نقص یا کمبود فاکتور 9 انسانی (یا فاکتور کریسمس) که در مسیر انعقاد نقش کلیدی دارد موجب بیماری هموفیلی b میگردد. در حال حاضر روش معالجه معمول این بیماری ژنتیکی جایگزین درمانی است که با استفاده از فاکتور 9 مشتق از پلاسمای انسان سالم و یا نوع نوترکیب آن انجام می گیرد. اما امکان آلوده بودن پروتئین های مشتق از پلاسمای انسان به انواع ویروس ها و پریون ها محققین را به سمت تولید انواع نوترکیب این پروتئین سوق داده است. برای تولید پروتئین های داروئی در اغلب موارد تغییرات بعد از ترجمه لازم است و سامانه های بیانی پستانداران در این رابطه معمولا اولین کاندید هستند. با توجه به مشکلات بیان پروتئین های نوترکیب در سلول های cho از جمله بیان پایین و ناکارآمدی در گاما کربوکسیلاسیون، لذا رده سلولی اشنایدر (s2) مشتق از دروزوفیلا برای تولید فاکتور 9 انسانی مورد آزمایش و بررسی قرار گرفت. نشان داده شد که بیان فاکتور 9 انسانی در سلول های s2 بسیار بیشتر از سلول های cho است. همچنین فعالیت بیولوژیکی فاکتور 9 و رسوب آن توسط باریوم سیترات موید قابلیت سلول های s2 برخلاف سایر سلول های حشرات در گاما کربوکسیلاسیون فاکتور 9 است. با توجه به اینکه گاماکربوکسیلاسیون یکی از اصلی ترین تغییرات بعد از ترجمه است که برای فعالیت فاکتور 9 ضرورت دارد، تاثیر بیش بیانی آن در این میزبان در انجام گاماکربوکسیلاسیون فاکتور 9 بیان شده نیز مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج نشان داد که برخلاف سلول های پستانداران، بیش بیانی گاما کربوکسیلاز باعث بهبود بیان و فعالیت فاکتور 9 می گردد.

چکیده: فاکتور 9 انعقادی انسان (hfix) که نقص یا کمبود آن منجر به هموفیلی نوع b می شود، به عنوان یک پروتئین وابسته به ویتامین k (vkd)، گاماکربوکسیلاسیون تعدادی از گلوتامیک اسیدهای دمین gla برای فعالیت زیستی آن ضروری است. سلول پستاندار که به عنوان بهترین میزبان تولید پروتئین های نوترکیب دارویی انسان شناخته می شود، از ظرفیت کافی برای گاماکربوکسیلاسیون کامل پروتئین بیش بیان شده برخوردار نیست. بنابراین، گاماکربوکسیلاسیون عامل محدود کنندهی تولید hfix به شمار می رود.

فاکتور 9 انسانی، نقش محوری در مسیر انعقاد خون ایفا می کند و متحمل چندین نوع تغییر پس از ترجمه می گردد، که در میان آنها گاماکربوکسیلاسیون برای فعالیت فاکتور 9 ضروری است. گزارشات قبلی نشان دادند که تعویض پروپپتید در پروتئین های وابسته به ویتامین k با پروپپتید پروترومبین انسانی که گرایش کمی به آنزیم گاماکربوکسیلاز دارد سبب افزایش گاماکربوکسیلاسیون در رده سلولی hek293 شد. این احتمال وجود دارد که پروپپتید که بلافاصله پس از پپتید نشانه است، تاثیر زیادی در ترشح پروتئین نیز داشته باشد. در این مطالعه، با هدف بهبود کارایی گاماکربوکسیلاسیون و ترشح فاکتور 9 نوترکیب، جایگزینی توالی پری پروی فاکتور 9 انسانی با توالی های پری پروی دو پروترومبین پستاندار در نظر گرفته شد. مقایسه اولیه پروترومبین های چندین پستاندار نشاندهنده شباهت زیاد بین پروترومبین انسانی و خوکی بود. همچنین، مطالعات رایانه ای کارایی ترشح بالاتری را برای پپتیدهای نشانه مشتق از پروترومبین در مقایسه با پپتید نشانه بومی فاکتور 9 پیشگویی کرد. بنابراین، پس از جایگزینی پری پروپپتید فاکتور 9 با پری پروپپتید پروترومبین های انسانی و خوکی، عملکرد آنها بر بیان فاکتور 9 در حالت های گذرا و پایدار در رده سلولی hek293 بررسی شد. ارزیابی بیان پروتئین در حالت گذرا نشان داد که بیشترین و کمترین میزان کارایی ترشح بترتیب متعلق به پپتیدهای نشانه پروترومبین خوکی(91%) و بومی فاکتور 9(86%) است. نتایج حاصل از فعالیت انعقادی فاکتور 9 بیان شده توسط دو سازه مجهز به پروترومبین های خوکی(mu/ml180) و انسانی(mu/ml160) افزایش 10 و 9 برابری را بترتیب نسبت به سازه بومی فاکتور 9(mu/ml 18) نشان دادند. بررسی های کمی در سطح رونویسی نیز نشان دهنده افزایش معنی دار دو سازه هترولوگ بود که نتایج حاصل از بررسی ساختار ثانویه mrna با محاسبه کمترین مقدار انرژی آزاد موید آن بود. پس از انجام ترانسفکشن در حالت پایدار، مقدار فاکتور 9 بیان شده توسط کلون pprot-hfix افزایش معنی داری نسبت به دو سازه دیگر نشان داد(ng/ml/106 cell2000). علاوه بر افزایش بیان، سازه pprot-hfix کارایی ترشح بالاتری(98%) نیز نشان داد که با نتایج حاصل از بیان گذرا مطابقت داشت. پس از آن، محیط های جمع آوری شده از کشت های پایدار سه گانه برای جداسازی پروتئین فاکتور 9 با روش کروماتوگرافی تبادل یونی تخلیص شدند.

