تا کنون 60 میلیون نفر با hiv آلوده شده اند که نزدیک به 22 میلیون نفر از آنها جان خود را از دست داده اند. هزینه درمانی هر فرد مبتلا به ایدز سالانه در حدود 20000 دلار می باشد. داروهای ضد رتروویروسی کنونی به طور کامل نمی توانند افراد آلوده به ویروس را پاکسازی نمایند و نیز با مصرف دارو، واریانتهای مقاوم به دارو تولید می گردد. این مسائل نشان می دهد، استفاده از یک واکسن پیشگیری کننده ایمن و موثر شدیدا"مورد نیاز است. رایج ترین و معمولترین استراتژی برای واکسن ایدز استفاده از زیرواحدهای ویروسی به عنوان ایمونوژنهاست. یکی از واکسنهای زیر واحدی که برای hiv طراحی شده واکسنهای پلاسمید dna است. مطالعات زیادی نشان داده اند؛ یک واکسن پیشگیری کننده موثر و ایمن برای hiv، می بایست به میزان زیادی آنتی بادی های خنثی کننده و پاسخ های ایمنی سلولی را افزایش دهد که همه این اهداف، با واکسن های dna قابل دسترسی است و از این حیث مشابه واکسنهای زنده عمل می کنند، بدون آن که بیماریزا باشند. دو پروتئین p24 و gp41 ، نقشهای مهمی را در پاتوژنز hiv ایفاء می نمایند و ایمنی علیه آنها نیز در روند بیماری موثر است، بی شک مطالعه و تحقیق بر روی این قطعات در ساخت واکسن علیه hiv بسیار ارزشمند خواهدبود. در این مطالعه، دو پلاسمید نوترکیب pcdna3.1/hygro (پلاسمید فاقد توالی سیگنال) و psectag2/hygro (پلاسمید واجد توالی سیگنال) حاوی توالی های ایمنوژنیک gp41- p24 و پلاسمید pcdna3.1/hygro حاوی یکی از قطعات فیوز شده فوق(gp41 ) به عنوان کنترل طراحی و بیان پروتیین های مربوطه در آن ها، با روش ایمنوفلوئورسنس تایید شد. پاسخ های ایمنی موثرعلیه پلاسمیدهای نوترکیب فوق به عنوان کاندید واکسن dna در موشهایbalb/c، ارزیابی گردید.میزان آنتی بادی و سیتوکین های ifn-? و il-4 و ایزوتاپ های igg (igg1 و igg2a ) با روش الیزا و تقسیم سلولی لنفوسیتی نیز با روشmtt سنجش شد. تمام آزمایشات مذکور در هر دو زمان قبل و بعد از تزریق دوز بوستر انجام شد. برای تهیه قطعات فیوز شده p24-gp41، ابتدا برای نواحی ایمنوژنیک ژنهای p24 و gp41 از hiv-1، پرایمرهای اختصاصی طراحی و توسط روش pcr، قطعات مورد نظرجدا و تکثیر شدند. در مرحله بعد این قطعات، با استفاده از تکنیک soe به هم فیوز شدند. در همه گروههای حیوانات مورد مطالعه، از دندروزوم به عنوان سیستم انتقال پلاسمیدهای مورد نظر استفاده شد. به منظوربررسی میزان افزایش و هدایت پاسخ ایمنی، به یکی از گروههای مورد مطالعه، پلاسمید نوترکیب و ادجوانت ژنتیکی(pcaggs-il-12 ) بطور همزمان تزریق شد. با توجه به نتایج آزمایش های این پژوهش، از طرفی ایمن زایی و هم افزایی عملکرد این دو قطعه(p24-gp41 ) در کنار هم،که پیش فرض این مطالعه نیز بوده، تائید شد و از طرفی، نشان داده شد که این قطعات، توانایی بر انگیختن هر دو سیستم ایمنی با تمایلی به ایمنی سلولی (th1) را دارند و با توجه به این حقیقت که جهت جلوگیری و محدود کردن عفونت ناشی از hiv هر دو بازوی سیستم ایمنی، همورال و سلولی، موثر هستند اما در این میان ایمنی سلولی(th1) از اهمیت بالایی برخوردار است، بنابراین می توان گفت که کانستراکت های مورد استفاده در این تحقیق، می توانند کاندیدهای خوبی برای واکسن dna علیه hiv-1 باشند، بنابراین می توان با اطمینان بیشتری به بررسی های تکمیلی این قطعات پرداخت تا بتوان آنها را به عنوان واکسن dna در حوزه بالینی، بهینه سازی نمود.از طرفی تجزیه و تحلیل نتایج حاصل از آزمایشات، نشان داد که با استفاده از هر دو نوع پلاسمید(فاقد توالی سیگنال و واجد توالی سیگنال) پاسخ های ایمنی مناسبی ایجاد می گردد اما به نظر میرسد به علت اختلاف معنی داری (0.05 p< ) که در تولید il-4 و آنتی بادی کل در وکتور حاوی سیگنال ترشحی مشاهده می شود، استفاده از این نوع وکتور در واکسن dna مناسب تر باشد. هر چند برای تایید نهایی، به نتایج حاصل از آزمایشات تکمیلی نیاز می باشد.

