انکوژنهای e6و e7 ویروس پاپیلومای انسانی که بطور مداوم در سلولهای سرطانی بیان می شوند، بعنوان اهداف مناسبی برای توسعه واکسنهای درمانی بر علیه سرطانهای مرتبط با پاپیلوما شناخته شده اند. فاژ لامبدا پتانسیل بالایی بعنوان ابزار حمل ژن دارا می باشند که این مسئله بدلایل متعددی از جمله انعطاف پذیری ژنتیکی، قیمت پایین، بی خطری و سایر ویژگیهای فیزیکی در قیاس با دیگر نانو حاملین می باشد. در ارتباط با انتقال ژن با واسطه فاژ لامبدا به سلولهای پستانداران مطالب کمی در دست است.بنابراین در این تحقیق، بعد از ساخت لامبدا فاژهای نوترکیب، مجموعه آزمایشهایی برای ارزیابی انتقال ژن و بیان باکتریوفاژ zap لامبدا در محیطهای آزمایشگاهی انجام گرفت. برای این منظور، لاینهای سلولی توسط باکتریوفاژ لامبدا نوترکیب حاوی کاست بیانی egfp ترانس داکت شدند. همچنین واکسن لامبدا محتوی انکوژنهای ویروس پاپیلوما از طریق وارد نمودن ژنهای وحشی و انسانی شده hpv-16 e7 در داخل وکتور λ-zap تولید شدند. بیان ژنهای وکتور لامبدا حاوی ژن e7 توسط لاین سلولی cho مورد ارزیابی قرار گرفت. فاژهای λ-zap e7 و dna واکسنهای تولید شده به منظور ایمن سازی موشهای توموری توسط لاین سلولی tc-1 مورد استفاده قرار گرفتند. همچنین استراتژی پرایم بوست هترولگ با بکار گیری ترکیبات مختلف فاژهای λ-zap e7 و dna واکسن استفاده شد.نتایج بدست آمده نشان داد که حمل و بیان ژنهای egfp توسط فاژ لامبدا در لاینهای سلولی با منشا فیبروبلاستی کاراتراز لاینهای سلولی با منشا اپی تلیلیالی می باشد. موشهای توموری بدنبال واکسینه شدن با باکتریوفاژهای نوترکیب بطور معنی داری در قیاس با گروههای کنترل، سرکوب تومور را نشان دادند. آزمایشات ایمنی سلولی شامل ldh، ترشح ifn-γ، گرانزیم b و تکثیر لنفوسیتی نشان دهنده افزایش پاسخهای ایمنی سلولی بودند که همه این موارد نشان داد که فاژ می تواند بعنوان یک سیستم حمل ژن به مدلهای حیوانی مورد بهره برداری قرار بگیرد. نتایج در مجموع نشان داد که فاژهای نوترکیب می توانند بعنوان ابزارهای بیولوژیک موثری برای القای پاسخهای ایمنی محافظتی بر علیه سرطان دهانه رحم و بدخیمیهای حاصل از پاپیلوما ویروس و بوستری مناسب برای پاسخهای شکل گرفته توسط dna واکسن می توانند مورد استفاده قرار گیرند.

در سالهای اخیر نسل تازه ای از واکسنها بنام واکسنهای چند اپی توپی توجه بسیاری را به خود جلب کرده است.این نوع از اکسنها با در کنار هم قرار دادن اپی توپهای شناخته شده مربوط به یک یا چند میکروارگانیسم بصورت ژن یا پپتید درست می شوندو باعث تحریک سیستم ایمنی بصورت اختصاصی می گردندو مخصوصا در مورد ویروسهایی مثل hcv که جهش زایی بالایی دارند،بسیار مورد توجه قرار گرفته اند.استفاده از گیاهان تراریخته نیز برای تولید واکسنهای درمانی انسانی یا حیوانی بسیارمورد توجه می باشد.واکسنهای گیاهی ، مزیتهای زیادی ازجمله عدم نیاز به زنجیره سرد در طول حمل و نقل، هزینه پایین تهیه و تولید ، انبارداری آسان و مایه کوبی راحت، دارند. در این پروژه، ژن سنتتیک پلی توپ hbs-polytope2 داخل پلاسمید نگهدارنده (+)3.1 pcdna ، بعد از تکثیر با پرایمرهای اختصاصی، وارد جایگاه ژن gus در پلاسمید pbi121 که یک ناقل دو تایی گیاهی است ، شد. بعد به باکتری e.coli dh5? ترانسفرم شد و بعد از بررسی صحت کاست نوترکیب حاصل و انجام عمل هضم با آنزیمهای برشی مربوطه ، بااستفاده از روش شوک حرارتی به agrobacterium tomefasiens، سویه pgv 3850 ، منتقل شد. ازکلونیهای تولید شده در محیط گزینشگر حاوی کانامایسین برای انتقال به ریز غده های سیب زمینی واریته کاردال از راه زخمی کردن غده استریل و آلوده کردن آنها با این باکتری،استفاده شد.گیاهان تراریخت در محیط کشت اختصاصی حاوی آنتی بیوتیکهای کانامایسین و سفاتوکسیم ،باززایی شدند. درآنالیز ملکولی گیاهان تراریخت با روش pcr باندی با طول حدود 750bp مربوط به ژن کلون شده دیده شد و آنالیز پروتئین نیز با روشelisa ، انجام گرفت . نتایج این مطالعه نشان می دهد که این پروتئین شیمریک نو ترکیب در گیاه سیب زمینی به خوبی بیان و پردازش شده و این گیاه احتمالا از کارایی اولیه لازم به منظور بررسی ایمنی زایی بعنوان کاندیدای واکسن در حیوان حساس آزمایشگاهی برخوردار می باشد

