رز یکی از گیاهان زینتی و تجاری بسیار مهم می باشد. به همین دلیل امروزه کشت بافت و انتقال ژن این گیاه از اهمیت ویژه ای برخوردار است. بر اساس گزارشات ارائه شده تا به امروز، انتقال ژن به روش اگروباکتریوم به این گیاه معمولا از طریق جنین های سوماتیکی صورت می گیرد. همچنین از بین ژن های گزارشگر(reporter genes ) مورد استفاده در مهندسی ژنتیک، ژن لوسیفراز به عنوان گزارشگر ایده آل به منظور بهینه سازی سیستم انتقال ژن، کاربرد فراوان دارد. تحقیق حاضر جهت انتقال ژن لوسیفراز حشره شبتاب گونه ایرانی lampyris turkestanicus با تابش نور قرمز(ff-luc) توسط باکتری agrobacterium tumefaciens سوش lba4404 به گل رز، به منظور بهینه سازی سیستم انتقال ژن به این گیاه صورت گرفته است. جوانه های جانبی گل رز در محیط درون شیشه کشت شده و برگهای مناسب آنها به عنوان ریزنمونه اولیه برای کالوس زایی در محیط مخصوص قرار گرفتند. از بین 38 تیمار هورمونی در محیط ms و 16 تیمار هورمونی در محیط b5 محیط های حاوی mg 2 هورمون 2,4-d و mg 5/0 هورمون naa در محیط ms و محیط حاوی mg 5 هورمون 2,4-d و همچنین محیط حاوی mg 5/0 هورمون 2,4-d و mg 5/2 هورمون naa و mg 5/0هورمون کینتین در محیط b5 بهترین محیط ها برای تولید کالوس بودند. پس از آن کالوس های مناسب تحت تاثیر هشت تیمار مختلف هورمونی در محیط ms جهت تولید جنین قرار گرفتند، که محیط حاوی mg 1 هورمون tdz بهترین نتیجه را برای جنین زایی داشت. پس از بدست آوردن جنین های مناسب، این جنین ها با اگروباکتریوم سویه lba4404 حاوی ناقل بیانی pcambia1304 آلوده شدند. ریزنمونه های تلقیح شده، برای باززایی گیاه به محیط کشت انتخابی ms حاوی آنتی بیوتیک های هیگرومایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند. گیاهچه های باززایی شده بر روی محیط کشت انتخابی، جداسازی و به محیط کشت ریشه زایی انتقال یافتند. درنهایت گیاهچه های ریشه دار شده به پرلایت استریل منتقل شده و پس از سازگار شدن به گلدان هایی با خاک مناسب منتقل شدند. بررسی مولکولی pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن لوسیفراز، بر روی dna ژنومی استخراج شده از گیاهان باززایی شده صورت پذیرفت و تراریخت بودن آنها را تائید گردید.

پیشرفت های اخیر در زیست شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی گیاهی تصور عمومی را در مورد کاشت گیاهان به صورت سنتی و فقط به عنوان یک منبع غذایی به سمت اینکه گیاهان می توانند در نقش کارخانه های زیستی جهت تولید پروتئین های نوترکیب و دارویی ظاهر شوند تغییر داده است. گیاهان به دلیل توانایی تولید نامحدود در تعداد و مقدار پروتئین های ایمن و ارزان نوترکیب دارای قابلیت کشاورزی زیستی هستند. تحقیقات گسترده در دو دهه اخیر نشان داده است که دامنه وسیعی از پروتئین های مهم و ضروری می توانند به طور موثری در گیاهان بیان شوند. نمونه هایی شامل پروتئین های سرم و فاکتورهای رشدی، آنتی بادی ها، واکسن ها، آنزیم های تجاری، پلیمرهای زیستی و معرف های مولکول های زیستی وجود دارند.(.,2000.fischer and mans) آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب یکی از مهمترین آنزیم های صنعتی است که به طور وسیعی در زمینه های مختلف بیوتکنولوژی و بیولوژی سلولی و مولکولی بویژه در تشخیص میزان atp به منظور تشخیص آلودگی های میکروبی، تهیه کیت های تشخیص سرطان، غربالگری داروها، زیست حسگرها، همچنین در بررسی روابط برهمکنشی و تاخوردگی پروتئین ها، سنجش های آنزیمی و توالی یابی dna (pyrosequencing) استفاده می شود. ژن لوسیفراز نیز به عنوان ژن گزارشگر ایده آل در مهندسی ژنتیک به منظور بهینه سازی سیستم انتقال ژن، کاربرد فراوان دارد. تحقیق حاضر جهت انتقال ژن لوسیفراز حشره شب تاب گونه ایرانیlampyris turkestanicus و بررسی امکان سنجی تولید آن در گیاه کلزا انجام گرفت. در این تحقیق، ژن لوسیفراز حشره شب تاب (luc) که در ناقل بیانی pcambia1304 که تحت پیشبرنده s35 ویروس موزایک گل کلم (camv 35s) همسانه سازی شده بود توسط روش ذوب و انجماد به باکتری agrobacterium tumefaciens سوش lba4404 منتقل و به وسیله colony pcr با آغازگرهای اختصاصی تأیید شد. سپس پلاسمید نو ترکیب شامل ژن لوسیفراز حشره شب تاب (luc) به کمک باکتری آگروباکتریوم به گیاه کلزا منتقل گردید. ریزنمونه های لپه ای از گیاه کلزا رقم pf4570/91 برای تراریخت سازی مورد استفاده قرار گرفت.. جهت تعیین آستانه تحمل گیاه کلزا به آنتی بیوتیک هیگرومایسین غلظت های مختلف این آنتی بیوتیک مورد بررسی قرار گرفت. گیاهان تراریخت بر روی محیط ms حاوی آنتی بیوتیک هیگرومایسین و سفوتاکسیم انتخاب شدند. گیاهچه های باززایی شده بر روی محیط کشت انتخابی، جداسازی و به محیط کشت ریشه زایی انتقال یافتند. گیاهچه ها پس از ریشه دار شدن، ابتدا به گلدان حاوی پرلایت و در نهایت به خاک منتقل شدند آنالیز مولکولی گیاهان تراریخت وجود ژن لوسیفراز حشره شب تاب (luc) را در گیاهان تراریخت تأیید نمود. از گیاهان شاهد غیرتراریخت به عنوان کنترل منفی pcr استفاده گردید.

آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب (luc) یکی از مهم ترین آنزیم های صنعتی است که به طور وسیعی در زمینه های مختلف پزشکی، علوم گیاهی و بیولوژی سلولی و مولکولی کاربرد دارد. این آنزیم، به دلیل داشتن خصوصیاتی هم چون حساسیت بالا، تکرارپذیری مطلوب و قابلیت اندازه گیری کمی آن، کاندیدای بسیار مناسبی در زمینه تصویربرداری های بیولومینسانس در شرایط طبیعی و در سیستم های گزارشگر به منظور بهینه سازی سیستم های انتقال ژن و تولید موجودات تراریخت می باشد. تحقیق حاضر جهت همسانه سازی و انتقال ژن لوسیفراز حشره شب تاب گونه ایرانیl. turkestanicus با نشر نور قرمز در گیاه بنفشه آفریقایی (saintpaulia ionantha) انجام گرفت. خصوصیاتی هم چون داشتن رنگ و شکل متنوع، قابلیت رشد در شرایط اتاق، توانایی گل دهی تحت نور مصنوعی و تکثیر رویشی آسان در تمام فصول سال باعث محبوبیت این گل در میان گل های زینتی شده است. برای جداسازی و تکثیر ژن لوسیفراز (luc)، آغازگرهای مناسب با توجه به توالی های دو انتها، محل های برشی آنزیم های مناسب و توالی افزایش دهنده بیان گیاهی (kozak sequence) طراحی و ژن مورد نظر پس از جداسازی، در ناقل بیانی pcambia1304 همسانه سازی شد. ناقل نوترکیب جدید (pcamluc) با استفاده از بررسی های colony pcr،pcr ، هضم آنزیمی، توالی یابی و همردیف سازی آن در بانک اطلاعاتی (genbank)، مورد تایید قرار گرفت. ژن هدف به کمک باکتری آگروباکتریوم سویه lba4404 به گیاه بنفشه آفریقایی منتقل گردید. گیاهان تراریخت بر روی محیط های کشت انتخابی حاوی آنتی بیوتیک های هیگرومایسین و سفوتاکسیم باززایی شدند. آنالیز گیاهان تراریخت با آزمون pcr، rt-pcr و سنجش لومینومتری انجام گرفت.

خرما علاوه بر تامین بخشی از نیاز غذایی بشر در تهیه بسیاری از لوازم زندگی آن ها نقش بسزایی داشته است. سهم ایران در مقیاس آسیا با تولید یک میلیون تن در سال بالغ بر 25% و نسبت به کل جهان 16% است. آگاهی از میزان تنوع ژنتیکی ذخایر توارثی گونه های گیاهی در برنامه های اصلاح نباتی از اهمیت خاصی برخوردار است. در این بررسی 12 رقم خرما (phoenix dactylifera) استان کرمان با استفاده از شش آغازگرrapd مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان تشابه بین افراد با روش upgma و با ضریب تشابه جاکارد و با استفاده از نرم افزار ntsys اندازه گیری شد. نتایج داده های مولکولی نشان داد که بیشترین تعداد باند چند شکل تولیدی مربوط به آغازگرهای opz-10 و opz-20 بود و بنابراین در مقایسه با دیگر آغازگرها، توانایی برتری در شناسایی تنوع ژنتیکی و تفکیک ارقام خرما دارند. بر اساس نتایج تجزیه خوشه ای، ارقام مورد مطالعه به سه گروه تقسیم شدند. بیشترین شباهت ژنتیکی با ضریب تشابه 72/0 میان ارقام سنگ شکن و هلیله ای و کمترین شباهت ژنتیکی با ضریب تشابه 24/0 میان ارقام ماده مضافتی و نر به مضافتی حاصل شد. در این مطالعه نتایج حاصل از گروه بندی ارقام از طریق تجزیه به مختصات اصلی با نتایج تجزیه خوشه ای مطابقت داشت. لذا با توجه به تنوع بالا خرما، انتظار می رود که ارقام خرمای موجود در استان کرمان منبع ژنتیک غنی برای مطالعات اصلاحی باشند. نهایتاً نتایج این تحقیق امکان استفاده از نشانگر rapd را در مدیریت ذخایر توارثی، تعیین میزان تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی ارقام خرمای استان کرمان را نشان داد.کلید واژه ها: خرما، تشابه ژنتیکی، تنوع ژنتیکی، نشانگر مولکولی rapd

دیابت بیماری است که بدن نمی تواند انسولین تولید کند یا به درستی از آن استفاده کند. اگرچه انسولین عموماً در باکتری یا مخمر برای استفاده تجاری تولید می شود اما در حال حاضر تحقیقات بر روی روش های دیگر تولید از جمله تولید پروتئین انسولین در گیاهان متمرکز شده است. گیاه کاهو (lactuca sativa l.) یک گیاه مناسب برای تولید پروتئین های نوترکیب و بویژه واکسن های خوراکی می باشد. این گیاه یکی از عمده ترین سبزی های برگی بوده و متعلق به خانواده asteraceae می باشد. در این مطالعه با استفاده از آغازگرهای مخصوص و روش pcr، ژن پروانسولین انسانی تکثیر شد. ژن تکثیر شده از روی ژل جداسازی و با آنزیم های خاص برش داده شد و در ناقل pcambia1304 همسانه سازی گردید. ناقل ساخته شده با روش های مختلف تأیید گردید. مهندسی ژنتیک کاهو به یک روش موثر و قابل اتکا کشت بافت نیاز دارد. برای این منظور، عوامل مختلف موثر بر باززایی کوتیلدون های کاهو از قبیل ژنوتیپ، سن ریزنمونه و غلظت های مختلف تنظیم کننده های رشد بررسی شدند. بالاترین میزان کالوس زایی در غلظت 7/2 میکرو مولار naa و 4/4 میکرو مولار ba بدست آمد. بالاترین میزان نوساقه زایی در غلظت های کم ba اتفاق افتاد. شرایط بهینه ای برای تراریخته سازی از هم کشتی نمونه های کوتیلدونی با اگروباکتریوم در محیط ms بدون هیچ گونه هورمون رشدی به مدت 48 ساعت بدست آمد. بعد از مرحله هم کشتی، نمونه های کوتیلدونی روی محیط کشت انتخابگر حاوی هیگرومایسین و سفوتاکسیم کشت شدند. بعد از انتقال کوتیلدون ها به محیط انتخابگر و پس از چند بار واکشتی ریزنمونه ها، گیاهان کاهوی تراریخت بدست آمدند. با استفاده از آنالیز pcr و southern blotting، حضور قطعه t-dna حاوی ژن پروانسولین انسانی در ژنوم کاهو اثبات گردید و همچنین انجام rt-pcr نسخه برداری از روی این ژن را تأیید نمود. آنالیز گیاهان تراریخته در سطح پروتئین با بهره گیری از آزمون های elisa و ایمونوبلاتینگ وجود پروتئین در گیاهان تراریخت را تأیید کردند. در ادامه این پروژه انتقال ژن پروانسولین به هسته گیاه توتون و کلروپلاست آن انجام شده است که مراحل آنالیز گیاهان توتون تراریخت شده هسته ای و کلروپلاستی در حال انجام است.

