کلستریدیوم پرفرنژنس ، باکتری گرم مثبت و بی هوازی است که بر اساس تولید توکسینهای کشنده اصلی به پنج تیپ از a تا e تقسیم می شود چهار نوع توکسینهای اصلی و عمده شامل توکسینهای آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا می باشند. توکسین بتا، توکسین اصلی کشنده است که توسط تیپ های c,b کلستریدیوم پرفرنژنس تولید می شود این توکسین یک زنجیره پلی پیتیدی با وزن مولکولی ه حدود 40کیلو دالتون است که به تریپسین بسیار حساس بوده و نقش اصلی در نکروتیک انتریت در انسانها و حیوانات را ایفا می کند. در این تحقیق روش شناسایی مولکولی جدایه های کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ b کلستریدیوم پرفرنژنس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و آزمایش زنجیره ای پلیمراز pcr))راه اندازی شد. با استفاده از آزمایش pcr قطعات 900و611و504 برای ژنهای آلفا، بتا، اپسیلون بدست آمد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی جدایه های تایپ b از نظر ژن مولدتوکسین بتا(cpb) قطعه مذکور به منظور تعیین توالی به شرکت biosience applied فرانسه ارسال گردید. پس از تعیین توالی نوکلئوتیدی ژن توکسین بتا.با نرم افزار megalian مرتب و مورد مقایسه قرار گرفتند.. در مقایسه با توالی نوکلئوتیدی ژن توکسین بتا نمونه رفرانس( cpbe) نمونه ایزوله شده cpbjدر نوکلئوتید 95 ، به جای باز گوانین دارای باز تیمین.ودر نوکلئوتید 241 در نمونه های ایزوله cpbl و cpbo به جای باز آدنین ، باز گوانین قرار گرفته است . در مقایسه با توالی آمینو اسیدی ژن توکسین بتا نمونه رفرانس با جدایه ها ، ایزوله cpbj اسید آمینه والین در موقعیت 32 توالی آمینو اسیدی جایگزین گلوتامین و ایزوله cpbl و cpbo در موقعیت 81 توالی آمینو اسیدی ، اسید آمینه والین جایگزین ایزولوسین شده است .در موقعیت 193 توالی آمینو اسیدی سروتایپ های ایسلند ـ هند ـ آمریکا ، آمینو اسید میتونین جایگزین ایزولوسین شده است که در نمونه رفرانس( cpbe) واطلاعات موجود در ژن بانک در موقعیت 193 توالی آمینو اسیدی ایزولوسین وجود دارد. بنابراین بر اساس نتایج حاصله آنالیز فیلوژنی و توالی یابی ، کمترین شباهت (3 .99 درصد ) مربوط به ایزوله cpbo و بیشترین شباهت 100 % با ایزوله های cpbk , cpbn , cpbm می باشد .

کلستریدیوم پرفرنجنس یک باکتری بیهوازی ،گرم مثبت ، هاگدار است. کلستریدیوم پرفرنجنس یک عامل مهم بیماری روده ای در انسانها و حیوانات خانگی است. این باکتری توکسین های مختلفی تولید می کند که بر اساس تولید توکسین های ? ،? ،? ، ? به پنج بیوتایپ a-e تقسیم بندی می شود . توکسین ?2 در تعیین تیپ ژنتیکی کلستریدیوم پرفرنجنس نقشی ندارد ولی به دلیل پاتوژن بودن آن دارای اهمیت زیادی است . برای شناسایی جدایه های ?2 مثبت کلستریدیوم پرفرنجنس در تیپهای a-d در ایران ، در موسسه واکسن و سرم سازی رازی کرج ، با استفاده از59 نمونه موجود در کلکسیون میکروبی بخش بیهوازی از طریق روش مولکولی pcr سیسنمی راه اندازی شد . ابتدا شرایط pcr برای تکثیر قطعه bp 566 از ژن ?2 بهینه سازی شد و با این روش وجود یا عدم وجود ژن ?2 در مجموع نمونه های موجود مورد ارزیابی قرار گرفت .نتایج نشان داد که فراوانی این توکسین در تیپهای مختلف کلستریدیوم پرفرنجنس که برای اولین بار در ایران گزارش می شود به این شرح بود: تیپ a ( 11 نمونه ) : 5/54 % ، تیپ b : 21 نمونه ) : 62% ، تیپ c ( 14 نمونه ) : 8/42 % ، تیپ d ( 13 نمونه ) : 2/69% بوده است . بیش از نیمی از نمونه های کلستریدیوم پرفرنجنس موجود ایرانی دارای ژن کد کننده توکسین ?2 بودند ، توالی یابی این ژن درتعدادی از سویه های مثبت به منظور تائید نتایج حاصل از pcr ونیز بررسی پلی مورفیسم موجود در ژن انجام شد. آنالیز توالی های بدست آمده نشان دهنده حضور پلی مورفیسم قابل توجه در بین جدایه ها بود. با توجه به فراوانی بالای ژن ?2 در جدایه های مطالعه شده انجام مطالعات تکمیلی روی توکسین مذکور بعنوان یکی از عوامل ویرولانس پیشنهاد می شود.