ویروس آنفلوآنزا یکی از مهمترین عوامل عفونی ایجاد کننده مرگ ومیر در سراسر جهان است. واکسن تجاری آنفلوانزا که به طور سالیانه بر اساس ویروس غالب در گردش طراحی می شود تنها قادر به ایجاد حفاظت نسبی در بالغین سالم است. از این رو، ما به واکسن کارامدتری نیاز داریم که به تغییر هر ساله نیاز نداشته باشد. ژن نوکلئو پروتئین (np) ویروس آنفلوآنزا به دلیل جهش پایین در بین اعضای یک نوع از ویروس های آنفلوانزا مشترک است. لذا پس از پیدایش آنفلوانزای مرغی h5n1 توجه ویژه ای به دستیابی یک واکسن کارا برضد ویروس نوع a آنفلوانزا بر اساس این ژن مبذول شده است. در این تحقیق با استفاده از ناقل بیانی اینترلوکین 12 و نالوکسان افزایش کارایی ناقل بیانی واجد ژن نوکلوپروتینی ویروس آنفلوانزا را در این مدل بررسی قرار گر فت. همچنین با توجه به اهمیت عفونت آنفلوانزا در بیماران دیابتی کارایی این نوع از واکسن را در این جمعیت در یک مدل موشی مورد بررسی شد. نتایج به دست آمده از این پژوهش نشان داد که ناقل بیانی حاوی ژن np به طور معنا داری نسبت به گروه های شاهد منفی منجر به القای پاسخ ایمنی سلولی هم بر علبه سویه مورد استفاده در طراحی واکسن (h1n1) و هم برعلیه سویه h3n2 در موش های عادی می شود. همچنین کاربرد ادجوانت های نالوکسان و il-12 به همراه واکسن ژنی np منجر به تقویت پاسخ های ایمنی سلولی گردید. علاوه براین، نشان داده شد کاربرد واکسن غیرفعال آنفلوانزا نیز منجر به القای پاسخ های ایمنی سلولی متقاطه بر ضد سویه های نوع a ویروس آنفلوانزا می گردد. در این پژوهش علاوه بر مدل عادی، کارایی واکسن ژنی و واکسن مبتنی بر ویروس غیرفعال آنفلوانزا در مدل دیابتی نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده در این بخش نشان داد که هر دو واکسن قابلیت القای ایمنی سلولی در این مدل را دارا نیستند. همچنین کاربرد ادجوانت ها به همراه واکسن ژنی بیان کننده np نشان داد که تنها il-12 قادر به بهبود القای ایمنی سلولی می باشد و کاربرد نالوکسان در مدل دیابتی فاقد نقش ادجوانتی است.

چکیده ندارد.

