چکیده در این پژوهش با هدف دست یافتن به سویه های تولید کننده متابولیت های ضد میکروبی فعال روی غشا بیش از 303 جدایه مختلف شامل باکتری، قارچ و اکتینومیست از خاک های ایران به ترتیب بر روی محیط های کشت trypticase soy agar، malt extract agar و inorganic salt starch agar جدا شدند. جدایه های خالص سازی شده ابتدا از نظر توانایی تولید متابولیت های ضدمیکروبی بر علیه 3 میکروارگانیسم شاخص escherichia coli، candida albicans وsaccharomyces cervisiae غربال گری شدند. 75 جدایه با ایجاد هاله مهار رشد بر علیه 3 میکروارگانیسم شاخص تولید کننده متابولیت های ضدمیکروبی بودند که 7 سویه با ایجاد هاله مهار رشد بیش از 20 و 30 میلی متر، شامل 6 سویه اکتینومیست و 1 سویه قارچ بودند. تمامی 75 سویه از لحاظ تولید متابولیت های فعال روی غشا در غربال گری ثانویه مورد بررسی قرار گرفتند. در مرحله اول غربال گری ثانویه 12 سویه از 75 سویه فعال، تولید کننده متابولیت های فعال روی غشا بودند. در مرحله دوم غربال گری ثانویه عصاره های آلی استخراج شده از محیط تخمیر 12 سویه فعال از نظر فعالیت بر روی غشا مورد بررسی و تائید نهائی قرار گرفتند. در نهایت از میان 12 سویه، 4 سویه شامل 3 سویه اکتینومیست و 1 سویه قارچ به عنوان سویه های تولید کننده متابولیت های فعال روی غشا انتخاب شدند. حداقل غلظت مهارکنندگی (minimal inhibitory concentration) عصاره های آلی استخراج شده از 4 سویه فعال تعیین شد. با توجه به نتایج حداقل غلظت مهارکنندگی، میزان سمیت سلولی عصاره های بدست آمده بر علیه رده سلولی فیبروبلاست موش 3t3 ارزیابی شد. در نهایت طیف ضد میکروبی هر 4 سویه بر علیه 6 سویه باکتری شاخص شامل 3 باکتری گرم مثبت staphylococcus aureus ، streptococcus pyogenes،bacillus subtilis و 3 باکتری گرم منفی pseudomonas aeruginosa ، salmonella typhi، enterococcus faecalis اثر داده شدند.

مقدمه: استیل کولین استراز یکی از مهمترین آنزیم های سیستم عصبی مرکزی است که در فضای سیناپسی استیل کولین را هیدرولیز کرده باعث خاتمه پیام عصبی می شود. این آنزیم هدف برخی از قدرتمندترین سم ها قرار می گیرد و غیر فعال شدن آن می تواند برای سلامتی انسان خطر آفرین باشد. برای تشخیص این گونه سموم در محیط یا مواد غذایی، استیل کولین استراز می تواند در ساخت زیست گرها مورد استفاده قرار گیرد. برای این منظور، استیل کولین استرازهایی با پایداری بالا مورد نیاز است. روش تحقیق: به منظور افزایش پایداری ایجاد یک پیوند دی سولفید جدید در ساختار استیل کولین استراز دروزوفیلا ملانوگاستر، در توالی این آنزیم اسید آمینه های ایزولوسین 298 و آسپارتیک اسید 346، با اسید آمینه سیستئین جایگزین گردیدند. هر دو توالی طبیعی و جهش یافته بر اساس ترجیح کدونی این مخمر پیکیا پاستوریس طراحی و سنتز شدند. ژن های سنتز شده در مخمر پیکیا پاستوریس کلون و بیان شدند و پس از تخلیص با استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی، پارامترهای سینتیکی و پایداری این دو آنزیم در دماهای مختلف و در برابر عوامل دناتوره کننده سنجیده شد. یافته ها: نیمه عمر آنزیم طبیعی بیان شده در مخمر در دمای 50 درجه سانتی گراد و در برابر اوره 4 مولار به ترتیب 11/9 و 5 برابر آنزیم طبیعی بیان شده در سلولهای sf9 است. نیمه عمر آنزیم جهش یافته بیان شده در مخمر در دمای 50 درجه سانتی گراد و در برابر استونیتریل % 20 و اوره 4 مولار به ترتیب 51/5 ، 76/2 و 4/1 برابر بیشتر از آنزیم جهش یافته بیان شده در سلول های sf9 می باشد نیمه عمر آنزیم جهش یافته بیان شده در مخمر نسبت به آنزیم طبیعی بیان شده در مخمر دمای60، 55،50 و 45 درجه سانتی گراد و در برابر استونیتریل % 20 و اوره 4 مولار به ترتیب 8/2، 93/1078،70/85، 75/1، 27/6 و 66/2 برابر بیشتر می باشد. نتیجه گیری: بیان آنزیم استیل کولین استراز دروزوفیلاملانوگاستر در مخمر پیکیا پاستوریس باعث افزایش پایداری این آنزیم می شود. به علاوه ایجاد جهش برای تشکیل باند دی سولفیدی c298-c346 نیز پایداری آنزیم را افزایش می دهد.