گل رز به عنوان ملکه گل ها مشهور است. از قدیم در ایران، گل محمدی (rosa damascena mill.) به منظور تهیه گلاب و روغن های معطر مورد توجه بوده است. امروزه تولید گیاهان هاپلوئید با استفاده از روش های بیوتکنولوژی، به عنوان روشی سریع و کارآمد برای تولید لاین های خالص مورد توجه است. در این میان، آندروژنز به دلیل بالا بودن تعداد زیاد میکروسپورها در یک بساک، موثرترین روش به حساب می آید. در تحقیق حاضر اثر ترکیب محیط کشت بر کشت بساک در دو اکوتیپ گل محمدی و یک رقم رز مینیاتوری مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج پژوهش نشان داد که در اکوتیپ کاشان اثر متقابل محیط کشت h1 در مرحله تک هسته ای میانی بالاترین میزان کالوس زایی را داشت. همچنین آزمایش بررسی اثر نسبت نیترات آمونیوم به نیترات پتاسیم به روی رز ساناز نشان داد، تیمارهای حذف نیترات آمونیوم و دو برابر کردن نیترات پتاسیم کالوس‏زایی بالاتری داشتند. به علاوه، دو نمک کلرید کلسیم و نیترات کلسیم در رز ساناز از کالوس زایی بالاتری برخوردار بودند. در رز ساناز دو فرم fe- na2edta و fe- na2eddha به مقدار mg l- 85/27 بالاترین میزان کالوس را داشتند. اسیدهای آمینه نقش موثری بر صفت درصد کالوس‏زایی بساک ها نشان دادند و گلایسین، گلوتامین و کازئین هیدرولیزات از سایر اسیدهای آمینه بهتر بودند. همچنین بررسی ها نشان داد که ساکارز نسبت به سوربیتول قند مناسب تری جهت کالوس زایی بساک ها بود و با جایگزینی ساکارز توسط سوربیتول، میزان کالوس زایی کاهش یافت. نتایج شمارش کروموزومی و فلوسایتومتری نشان داد که سلول‏های کالوس های حاصله تتراپلوئید (28 عدد کروموزوم) هستند.

سیب زمینی از مهمترین محصولات غذایی انسانی است و از اهمیت اقتصادی ویژه ای برخوردار می باشد. به دلیل اهمیت این محصول، بهینه سازی سیستم کشت بافت و انتقال ژن به آن ضروری است. فراوانی انتقال ژن در سیب زمینی پایین و وابسته به باززایی درون شیشه ای و ژنوتیپ می باشد، بنابراین بهینه سازی کشت بافت سیب زمینی اولین گام برای انتقال ژن به آن است. در این تحقیق از دو رقم آگریا و مارفونا که از ارقام مهم زراعی سیب زمینی در ایران هستند، استفاده گردید. برای تعیین بهترین نوع ریزنمونه و محیط کشت گیاهی، میانگره و برگ گیاه استریل 5-4 هفته ای این دو رقم در محیط های یک و دو مرحله ای کشت شدند. در این محیط ها انواع مختلفی از اکسین ها و سیتوکینین ها مورد بررسی قرار گرفتند. واکنش ریزنمونه برگ و میانگره در این محیط ها بسیار متفاوت بود. ریزنمونه برگ تنها در محیط ms با سطوح مختلف هورمونی، باززایی کمی نشان داد. در حالی که ریزنمونه میانگره در بسیاری از محیط ها باززایی شد و دارای بیشترین درصد باززایی بود. بنابراین ریزنمونه میانگره رقم آگریا برای انتقال ژن tpa (tissue plasminogen activator) انتخاب شد. این ریزنمونه با اگروباکتریوم سویه lba4404 حاوی ناقل بیانی pbi121 محتوی ژن tpa آلوده شد. ریزنمونه های تلقیح شده، برای باززایی گیاه به محیط کشت انتخابی حاوی آنتی بیوتیک های کانامایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند. گیاهچه های باززایی شده بر سطح محیط کشت انتخابی، جداسازی و به محیط کشت ریشه زایی انتقال یافتند. در نهایت گیاهچه های ریشه دار شده به پرلایت استریل منتقل شده و پس از سازگار شدن به گلدان هایی با خاک مناسب منتقل شدند. بررسی مولکولی در سطح dna با استفاده از pcr و آغازگرهای اختصاصی ژن tpa، بر روی dna ژنومی استخراج شده از گیاهان باززایی شده صورت پذیرفت و تراریخت بودن آن ها تأئید گردید.