مطالعه حاضر در پاییز سال 1385 در کارگاه تکثیر ماهیان خاویاری شهید مرجانی گرگان با هدف بررسی اثرات جیوه آلی بر فاکتورهای زیستی ، میزان تجمع آن در بافتهای مختلف بدن (آبشش، روده، کبد، کلیه و گوشت) و تاثیر آن بر بیان ژنهای gnrh در مغز فیل ماهیان جوان انجام شد. بدین منظور بچه فیل ماهیان جوان با میانگین وزنی 6±86 گرم با چهار نوع جیره غذایی حاوی متیل جیوه در چهار گروه تیماری شامل: گروه شاهد با 0/04؛ گروه غلظت پایین با 0/76؛ گروه غلظت متوسط با 7/8 و گروه غلظت بالا با 16/22 میلی گرم متیل جیوه درکیلوگرم غذا طی 70 روز تیمار شدند. نتایج مقایسه نرخ رشد نشان داد که در طی 35 روز اول بین بچه فیل ماهیان گروه تیمار با غلظت بالا و در طی 35 روز دوم بین بچه فیل ماهیان گروه تیمار با غلظت متوسط با گروه شاهد کاهش رشد معنی داری (p<0.05) وجود دارد. بررسی نرخ رشد ویژه نیز کاهش معنی داری (p<0.05) بین گروه تیمار با غلظت بالا در طی 35 روز اول و گروه تیمار با غلظت متوسط نسبت به گروه شاهد در طی 35 روز دوم را نشان داد. همچنین نتایج نشان دادند که میزان تجمع جیوه در تمامی بافتهای مورد بررسی با غلظت متیل جیوه و زمان در معرض قرارگیری ارتباط مستقیم دارد. در مرحله شناسایی، توالی یابی و کلونینگ ژنهای gnrh در فیل ماهی با استفاده از روش race-pcr (rapid amplification of cdna ends) وجود دو فرم مولکولی mammalian gnrh (mgnrh) وchicken gnrh-ii (cgnrh-ii) به اثبات رسید که به ترتیب دارای 273 و 258 جفت باز طول و متشکل از 91 و 86 اسید آمینه بودند که به ترتیب با شماره های دستیابی ef534707 و ef534706 در بانک جهانی ژن ثبت گردیدند. سپس بررسی تغییرات بیان این ژنها در مغز تحت تاثیر متیل جیوه با استفاده از روش real-time quantitative pcr طی 32 روز نشان داد که در روز 11 ام، میزان بیان این ژنها در گروه تیمار با غلظت بالا نسبت به گروه کنترل کاهش معنی داری داشته است (p<0.05). در روزهای 18 و 32 ام نیز میزان سطوح mrna هر دو ژن در تمامی گروههای تیماری نسبت به گروه کنترل کاهش معنی داری را نشان داد (p<0.05). این نتایج نشان می دهد که متیل جیوه می تواند یکی از مختل کننده های نورواندوکرینی مهم باشد که ممکن است باعث ممانعت القای ژنهای gnrh از طریق اثر بر روی مسیر سیگنالی gnrh شده و محور هیپوتالاموسی_هیپوفیزی و رشد را تحت تاثیر قرار دهد.

