت لنفوسیت ها جهت بررسی الگوی ترشحی جمع آوری و با تست الایزا مقادیر ifn-y ، il-10 و il-4 اندازه گیری شد. همچنین سنجش بیان ژن های ifn-y ، il-10 و il-4 به وسیلهreal-time pcr صورت گرفت. آزمایشات الایزا وmtt تایید کرد که پلاسمیدهای نوترکیب کد کنندهesat-6 وcfp-10 توانایی القاء پاسخ ایمنی را در موش ها دارد و می توانند با القاء پاسخ ایمنی کاندید مناسبی برای dna واکسن علیه عفونت سل گاوی باشند.