تولید پروتئین های دارویی و آنزیم های صنعتی ارزشمند از طریق مهندسی ژنتیک در گیاهان را زراعت مولکولی (molecular farming) می گویند. تقریباً 7/0% از جمعیّت جهان از بیماری دیابت وابسته به انسولین رنج می برند. انتظار می رود شیوع رو به افزایش بیماری دیابت، همراه با معرّفی شیوه های جایگزین روش های کنونی مصرف انسولین به افزایش میزان تقاضا برای این دارو در آینده منجر شود. انسولین نوترکیب انسانی تاکنون در موجودات مختلفی تولید شده است. اگر چه سیستم های تجاری طی دو دهه گذشته به میزان قابل ملاحظه ای بهبود یافته و به تولید حدود پنج تن هورمون انسولین در سال رسیده اند، ولی در آینده با مشکلات جدّی در زمینه میزان ظرفیّت تولید و مقدار تقاضا برای این دارو مواجه خواهیم بود. سیستم های گیاهی دارای پتانسیل های بالایی در تولید ایمن، اقتصادی و در مقیاس زیاد زیست داروها هستند. سیب زمینی یکی از مهم ترین بیورآکتورهاست. این گیاه هم چنین، گزینه بسیار مناسبی برای دستورزی های ژنتیکی است. باززایی سریع و موثّر اوّلین و مهم ترین نیاز پس از تراریخت سازی ریز نمونه هاست. با توجّه به وابستگی شدید میزان باززایی گیاه سیب زمینی به ژنوتیپ آن، بسیاری از شیوه های باززایی، برای تمامی ارقام مناسب نیست. لذا برای بررسی ارگانوژنز نابجا در گیاه سیب زمینی از محیط های کشت یک و دو مرحله ای استفاده شد و میان گره گیاهچه های سه تا چهار هفته ای ارقام دزیره، اگریا و مارفونا به عنوان ریز نمونه مورد استفاده قرار گرفت. در این مطالعه ژن پروانسولین انسانی به کمک روشagrobacterium tumefaciens به ژنوم هسته ای گیاه سیب زمینی (رقم دزیره) منتقل شد. گیاهچه های تراریخت، در محیط های کشت انتخابی حاوی آنتی بیوتیک های هیگرومایسین و سفوتاکسیم تفکیک و پس از ریشه زایی به خاک منتقل شدند. در نهایت گیاهان تراریخت به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز با کمک آغازگرهای اختصاصی تأیید شدند. هم چنین رونویسی و ترجمه ژن پروانسولین انسانی در این گیاهان به وسیله آزمون های rt-pcr، sds-page، elisa و dot-blot مورد تأیید قرار گرفت.

طالبی (cucumis melo l.) یکی از گونه های مهم و اقتصادی خانواده کدوئیان در ایران است. به منظور ارزیابی برخی صفات کمی و برآورد پارامتر های ژنتیکی و تعیین چگونگی کنترل ژنتیکی این صفات در طالبی از طرح تلاقی دی آلل استفاده گردید. هفت رقم محلی ایرانی با نام های ریش بابا، شاه آبادی، سمسوری، دستجردی، مگسی نیشابور، تیل طرق و ساوه ای در فروردین 1389 در یک طرح دی آلل کامل تلاقی داده شدند. در اردیبهشت 1390، ژنوتیپ ها (شامل 21 تلاقی مستقیم، 21 تلاقی معکوس و 7 والد) در قالب یک طرح لاتیس سه گانه کشت گردیدند و 15 صفت در آنها مورد ارزیابی قرار گرفت. ژنوتیپ ها در تمام صفات دارای اختلاف معنی دار بودند. تجزیه دی آلل به روش های griffing و jinks and hayman انجام گردید. ترکیب پذیری عمومی (gca) برای تمام صفات و نیز ترکیب پذیری خصوصی (sca) برای تمام صفات به جز عرض برگ، تعداد شاخه اصلی، فاصله تشکیل میوه، ضخامت پوست و مواد جامد محلول معنی دار بودند. والد ریش بابا دارای بیشترین میزان ترکیب پذیری عمومی برای صفات مهم و کلیدی از قبیل تعداد میوه، ضخامت گوشت و عملکرد بود. هتروزیس بر اساس والد برتر در مورد صفاتی از قبیل عملکرد، وزن میوه، طول میوه و عرض برگ مشاهده گردید. دورگ ریش بابا × ساوه ای بیشترین ترکیب پذیری خصوصی معنی دار را برای عملکرد و تعداد میوه داشت. میانگین درجه غالبیت در روش جینکز و هیمن نشان داد که صفات عرض میوه، ضخامت گوشت میوه، عرض حفره میوه، طول برگ، تعداد شاخه جانبی، روز تا رسیدگی و مواد جامد محلول میوه با اثر غالبیت نسبی ژن ها کنترل می گردند در حالی که طول میوه و عملکرد با فوق غالبیت ژن ها کنترل می شوند.

گیاهان به عنوان بیوراکتور جهت تولید انبوه و ارزان پروتئین های نوترکیب را می توان تحت عنوان زراعت ملکولی (molecular farming) معرفی نمود. از بخش های مختلف گیاهان به منظور تولید و دخیره سازی پروتئین های نوترکیب بهره جست که بذور گیاهان روغنی یکی از آنهاست. هدف گیری پروتئین های نوترکیب به اجسام روغنی در بذرها، باعث آسان تر شدن مراحل استخراج پروتئین های نوترکیب می شود، به همین دلیل می توان با استفاده از پیش برنده بذری و همچنین اتصال ژن مورد نظر به ژن اولئوسین گیاهی، باعث هدف گذاری صحیح پروتئین های نوترکیب به اجسام روغنی می شود. اینترفرون ها از جمله پروتئین هایی هستند که ارزش درمانی بسیار بالایی دارند. بنابراین، تولید اینترفرون از منابع دائمی، ایمن و ارزان حائز اهمیت ویژه است. در این تحقیق برای بیان اینترفرون گامای انسانی در بذر گیاه آفتابگردان (helianthus annuus l.) و قرارگیری آن در اجسام روغنی، از ناقل نوترکیب pbiifn?-oleosin استفاده شد. ژن اینترفرون گامای انسانی در پایین دست ژن اولئوسین همسانه سازی شده و بین دو ژن توالی برشی پروتئولایتیکی وجود دارد. این دو ژن تحت کنترل پیش برنده بذری napin)) هستند. ریزنمونه های کوتیلدونی گیاه آفتابگردان برای تراریخت سازی مورد استفاده قرار گرفتند. ژن هدف که با ژن اولئوسین فیوژ شده بود به کمکa. tumefaciens سویه lba4404 به گیاه آفتابگردان منتقل شد. گزینش گیاهان تراریخت نیز بر روی محیط حاوی mg l-1) 40) کانامایسسین صورت پذیرفت. برای باززایی گیاهان از محیط کشت ms همراه با هورمون ها و ترکیبات ضروری استفاده گردید. گیاهان گزینش شده به محیط طویل سازی و ریشه زایی جابجا و سپس به گلدان منتقل شدند. در نهایت آنالیز گیاهان تراریخت در سطح dna با روش pcr و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن هدف، بیانگر انتقال موفقیت آمیز ژن (ifn?) به گیاهان تراریخته بود.