بکارگیری زیست مولکولی و زیست فناوری گیاهی نشان داده است که می توان بسیاری از داروها را در حجم انبوه و به قیمت بسیار ارزان در گیاهان تولید نمود. جذابیت سیستم های گیاهی به دلیل مزایایی همچون ایمنی بالا، هزینه پائین، تغییرات پس از ترجمه و حجم بالای تولید است که نسبت به سیستم های کلاسیک (مثل باکتری ها، مخمرها و سلولهای جانوری) دارند. پروتئین داروئی (tissue plasminogen activator) tpa بطور اختصاصی و نسبتا قوی به لخته های خونی متصل شده و ترجیحا پلاسمینوژن به دام افتاده در داخل لخته ها را فعال و لخته خونی را از بین می برد. از پروتئین نوترکیب tpa به منظور درمان سکته های قلبی و مغزی استفاده می شود. در این تحقیق، به منظور بررسی امکان و نحوه بیان این پروتئین در سیستم بیانی گیاهی، cdna ژن فعال کننده پلاسمینوژن بافتی(tpa) با کمک آغازگرهای اختصاصی در ناقلt/a همسانه سازی و سپس در ناقل بیانی گیاهی pbi121 در مجاورت ژن gus همسانه سازی شد. این ژن تحت کنترل پیشبرنده camv 35s و خاتمه دهنده nos قرار گرفت. توالی افزایش دهنده kozak و ترادف رمز کننده پپتید نشانه kdel، به ترتیب به انتهاهای آمینی و کربوکسیلی ژن tpa افزوده شدند. سازه pbi-tpa ابتدا به آگروباکتریوم سوش lba4404 و سپس به ژنوم گیاهان توتون انتقال داده شد. گیاهان تراریخته روی محیط کشت انتخابگر (حاوی کانامایسینmg.l-1 100) انتخاب شدند و جوانه های تراریخت ریشه دار شده ابتدا به پرلیت و سپس به خاک منتقل شدند به منظور جلوگیری از دگرگرده افشانی غنچه قبل از باز شدن پاکت گذاری و ایزوله شدند و بذور نسل اول (t0) از آنها جمع آوری و ارزیابی پایداری ژن در نسل بعد انجام شد.. واکنش rt-pcr نیز انجام رونویسی و تولید mrna مربوطه را اثبات کرد. ژل sds-page نیز علائم اولیه و احتمالی حضور پروتئین مورد نظر(tpa) را نشان داد و از آزمون وسترن بلات جهت اطمینان از بیان پروتئین tpaاستفاده شد. آزمون زیموگرافی برای بررسی فعال بودن پروتئین تولید شده انجام شد که این آزمون هم حضور و هم فعال بودن پروتئین نوترکیب tpa را اثبات کرد. اکنون اگر بتوان این پروتئین نوترکیب را تخلیص کرد، این پروتئین داروئی توانایی حل لخته های خونی را خواهد داشت. بدیهی است با استحصال و استخراج این پروتئین نوترکیب ارزشمند علاوه بر تولید انبوه و ارزان آن، گام موثر دیگری در جهت پیشرفت داروهای نوترکیب در کشور برداشته خواهد شد.

استراتژی های مختلفی برای افزایش بیان و تجمع پروتئین نوترکیب در گیاهان در نظر گرفته می شود. از مهمترین عوامل موثر بر افزایش میزان تولید پروتئین نوترکیب در گیاه، بیان آن در بافت مناسب و نیز افزایش پایداری و تجمع پروتئین با استفاده از عوامل هدف گیری کننده به جایگاههای مناسب در سلول است. بیان پروتئین نوترکیب در بذر، موجب تجمع پایدار آن در غلظت نسبتا بالا در حجم کوچک و فشرده می شود که برای استخراج و ذخیره سازی بسیار مناسب می باشد. از طرف دیگر شبکه آندوپلاسمی سلول بدلیل حضور پروتئینهای چپرونی مختلف و ایزومرازها موجب بسته بندی صحیح پروتئینها شده و پایداری و تجمع پروتئین نوترکیب به میزان قابل توجهی افزایش می یابد. استراتژی دیگر استفاده از ژن اولئوسین گیاهی به منظور هدف گیری پروتئین نوترکیب به اجسام روغنی بذر می باشد. اتصال ژن اولئوسین به ژن مورد نظر و استفاده از پیشبرنده اختصاصی بذر، موجب قرار گرفتن پروتئین نوترکیب در اجسام روغنی بذر می شود. که علاوه بر تولید زیاد پروتئین، استخراج راحت تر و ارزانتر آن را نیز به دنبال خواهد داشت. در این تحقیق از دو