نیکل و سرب از جمله فلزات سنگین هستند که خصوصیات سمی و حتی کشندگی آن برای انسان، حیوانات و گیاهان تأیید شده است. سویا (glycin max l.) گیاهی است از تیره پروانه داران و یکی از مهمترین منابع پروتئینی در زنجیره غذایی انسان ها می باشد. هدف عمده در پژوهش حاضر بررسی اثرات ریختی، رشدی و فیزیولوژیکی دو فلز سنگین سرب و نیکل بر گیاه سویا، در شرایط تلقیح با باکتری برادی ریزوبیوم ژاپونیکوم و همچنین توانایی این گیاه زراعی و دارویی در پالایش خاک های حاوی این فلزات می باشد. بدین منظور تعدادی پایه و بذر سویا (رقم dpx) از مزرعه ای واقع در جنگل توسکستان جمع آوری و باکتری برادی ریزوبیوم ژاپونیکوم از گرهک های ریشه ای آن استخراج گردید. کشت بذر های سویا در طی 2 سال به صورت گلدانی در شرایط گلخانه ای و طبیعی در قالب آزمایش فاکتوریل با طرح بلوک های کامل تصادفی با سه تکرار در دو سطح تلقیح و عدم تلقیح با باکتری، 4 غلظت نیکل(صفر، 200، 400 و 600 میکرومولار) و 4 غلظت سرب (صفر، 250، 500 و 750 میکرومولار) انجام شد. نمونه برداری از اندام های هوایی و ریشه ها پس از 70 روز انجام شد و برخی از صفات ریختی، رشدی و فیزیولوژیکی اندازه گیری شد. نتایج حاکی از کاهش برخی پارامترهای رشدی در اثر افزایش غلظت های سرب و نیکل اعمال شده بود. افزایش در غلظت نیکل سبب کاهش معنی دار در وزن تر و خشک برگ و ریشه، سطح برگ، تعداد شاخه ی فرعی در بوته، تعداد گره های ساقه، فاصله طوقه تا اولین گره، طول ساقه و ریشه، قطر و حجم ریشه شد. سرب نیز تاثیر مشابهی داشت، بطوریکه با افزایش غلظت آن در وزن تر برگ، ساقه و ریشه، سطح برگ، قطر ساقه، قطر و حجم ریشه کاهش معنی داری مشاهده شد. میزان کلروفیل تام برگ ها نیز در بالاترین غلظت سرب و نیکل به ترتیب 98/27 و 11/39 درصد نسبت به گروه شاهدکاهش یافت. تفاوت معنی داری بین محتوای نیتروژن در برگ و ساقه گیاهان شاهد و گیاهان تیمار شده در غلظت های زیاد نیکل مشاهده نشد. نتیجه مشابهی برای درصد پروتئین و پروتئین محلول برگ در تیمارهای سرب و نیکل بدست آمد. تنها درصد پروتئین ساقه تحت تیمار سرب از شاهد تا بالاترین غلظت 13/15 درصد کاهش معنی دار یافت. همچنین فعالیت برخی آنزیم های آنتی اکسیدان در برگ سنجیده شد. فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز با افزایش غلظت سرب (67/64 درصد) و نیکل (75/25 درصد) نسبت به شاهد افزایش یافت. در حالی که فعالیت کاتالاز مهار شد. آسکوربات پراکسیداز و گلوتاتیون اس ترانسفراز در غلظت های 400 و 500 میکرومولار نیکل و سرب بیشترین فعالیت را داشتند اما با بالا رفتن غلظت سرب و نیکل از فعالیت آنها کاسته شد. سطح مالون دی آلدئید با افزایش غلظت نیکل تا 400 میکرومولار نسبت به گروه شاهد به میزان22/18% افزایش یافت، اما در غلظت های بیشتر مقدار آن کاهش یافت. با افزایش غلظت سرب تا غلظت 750 میکرومولار مقدار این ماده نسبت به گیاهان شاهد کاهش یافت. بیشترین مقدار پراکسید هیدروژن تولید شده در گیاهان تیمار شده با غلظت 600 میکرومولار(52/3 میلی مول بر گرم وزن تر برگ) نیکل نسبت به گروه شاهد (معادل07/2 میلی مول بر گرم وزن تر برگ ) مشاهده شد . در صورتی که میزان پراکسید هیدروژن تولید شده در برگ گیاهان تیمار شده با سرب با افزایش غلظت این فلز سنگین کاهش یافت. به طور کلی، در تمامی تیمارها تلقیح با باکتری تاثیر معنی داری بر پارامترهای مورد بررسی نداشت. نتایج نشان داد که سویا توانایی بالایی در انباشتگی سرب و نیکل در ریشه را دارد. انباشتگی این عناصر از ریشه به سمت اندام هوایی کاهش یافت. بطوریکه در بالاترین غلظت نیکل، انباشت این عنصر در ریشه، ساقه و برگ به ترتیب 57/3، 41/0 و ppm 46/0 بود. همانند نیکل، انباشت سرب نیز در بیشترین غلظت در برگ، ساقه و ریشه به ترتیب 32/0، 27/0 و ppm 53/3 بود. بنابراین می توان گیاه سویا را به عنوان یک ریشه-بیش انباشت کننده معرفی کرد و از آن جهت پالایش خاک های آلوده به فلزات سنگین وریشه پالایی بهره برد.