دیابت بیماری است که در اثر آن بدن نمی تواند انسولین تولید و یا به طور موثر از آن استفاده کند. اگرچه انسولین نوترکیب به¬طور تجاری در باکتری و یا مخمر تولید می شود، ولی نیاز به توسعه سیستم های جایگزین برای تولید انسولین وجود دارد. استفاده از قارچ های خوراکی برای تولید داروهای زیستی، که با پیشرفت های اخیر در زمینه بیولوژی مولکولی امکان پذیر شده است، دارای تمام مزیت های سیستم های مبتنی بر گیاه (نظیر هزینه پائین تولید) به همراه ویژگی های منحصر به فرد قارچ ها می باشد. این ویژگی های منحصر به فرد از بیولوژی قارچ ها و ماهیت سیستم تولید آن ها نشأت می گیرد. برای این منظور ناقل دوتاییpcambctb-ins حاوی زیر واحد b سم وبا که به ژن پروانسولین انسانی الحاق شده بود، تحت کنترل پیشبرنده gpd ساخته شد و با استفاده از روش انتقال ژن مبتنی بر اگروباکتریوم به بافت ژیل قارچ صدفی (pleurotus ostreatus) منتقل گردید. شرایط تراریختی قارچ صدفی جدایه ایرانی (iran1649c) از جنبه های مختلفی نظیر سویه agrobacterium tumefaciens ، غلظت سوسپانسیون باکتری و دمای هم کشتی قارچ و باکتری بهینه سازی شد. پس از هم کشتی قارچ و باکتری، بافت های ژیل در محیط گزینشگر حاوی هیگرومایسین و سفوتاکسیم کشت شدند. اگروباکتریوم سویه gv3101 در غلظت 0/8(od600nm) و دمای °c25 در هم کشتی قارچ و باکتری بیشترین کارایی تراریختی (تقریبا 40%) را نشان داد. پس از تایید قارچ های تراریخت با استفاده از آزمون pcr با آغازگرهای اختصاصی، درج پایدار ژن ترکیبی ctb و پروانسولین در ژنوم قارچ صدفی با آزمون لکه گذاری سادرن تایید شد. بیان این ژن ترکیبی در سطح رونویسی و پروتئین با روش هایی نظیر rt-pcr، elisa و ایمونوبلاتینگ تایید شد و در میسلیوم قارچ های تراریخت میزان پروتئین ترکیبی ctb و پروانسولین انسانی 0/04% پروتئین محلول کل بود. با توجه به نتایج این تحقیق و بیان موفق ژن های خارجی در قارچ تراریخت، می¬توان به توسعه و تولید داروهای زیستی در قارچ های خوراکی امیدوار بود.

چکیده به تولید پروتئین های دارویی و صنعتی ارزشمند در گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک، کشاورزی مولکولی اطلاق می شود. از مزایای انتقال ژن به ژنوم کلروپلاست در مقایسه با ژنوم هسته می توان به سطح بالای بیان، امکان بیان چند ژن در یک اپرون پلی سیسترونی، نبود اثرات خاموشی ژن و احتمال بسیار اندک انتقال افقی ژن از طریق دانه گرده اشاره نمود. سالانه میلیون ها نفر در دنیا از عوارض ناشی از بیماری های قلبی و عروقی رنج می برند. یکی از مهم ترین داروهای حذف کننده لخته برای درمان این نوع از بیماری ها، پروتئین فعال کننده ی پلاسمینوژن بافتی (tpa) است. این آنزیم پروتئازی با تبدیل پلاسمینوژن به فرم فعال پلاسمین، موجب تجزیه رشته های فیبرین لخته می گردد. فرم کوتاه شده فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (k2s) دارای نیمه عمر پلاسمایی طولانی تر نسبت به tpa است. در تحقیق حاضر، ناقل کلروپلاستی مناسبی به کمک بررسی های بیوانفورماتیکی و با در نظر گرفتن توالی های مورد نظر مانند نواحی احاطه کننده ی اختصاصی گیاه کاهو و عناصر افزایش دهنده بیان در سطوح رونویسی و ترجمه، طراحی گردید. ناقل کلروپلاستی حاوی ژن ترکیبی plygbs::k2s، پس از همسانه سازی، از نظر ساختاری و عملکردی با استفاده از روش های مولکولی مورد تأیید قرار گرفت. به منظور انتقال ژن به کلروپلاست گیاه کاهو، سیستم کشت بافت و باززایی مستقیم نوساقه ها از سلول های تراریخت بهینه سازی شد. ناقل کلروپلاستی (pbl102) با استفاده از روش بمباران ذره ای به ریزنمونه های برگی منتقل گردید و ریزنمونه ها روی محیط گزینشگر حاوی آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین (یا استرپتومایسین) قرار گرفتند. پس از چند مرحله واکشت و باززایی، گیاهچه های تراریخت کلروپلاستی به صورت مستقیم از ریزنمونه ها باززایی شدند. نتایج ارزیابی گیاهان تراریخت کلروپلاستی در سطح dna نشان داد که ژن های انتقالی در جایگاه صحیح در ژنوم کلروپلاستی درج شده اند. همچنین، رونویسی از ژن plygbs::k2s به روش rt-pcr اثبات شد. بررسی بیان پروتئین به وسیله آزمون های sds-page، elisa، لکه گذاری نقطه ای و وسترن، تولید پروتئین نوترکیب plygbs-k2s را در کلروپلاست گیاهان کاهو تأیید نمود. کلمات کلیدی: مهندسی ژنوم پلاستیدی، ناقل کلروپلاستی، کشاورزی مولکولی، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی، گیاه کاهو