به منظور مطالعه و ارزیابی تنوع ژنتیکی در بین 20 رقم کلزا، از 9 آغازگر issr استفاده گردید. از بین این آغازگرها، 8 آغازگر issr بیشترین چندشکلی را ایجاد نمودند. 9 آغازگر issr در مجموع 99 باند تولید کردند که 79 تای آن چند شکلی نشان دادند. در این مطالعه متوسط تعداد باند به ازای هر آغازگر و برای هر رقم، به ترتیب، 11 و 95/4 بود. تعداد باند چندشکل از 0 تا 14 باند متغیر بود. متوسط تعداد باند چند شکل به ازای هر آغازگر و هر رقم، به ترتیب، 77/8 و 95/3 عدد برآورد شد. بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی (pic) مربوط به آغازگر mm6 (78/0) بود. همچنین آغازگر hb10 بیشترین مقدار شاخص نشانگر (mi) (47/10) را به خود اختصاص داد. نمودار درختی حاصل از تجزیه خوشه ای با نرم افزار ntsys به روش upgma و ضریب تشابه تطابق ساده رسم و رقم ها در شش گروه قرار گرفتند. همچنین نمودار دو بعدی با استفاده از روش تجزیه به مختصات اصلی (pcoa) ترسیم و نتایج حاصل از گروه بندی آن با روش تجزیه خوشه ای مقایسه شد. گروه بندی دو روش تطابق زیادی با یکدیگر داشتند. تطابق بین دندوگرام و نمودار تجزیه به مختصات اصلی در این تحقیق حاکی از وجود تنوع در ژرم پلاسمی مورد مطالعه بود. بیشترین تشابه ژنتیکی بین دو رقم elite و rinbow مشاهده شد. همچنین دو رقم بهاره 110 hysyn و delgan ، از نظر ژنتیکی فاصله زیادی با هم داشتند. از این ارقام می توان در برنامه های اصلاحی به عنوان والدین تلاقی با هتروزیس بالا استفاده کرد. تنوع ژنتیکی از الگوی جغرافیایی تبعیت نمی کرد. تولید تعداد باند زیاد (99) و میزان چندشکلی بالا (میانگین 79 درصد) در رقم های مورد مطالعه، نشان دهنده کارایی بالای نشانگر issr جهت گروه بندی ارقام مختلف کلزا بود. در این تحقیق، آغازگرهای hb10، mm6 و hb14 دارای بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی و شاخص نشانگر بودند و علاوه بر آن چندشکلی بسیار بالایی (100 درصد) نشان دادند. بنابراین به عنوان آغازگرهای مفید و کارآمد در این پژوهش معرفی شدند. نتایج این تحقیق حاکی از قابل اطمینان بودن نشانگر issr برای آشکارسازی سطح بالایی از چندشکلی در بین رقم های کلزا بود. به منظور بررسی بیشتر در مورد تنوع ژنتیکی بین ارقام کلزا، پیشنهاد گردید تا در برنامه های آتی از رقم های متنوع و نیز اطلاعات مورفولوژیک استفاده گردد.