استراتژی مذکور برای بیان پروتئین اینترفرون گامای انسانی در بذر گیاه کلزا استفاده شد. برای این منظور 3 نوع سازه مختلف طراحی و ساخته شد: 1) سازه pbi121-ifnγ 1 شامل ژن infγ + پیشبرنده napin، 2) سازه pbi121-ifnγ 2 شامل توالی kdel + ژن infγ + توالی kozak +پیشبرنده napin، 3) سازه pbi121-ifnγ-oleosin شامل infγ + توالی برشی + ژن اولئوسین+ پیشبرنده napin. سازه ها ی مذکور در ناقل گیاهی pbi121کلون و تائید شدند. سپس این سازه ها با روش انجماد و ذوب به اگرباکتریوم سویه lba4404 معرفی و این باکتری برای تراریختی گیاه کلزا از طریق ریزنمونه های لپه ای مورد استفاده قرار گرفت. گزینش نوساقه های باززائی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک (کانامایسین و سفاتوکسیم) انجام شد. حضور سازه pbi121-ifnγ 2 و pbi121-ifnγ-oleosinدر گیاهان تراریزش شده در سطح dna با استفاده از pcr تائید شد. بررسی در سطح پروتئین با استفاده از sds-page نشان دهنده بیان پروتئین infγ در برخی گیاهان تراریخت شده با سازه pbi121-ifnγ 2 بود. در گیاهان مذکور فعالیت پروتئین تولید شده با تستهای elisa و dot blot و western blot نیز تائید شد. در مورد سازه pbi121-ifnγ-oleosin، علاوه برتائید انتقال سازه در سطح dna ژنومی، بررسی بیان در سطح rna با rt-pcr نشانگر نسخه برداری ژن ترکیبی بود. نتایج حاصل نشان داد که با در نظر گرفتن پروسه های بعدی از جمله تخلیص و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پروتئین تولید شده، بذر گیاه کلزا می تواند بعنوان یک بیوراکتور مناسب جهت تولید پروتئین های نوترکیب مورد استفاده قرار گیرد.

در دسترس بودن پروتئینهای انسانی نوترکیب باعث تحولی در استفاده از پروتئینهای ارزشمند از نظر دارویی در پزشکی بالینی شده است. گیاهان به عنوان سیستم های موفق در تولید پروتئین های نوترکیب شناخته شده اند که در میان آنها علاوه بر توتون، گیاه کلزا نیز انتخاب مناسبی جهت تولید پروتئین های نوترکیب می باشد. اینترفرون ها از جمله پروتئین هایی هستند که ارزش درمانی بالایی دارند. مطالعات پزشکی نشان می دهد که اینترفرون می تواند تا حدودی به عنوان دارو برای آلودگی های ویروسی، سرطان و بیماری های خود ایمن مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین، علاقه شدیدی برای تولید اینترفرون از منابع دائمی، ایمن و ارزان حائز اهمیت است. در این تحقیق ژن اینترفرون گامای انسانی که تحت پروموتر napin در پلاسمید pbi121 کلون شده بود به اگروباکتریوم سویه lba4404 منتقل گردید و به وسیله colony pcr با آغازگرهای اختصاصی تأیید شد. سپس پلاسمید نو ترکیب شامل ژن اینترفرون گامای انسانی به کمک اگروباکتریوم به گیاه کلزا منتقل گردید. ریزنمونه های کوتیلدونی از گیاه کلزا کولتیوار pf4570/91 برای تراریخت سازی مورد استفاده قرار گرفت و تعداد 15 گیاه تراریخت به دست آمد. گیاهان تراریخت بر روی محیط ms حاوی mg/l25 آنتی بیوتیک کانامایسین انتخاب شدند. آنالیز مولکولی گیاهان تراریخت وجود ژن اینترفرون گامای انسانی را در گیاهان تراریخت تأیید نمود. بیان پروتئین نوترکیب در بذر از این نظر جالب توجه است که تجمع پروتئین در غلظت نسبتاً بالا و به صورت پایدار در حجم فشرده و متراکم امکان پذیر است که برای استخراج و تخلیص بسیار مناسب می باشد. برای بیان اینترفرون گامای انسانی در بذر گیاه کلزا در این تحقیق از آغازگر اختصاصی بذر napin استفاده شد. تولید پروتئین اینترفرون گاما و تجمع آن در بذر گیاهان تراریخت به کمک تکنیک sds-page تأیید گردید.