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

امروزه کشاورزی مولکولی و تولید گیاهان تراریخته، باعث شده است که از گیاهان برای درمان بیماری هایی استفاده شود که تا پیش از این به وسیله داروهای شیمیایی یا مواد زیستی بدست آمده از حیوانات یا میکروارگانیسم ها درمان می شدند. از این رو گیاهان تراریخته می توانند به عنوان بیوراکتور جایگزین مناسبی برای سیستم های رایج بیان کننده پروتئین های نوترکیب باشند. یکی از داروهای مهم برای سکته های قلبی و مغزی، پروتئین نوترکیب t-pa (اسم تجاری اکتیواز یا آلتپلاز ) است که به دلیل کمیاب بودن و قیمت بالا در دسترس عموم بیماران نیست. به همین علت اهمیت تولید آن در کشور فوق العاده زیاد احساس می شود. در این تحقیق گیاهان توتون تراریخت تولید شده توسط گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس، به منظور استخراج و تخلیص پروتئین t-pa کشت داده شد. جهت بررسی بیان ژن در گیاهان تراریخت و اطمینان از تراریخت بودن آنها، از روش های مقاومت به آنتی بیوتیک، pcr و rt-pcr استفاده شد. با کشت بذر روی محیط کشت ms حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین فقط گیاهان تراریخت قادر به جوانه زنی شدند. همچنین در روش های pcr و rt-pcr تکثیر ژن t-pa با آغازگر اختصاصی نشان داد که فقط گیاهان تراریخت در مقایسه با شاهد، باند تکثیر شده مربوطه(1.7kb) را نشان دادند. همچنین در مرحله رونویسی مشخص شد که یک باند اضافی (650bp) تکثیر می شود که بعد از توالی یابی و جستجوی توالی های همپوشان مشخص شد که همان cdna ژن t-pa می باشد فقط توالی دامنه های کرینگلی t-pa از آن حذف شده است. بعد از تایید تراریخت بودن و بیان ژن در گیاهان، به کمک روشهای کروماتوگرافی تمایلی لیزین سفارز و فیلتراسیون ژلی اقدام به تخلیص t-pa نوترکیب انسانی گردید و با الکتروفورز ژل sds خالص بودن t-pa و به کمک آزمون زیموگرافی فعال بودن این پروتئین نشان داده شد.

مخمرها و در راس آن ها گونه های کاندیدا، معمول ترین قارچ هایی هستند که از عفونت های انسانی جدا می شوند. در سال های اخیر علیرغم پیشرفت در مراقبت های بهداشتی و روش های درمانی، وقوع کاندیدیازیس سیستمیک مهاجم، به طور قابل توجهی افزایش یافته است. افزایش بروز در نتیجه افزایش جمعیت در معرض خطر شامل دریافت کنندگان پیوند، بیماران سرطانی، مبتلایان به ایدز، دریافت کنندگان داروهای تضعیف کننده سیستم ایمنی و آنتی بیوتیک های وسیع الطیف می باشد. اگرچه گونه آلبیکانس، عامل معمول کاندیدیازیس می باشد، وقوع بیماری با دیگر گونه ها که حساسیت کمتری به مشتقات آزول ها دارند با افزایش فراوانی گزارش شده است. لذا شناسایی سریع گونه عامل بیماری، جهت درمان به موقع ضروری است. روش های فنوتیپی رایج برای شناسایی گونه ها نظیر آزمایش های مرفولوژی و روش های بیوشیمیایی، زمان بر بوده و نتایج حاصل از آنها همواره دقیق نیستند. تکنیک های مولکولی مبتنی بر dna، رویکردهای جدید و موثری را برای حل این مشکل فراهم آورده اند. از این رو در مطالعه حاضر کارایی روش مولکولی rapd-pcr در شناسایی و ارزیابی تنوع ژنتیکی 7 استرین استاندارد کاندیدا و 33 سویه بالینی مورد بررسی قرار گرفت. از روش فنوتیپیک کروم آگار کاندیدا به منظور شناسایی اولیه و از روش مولکولی rflp نیز جهت شناسایی قطعی سویه ها استفاده شد. dna نمونه ها استخراج گردید و واکنش pcr با استفاده از 4 آغازگر rapd انجام شد. در بررسی الگوی باندهای حاصل از rapd استرین های استاندارد مشخص گردید که هر گونه، الگوی متمایزی را از سایر گونه ها ایجاد می کند و می توان از باندهای اختصاصی گونه ها به عنوان ابزاری در شناسایی مستقیم سویه های بالینی مجهول، بدون نیاز به انجام روش های فنوتیپیک و آزمایشات بیوشیمیایی استفاده کرد. به همین منظور وزن مولکولی باندهای اختصاصی استرین های استاندارد با استفاده از نرم افزار uvi doc محاسبه گردید. به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی سویه های مورد مطالعه نیز، باندهای حاصل از rapd سویه ها، به داده های صفر و یک تبدیل شد و تجزیه خوشه ای داده ها به روش upgma و با استفاده از نرم افزار mvsp انجام گرفت. بررسی دندروگرام های حاصل از تجزیه خوشه ای داده ها، فاصله ژنتیکی میان سویه ها را نشان داد. نتایج مطالعه حاضر توانایی روش مولکولی rapd-pcr را در شناسایی گونه های کاندیدا نشان داد. همچنین آغازگرهای ap3 و t3b به دلیل ایجاد بهترین الگوی باندهای اختصاصی برای گونه ها، جهت شناسایی مستقیم سویه ها، به خصوص شناسایی و افتراق گونه های آلبیکانس و دابلی نینسیس که به لحاظ فنوتیپیک بسیار مشابهند، مناسب می باشند و آغازگرهای opa-18 و ope-18 به دلیل ایجاد بیشترین میزان چند شکلی، در ارزیابی تنوع ژنتیکی مفید بوده و امکان شناسایی استرین های بیشتری را فراهم می کنند. در مجموع استفاده از تکنیک rapd-pcr، به عنوان روشی سریع و ارزان در شناسایی گونه های کاندیدا و همچنین شناسایی استرین ها در مطالعات اپیدمیولوژی مولکولی پیشنهاد گردید.