در این تحقیق شناسائی اپیتوپ های غالب تحریک کننده سیستم ایمنی اختصاصی سلول های t و بواسطه آن طراحی کاست ژنی وابسته به پنج پروتئین اکینوکوکوس گرانولوزوس شامل eggst, ega31, eg95, egtrp, p14-3-3 و بررسی پاسخ ایمنی آن انجام گرفت. اپیتوپ ها با نرم افزار های propred و iedbبا بهترین قدرت اتصال به مولکول های mhc پیش بینی شدند. پس از سنتز dna، قطعه مورد نظر داخل وکتور بیانی pet41a+ کلون شد به منظور فهم بهتر اثر تجمعی اپیتوپها قطعه دربرگیرنده اپیتوپ های آنتی ژن ega31 با pcr تکثیر وجداگانه در دو وکتورpgex4t1 وpegfp-n1 کلون شد. پروتئینهای کایمریک در سلولe. coli فیوژن با gst بیان شدند. بیان gfp-chega31 در سلول های cho با فلورسنت میکروسکوپی و rt-pcr تائید شد. بیان پروتئینهای کایمریک با وسترن بلاتینگ تائید شد، سپس با روش افینیتی خالص سازی و به موش های c57bl/6 همراه با اجوانت فروند تزریق شدند. سلول های splenocyte طحال به مدت 72 ساعت در محیط dmem در حضور آنتی ژن، کشت داده شدند. نتایج الایزا نشان داد کهifn-? در سلول های طحال موشهای ایمن شده با آنتی ژن gst-chegmea حدودا 1300 پیکوگرم و در گروه gst-chega31 حدودا 634-1300 پیکوگرم و در گروه gfp-chega31 نیز 1300پیکوگرم در میلی لیتر بیان شد، که نشان داد پروتئین کایمریک چند اپیتوپی بخوبی سیستم ایمنی سلولی را تحریک کرده است. از طرفی افزایشی در میزان il4, il10مشاهده نشد. موشهای ایمن شده، با تعداد پانصد پروتواسکولکس زنده چالنج شدند که بعد از سه ماه کیست ها شمارش شدند. مشاهدات نشان داد که آنتی ژن gst-chega31 50% و در گروه تزریق شده با pegfp-chega31 حدودا 60 % مصونیت ایجاد نمودند، در حالیکه آنتی ژن کایمریک gst-chmeaمصونیت 6/99-100% علیه پروتواسکولکس ایجاد نمود. نتایج گواه این مطلب است که پیش بینی اپیتوپ ها بر اساس متد بیوانفورماتیک جهت طراحی آنتی ژن بر علیه اکینوکوکوس گرانولوزوس مفید بوده است

اکینوکوکوس گرانولوزوس انگلی است که آلودگی با مرحله لاروی آن سبب ایجاد بیماری هیداتیدوزیس در انسان و نشخوارکنندگان می شود؛ تاکنون نزدیک به ده ژنوتیپ از این انگل شناسایی شده است. کشور ایران جزء مناطق با شیوع بالا است، بر این اساس مقابله با این انگل از لحاظ بهداشت جامعه اهمیت خاصی دارد. آنتی ژن های متفاوتی در مراحل مختلف زندگی این انگل بیان می شود، که یکی از آنها تروپومیوزین است. مطالعات پیشین نشان داده که پروتئین نوترکیب ساخته شده بر پایه تروپومیوزین در میزبان اصلی ایمنی قابل توجهی ایجاد کرده است لذا این آنتی ژن می تواند بعنوان یک کاندید مناسب جهت ساخت dna واکسن مورد بررسی قرار گیرد. هدف از این پژوهش پیش بینی و کلون کردن توالی کد کننده اپی توپ های خطی آنتی ژن egtrp گونه اکینوکوکوس گرانولوزوس برای لنفوسیت های t در وکتور pegfp-n1 بود. در این پژوهش اپی توپ های تحریک کننده سیستم ایمنی سلولی میزبان با نرم افزار های بیوانفورماتیک شناسائی و بعد از بهینه سازی کدون ها توالی کد کننده آن سنتز شده و محصول pcr پس از هضم آنزیمی با آنزیم محدود کننده xhoi در وکتور pegfp-n1 کلون گردید، کلنی های مثبت بوسیله pcr colony انتخاب شدند. وکتور های نوترکیب بوسیله ی شوک الکتریکی به سلول های cho ترانسفورم شدند، و بیان پروتئین مورد نظر به صورت فیوژن با پروتئین سبز فلئورسنت توسط میکروسکوپ فلئورسنت مورد بررسی قرار گرفت

در این پروژه به منظور طراحی و ساخت یک dna واکسن موثر علیه کیست هیداتیک با حداقل ساختار ممکن و حداکثر قدرت تحریک ایمنی از توالی کدکننده اپی توپ های خطی آنتی ژن p14-3-3 که ایمونوژن تر می باشد و در اکثر مراحل زندگی انگل و سروتیپ های متعدد با ساختار حفاظت شده وجود داشته و واکسن نوترکیب آن نیز پاسخ ایمنی چشمگیری را علیه کیست هیداتیک نشان داده، جهت کلونینگ در وکتور بیانی pegfp-n1 به جای توالی کدکننده آنتی ژن موردنظر استفاده شد؛ که بررسی بیان آن در سلول های یوکاریوتی choحاکی از بیان پروتئین موردنظر به همراه پروتئین سبز فلورسنت در این سلول ها می باشد.