چکیده مهندسی ژنتیک در گیاه با تولید مواد ارزشمند دارویی، هورمونی، واکسن و انواع پروتئینهای شامل آلبومین، اینترفرون، اریتروپوئیتین، ایمونوگلوبولین، igg، iga و آنتی ژنهای ایمنی زا در حال توسعه و تحقیق می باشد.گیاه تراریخته به منظور تولید واکسن باعث حذف زنجیره سرد در حمل و نقل و تولید راحت می گردد. اخیرا نسل جدیدی از واکسنها بصورت ژن، آنتی ژن و پپتید ایمنی زا ایجاد شده اند که باعث تحریک سیستم ایمنی به کمک سلولهایcd8+ وcd4+ می شوند که بسیار موثر و کم خطر هستند. بیماری هپاتیت c حدود 175 میلیون نفر را در جهان مبتلا کرده و نبود واکسن موثر، شیوع بالای سیروس کبدی، عوارض هپاتیت مزمن و گسترش روزافزون، آن را به یک معضل بهداشتی و جهانی تبدیل کرده است. ویروس هپاتیت c دارای rna تک رشته ای است که پروتئین ساختاری (core) در آن نقش به سزایی در تولید کپسید، فعالیتهایی بیولوژیک و پاتوژنز دارد و در تهیه واکسن به علت ثبات توالی و عدم جهش از دیگر اجزا ویروس مهم تر است. در این تحقیق می خواهیم آنتی ژنهای ایمنی زای core 174 را جهت تولید پروتیئنهای تحریک کننده سیستم ایمنی انسان به گیاه سیب زمینی ترانسفورم کنیم. برای این منظور ژن core174 با کمک پرایمرهای اختصاصی از روی پلاسمید pivex2.4 با تکنیک pcr تکثیر شد. پلاسمیدpbi121 توسط آنزیمهای برشی xba1وsac1 هضم، ژن گزارشگر gus خارج و ژن core174 جایگزین آن شد. وکتور نوترکیب به باکتری e.coli dh5? منتقل و بعد از تایید صحت کاست بیانی پلاسمید نوترکیب (هضم آنزیمی وpcr) به آگروباکتریم ترانسفورم شد. از طریق آلوده کردن گیاه زخمی به آگروباکتریوم حاوی core174 ترانسفورماسیون به گیاه سیب زمینی انجام گرفت. گیاه تراریخت در محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین باززایی شد و سپس حضور ژن در ژنوم گیاه تراریخت با آنالیز مولکولی به اثبات رسید. آنالیزهای پروتیئن با روشهای sds-page و برادفورد تولید پروتئین نوترکیب را در گیاه سیب زمینی بیان کردند. نتایج حاصل نشان دادند که پروتیئن core174 در گیاه بیان شده است.

در این پژوهش ژن hbeag از ژنوم کامل hbv سویه ayw با روش pcr جداسازی شد. محصول pcr پس از تخلیص و آنالیز با آنزیم های محدودکننده و انجام مراحل کلونینگ در وکتور puc18 جهت بررسی نهایی به وسیله واکنش های ترادف یابی(sequancing) با تکنیک alf مورد تایید قرار گرفت . در مرحله بعد ژن e آنتی ژن در وکتورهای بیانی phild2 و phils1 که وکتورهای دوسو(shuttle) برای مخمر pichia pastoris و باکتری e.coli می باشند، تحت پروموترaox1، کلون گردید. آنالیزهای آنزیمی صحت ساختار پلاسمید نوترکیب را از لحاظ جهت قرارگیری ژن و ترادف اجزاء واحد بیانی، مورد تایید قرار داد. پلاسمیدهای نوترکیب phild2e و phils1e به صورت خطی (linearized) جهت ترانسفرم کردن p.pastoris با 4 روش ترانسفورماسیون لیتیوم کلراید، 1000 peg ، الکتروپوراسیون و اسفروپلاست بکار رفتند. غربال کلنی های ترانسفرم شده بر روی محیط حداقل، مشاهدات میکروسکوپی، استخراج ژنوم مخمرهای نوترکیب و انجام آنالیز pcr ، ساخت سوش بیانی pichia pastoris برای hbeag را مورد تایید قرار داد. بررسی نتایج روشهای مختلف ترانسفورماسیون نشان داد که اسفروپلاست موثرترین روش ترانسفرم کردن این مخمر می باشد.

لخته های خونی باایجاد سکته قلبی و مغزی ، خیز ریوی و ایسکمی اندامی بهای سنگینی را از لحاظ بهداشتی و مادی بر جوامع تحمیل می کنند. دراین میان استرپتوکیناز ‏‎sk‎‏ که یک فعال کننده پلاسمینوژن مترشحه از استرپتوککهای بتا همولیتیک می باشد با بیش از 30 سال سابقه مصرف بالینی در درمان سکته قلبی ، بیشترین مطالعات مربوط به داروهای فیبرینولیتیک را به خود اختصاص داده است. بازدهی کم تولید و بیماریزایی استرپتوککها دو دلیل عمده گرایش به سمت تولید این پروتئین بصورت نوترکیب می باشد. با توجه به اینکه سویه های مختلف استرپتوکک، استرپتوکینازهایی متفاوت از نظر بیولوژیک و خواص آنتی ژنیک ترشح می کنند، جستجو بدنبال استرپتوکینازی با فعالیت بیشتر و ایمونوژنیسیتی کمتر می تواند موجب دستیابی به دارویی با عملکرد بهتر گردد.