" کشاورزی مولکولی" به تولید پروتئین های دارویی و آنزیم های صنعتی ارزشمند در گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک اطلاق می شود. آنزیم لوسیفراز حشره شبتاب یکی از مهمترین آنزیم های صنعتی است که به طور وسیعی در زمینه های مختلف بیوتکنولوژی و بیولوژی سلولی و مولکولی بویژه در تشخیص میزان atp به منظور تشخیص آلودگی های میکروبی، تهیه کیت های تشخیص سرطان، غربالگری داروها، زیست حسگرها، همچنین در بررسی روابط برهمکنشی و تاخوردگی پروتئین ها، سنجش های آنزیمی و توالی یابی dna (pyrosequencing) استفاده می شود. ژن لوسیفراز نیز به عنوان ژن گزارشگر ایده آل در مهندسی ژنتیک به منظور بهینه سازی سیستم انتقال ژن، کاربرد فراوان دارد. تحقیق حاضر جهت انتقال ژن لوسیفراز حشره شبتاب گونه ایرانی lampyris turkestanicus و تولید آن در گیاه توتون انجام گرفت. در این تحقیق، ژن لوسیفراز حشره شبتاب (luc) به کمک باکتریagrobacterium tumefaciens سوش lba4404 به گیاه توتون کولتیوار xanthi منتقل شد. آغازگرهای مناسب با توجه به توالی های انتهای َ3 و َ5 ژن لوسیفراز، محل های برشی ncoi و bsteii و توالی افزایش دهنده سیستم بیان گیاهی (kozak sequence) طراحی شدند. ژن مورد نظر به کمک pcr با آغازگرهای اختصاصی جداسازی و پس از عملیات هضم آنزیمی و اتصال (ligation)، در ناقل بیانی pcambia1304 همسانه سازی شد. به منظور اطمینان از همسانه سازی ژن مذکور، سازه تهیه شده با استفاده از تکنیک های مختلف مانند colony pcr، pcr ، هضم آنزیمی، توالی یابی و همردیف سازی آن در بانک اطلاعاتی (genbank)، مورد تایید قرار گرفت. سپس سازه تهیه شده توسط روش ذوب و انجماد به باکتری آگروباکتریوم منتقل شد. جهت آلوده سازی گیاهان توتون، از ریزنمونه های برگی استفاده شد. ریزنمونه¬های تلقیح شده توسط آگروباکتریوم، به محیط های کشت انتخابی حاوی آنتی بیوتیک های هیگرومایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند. گیاهچه¬¬¬¬¬¬های باززایی شده بر روی محیط کشت انتخابی، جداسازی و به محیط کشت ریشه زایی انتقال یافتند. گیاهچه ها پس از ریشه دار شدن، ابتدا به گلدان حاوی پرلایت و در نهایت به خاک منتقل شدند. بررسی مولکولی pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی¬، بر روی dna ژنومی استخراج شده از گیاهان باززایی شده، تراریخت بودن آنها را تایید نمود. از گیاهان شاهد غیرتراریخت به عنوان کنترل منفی pcr استفاده گردید.

ایران دارای غنی ترین ذخایر ژنتیکی پسته در جهان می باشد و به این سبب تنوع و تعداد ارقام پسته ایران در جهان بی نظیر است. این درخت دارای ارقام بسیاری در کشور است بطوریکه بعضی از ارقام در مناطق مختلف با اسامی متفاوت نامیده می شوند و این در حالی است که روابط ژنتیکی بین آنها بدرستی مشخص نمی باشد. اولین گام در زمینه بهنژادی پسته دستیابی به منابع ژنتیکی آن، بررسی تنوع ژنتیکی و روابط ژنتیکی بین ارقام می باشد. مطالعاتی که تاکنون در زمینه پسته انجام شده بیشتر بر اساس صفات مورفولوژیک یا آیزوزایمی بوده است و از نشانگرهای dna تنها نشانگر rapd و aflp برای بررسی روابط ژنتیکی تعدادی از ارقام پسته استفاده شده است. بنابراین در این پژوهش روابط ژنتیکی بین 31 رقم پسته با استفاده از 4 جفت آغازگر اختصاصی ریز ماهواره (ssr)، 10 آغازگر تصادفی rapd و 3 آغازگر issr مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از10 آغازگر انتخاب شده rapd تعداد 84 باند قابل امتیاز دهی با میانگین 8/4 تولید شد بطوریکه 59/52% از آنها چند شکل بودند. با استفاده از نشانگر issr تعداد 28 باند با میانگین 9/3 تولید شد بطوریکه 46/42% از آنها چند شکل بودند. الگوهای انفرادی حاصل از تجزیه ی خوشه ای بر اساس ضریب تشابه دایس (dice) و الگوریتمupgma در هر 3 سیستم نشانگر در مقایسه با همدیگر تا حدی متفاوت بودند، بنابراین ژنوتیپ های مورد مطالعه در گروه های متفاوتی بسته به نوع نشانگر به کار رفته قرار گرفتند. دندروگرام upgma عمومی که با استفاده از داده های ترکیبی هر سه مجموعه نشانگر ساخته شد تا حدی مشابه با دندروگرامهای بدست آمده با هر کدام از نشانگرها در حالت انفرادی بود. تجزیه به مختصات اصلی (pca) عمومی بر اساس ماتریسهای تشابه ژنتیکی نشان داد که سه مولفه اول 28/46% از کل تنوع ژنتیکی را توجیه می کنند، بنابراین نتایج حاصل از تجزیه به مختصات اصلی، نتایج تحزیه خوشه ای را توجیه می کند. در مجموع چهار آغازگر ssr 11 آلل را درمیان 31 ژنوتیپ پسته با میانگین 75/2 تولید کردند و در تمام جایگاه ها 100% چند شکلی مشاهده شد. پایین بودن میانگین محتوای اطلاعات چند شکل (0/4374) نشان داد که تشابه ژنتیکی بالایی میان ژنوتیپ ها وجود دارد و بنابراین به آغازگرهای ssr چند شکل بیشتری نیاز می باشد. نتایج بدست آمده نشان داد که دو جایگاه 42ptms و 41ptms دارای انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ می باشند. مطالعه شاخص اطلاعات شانون و معیار pic (محتوای چندشکلی) نیز نشان داد که جایگاه 14ptms دارای بیشترین تنوع و جایگاه 42ptms دارای کمترین تنوع در بین جایگاه های مورد مطالعه می باشد. نتایج بدست آمده نشان داد که هرسه سیستم نشانگر توانایی تعیین هویت وآشکارسازی تنوع را در بین ارقام پسته دارا می باشند. بر طبق شاخص نسبت چند گانه موثر (emr) و شاخص راندمان ارزیابی (aei)، معلوم گردید که در پژوهش فعلی نشانگرrapd قدرتمندترین نشانگر در تمایر ژنوتیپ ها بود و به دنبال آن به ترتیب نشانگرهای issr و ssr قرار داشتند. نشانگرهای issr و ssr به دلیل تولید باندهایی با تکرار پذیری بیشتر معتبرترند و نشانگر rapd بر issr ترجیح داده می شود.

در دسترس بودن پروتئینهای انسانی نوترکیب باعث تحولی در استفاده از پروتئینهای ارزشمند از نظر دارویی در پزشکی بالینی شده است. گیاهان به عنوان سیستم های موفق در تولید پروتئین های نوترکیب شناخته شده اند که در میان آنها علاوه بر توتون، گیاه کلزا نیز انتخاب مناسبی جهت تولید پروتئین های نوترکیب می باشد. اینترفرون ها از جمله پروتئین هایی هستند که ارزش درمانی بالایی دارند. مطالعات پزشکی نشان می دهد که اینترفرون می تواند تا حدودی به عنوان دارو برای آلودگی های ویروسی، سرطان و بیماری های خود ایمن مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین، علاقه شدیدی برای تولید اینترفرون از منابع دائمی، ایمن و ارزان حائز اهمیت است. در این تحقیق ژن اینترفرون گامای انسانی که تحت پروموتر napin در پلاسمید pbi121 کلون شده بود به اگروباکتریوم سویه lba4404 منتقل گردید و به وسیله colony pcr با آغازگرهای اختصاصی تأیید شد. سپس پلاسمید نو ترکیب شامل ژن اینترفرون گامای انسانی به کمک اگروباکتریوم به گیاه کلزا منتقل گردید. ریزنمونه های کوتیلدونی از گیاه کلزا کولتیوار pf4570/91 برای تراریخت سازی مورد استفاده قرار گرفت و تعداد 15 گیاه تراریخت به دست آمد. گیاهان تراریخت بر روی محیط ms حاوی mg/l25 آنتی بیوتیک کانامایسین انتخاب شدند. آنالیز مولکولی گیاهان تراریخت وجود ژن اینترفرون گامای انسانی را در گیاهان تراریخت تأیید نمود. بیان پروتئین نوترکیب در بذر از این نظر جالب توجه است که تجمع پروتئین در غلظت نسبتاً بالا و به صورت پایدار در حجم فشرده و متراکم امکان پذیر است که برای استخراج و تخلیص بسیار مناسب می باشد. برای بیان اینترفرون گامای انسانی در بذر گیاه کلزا در این تحقیق از آغازگر اختصاصی بذر napin استفاده شد. تولید پروتئین اینترفرون گاما و تجمع آن در بذر گیاهان تراریخت به کمک تکنیک sds-page تأیید گردید.

کلزا یکی از مطرح ترین گیاهان زراعی از لحاظ کمیت و کیفیت روغن در سطح جهان می باشد و کشت آن نیز در ایران رو به گسترش است. با توجه به 93% واردات روغن به کشورمان، در این پروژه برای اولین بار در ایران، در دانشگاه تربیت مدرس، به اصلاح این گیاه مهم روغنی از طریق مهندسی ژنتیک (انتقال ژن)، مبادرت نمودیم. بمنظور صرفه جویی در زمان و هزینه، قبل از انتقال ژن، به بهینه سازی درصد باززایی ارقام کلزایی که از طریق بخش دانه های روغنی در سال 1379 بعنوان ارقانم برتر معرفی گردید، پرداختیم ‏‎(pf,nsa,global,hyola 308, maluka‎). در قسمت اول تحقیق، بهترین رقم ‏‎global‎‏ و بهترین محیط کشت ‏‎sim‎‏ مشخص گردید. در قسمت دوم تحقیق، با انتقال ژن گزارشگر ‏‎gus‎‏، بمنظور بررسی روش انتقال ژن، دو نژاد آگروباکتریوم ‏‎c58(pgv3103)‎‏ و ‏‎lba4404‎‏ و دو پلاسمید مختلف حاوی ژن ‏‎pbi121, pvw432, gus‎‏ بررسی گردید. با تجزیه و تحلیل آماری (نرم افزار ‏‎mstatc‎‏)، اثر متقابل پلاسمید آگروباکتریوم اختلاف معنی داری را نشان داد. پس از تجزیه و تحلیل اضافی، پلاسمید ‏‎pvw432‎‏ و آگروباکتریوم ‏‎c58(pgv1303)‎‏، با 5/12% باززایی (گیاه تراریخت) مشخص گردید. از جمله اهداف دیگر این پروژه، آزمون آنتی بیوتیک مختلف با مقادیر متفاوت جهت کنترل آگروباکتریوم، بعد از آلوده سازی ریزنمونه ها بوده آنتی بیوتیک سفاتوکسیم و وانکومایسین به ترتیب (‏‎200mg i‎‏ و ‏‎50 mgi‎‏) بعنوان بهترین ترکیب مشخص گردید. نتایج حاصل از این رساله را می توان بعنوان یک سیستم جامع به منظور انتقال سایر ژنهای مطلوب (مقاومت به علف کش و بیماریها و ...) استفاده نمود و باززایی گیاه کامل از سلولهای تراریخت، کاملا مشابه با ژن گزارشگر ‏‎gus‎‏ می باشد.