هیدروکربن های آروماتیک چند حلقه ای (pahs) یک گروه متنوع از ترکیبات آلی هستند که به علت خصوصیاتی همچون سمیت، سرطانزایی و ماندگاری بالا به عنوان یکی از آلاینده های مهم محیطی شناخته شده اند. با توجه به مشکلات و محدودیت هایی که در روش های فیزیکی و شیمیایی برای حذف این آلاینده ها از محیط وجود دارد، روش تجزیه زیستی (biodegradation) با استفاده از میکروارگانیسم ها فرایندی سالم، موثر و اقتصادی جهت حذف pah ها می باشد. در این مطالعه سه ترکیب نفتالن، فنانترن و پیرن به عنوان مدل برای مطالعه تجزیه زیستی ترکیبات pah انتخاب شد. هدف اصلی ما در این تحقیق غربالگری و شناسایی مولکولی باکتری های بومی تجزیه کننده این ترکیبات می باشد. به این منظور از خاک های مناطق آلوده به ترکیبات نفتی (مانند اطراف پالایشگاه تهران و اطراف لوله های انتقال نفت اهواز) به عنوان منبع جداسازی باکتری ها و از محیط پایه معدنی bushnell-haas broth حاوی پیرن برای غنی سازی استفاده شد. تمام جدایه های موثر در مرحله اول، با استفاده از روش های مورفولوژیکی و بیوشیمیایی در حد جنس شناسایی شدند. سپس در محیط کشتbh جامد به همراه غلظت های مختلفpah ها کشت داده شدند که برحسب میزان رشد و قطر هاله، دو جدایه به عنوان سویه های برتر انتخاب شد. به منظور شناسایی دقیق مولکولی، تکثیر و تعیین توالی 16s rdna سویه های برتر انجام شد. سپس میزان رشد این جدایه ها در محیطbh مایع حاوی مخلوطpah ها به عنوان تنها منبع کربن بررسی شده و با نمونه شاهد فاقد منبع کربن مقایسه گردید. مقدار pah باقی مانده در محیط نیز با استفاده از دستگاه (gc/fid) تعیین شد. نتایج نشان داد که جدایه های برتر شناسایی شده متعلق به جنس pseudoxanthomonas sp. و sp. ralstonia می باشند که نه تنها به pah ها مقاوم اند بلکه توانایی رشد در حضور pah و استفاده از آن به عنوان تنها منبع کربن و انرژی را دارند. بنابراین می توان از آنها پس از بررسی در سطح پایلوت و تعیین فرمولاسیون سویه ها، جهت پاکسازی زیستی (bioremediation)استفاده نمود.

عفونت های بیمارستانی از جمله معضلات و مشکلات مهم پزشکی در کشور های توسعه یافته و در حال توسعه محسوب می شود. سودوموناس آئروژینوزا سومین عامل عفونت های بیمارستانی است. سودوموناس آئروژینوزا بیماریزای مهم و عامل منتهی به مرگ در مبتلایان به فیبروز سیستیک، بیماری نئوپلاسمی و سوختگیهای شدید می باشد. این باکتری با تشکیل بیوفیلم، خود را در برابر سیستم ایمنی میزبان و عوامل ضدمیکربی مختلف محافظت می نماید. با مصرف گسترده پادزیست ها سویه های سودوموناس آئروژینوزا مقاوم به چند دارو در سراسر جهان به طور فزایندهای افزایش یافته است. ایمونوپروفیلاکسی ممکن است راه موثری برای کنترل عفونت های ناشی از این باکتری باشد. آلژینات به عنوان یکی از اجزای اصلی تشکیل دهنده بیوفیلم یک فاکتور بیماریزایی مهم به شمار می آید. در این مطالعه به منظور افزایش ایمونوژنیسیته آلژینات از روش کونژوگاسیون استفاده شد. آلژینات به طور جداگانه به دو حامل متفاوت کونژوگه شد. حامل اول وزیکول غشا خارجی باکتری نایسریا مننژیتیدیس سروتیپ b (omv) و حامل دوم یک پپتید سنتتیک (erranavrdvlvne) برگرفته از پروتئین f غشا خارجی سودوموناس آئروژینوزا (ompf) بود که با کمک ابزارهای بیوانفورماتیکی طراحی شد. جهت ارزیابی واکنش سیستم ایمنی، گروههای موشی سه مرتبه و در فواصل دو هفته ای با آلژینات غیر کونژوگه ، کونژوگه آلژینات-omv ، کونژوگه آلژینات-پپتید294 و گروههای کنترل به صورت زیر جلدی واکسینه شدند. نتایج الایزا نشان داد که در گروههای موشی ایمن شده با کونژوگه ها افزایش تیتر آنتی بادی در مقایسه با آلژینات غیر کونژوگه و یا گروههای شاهد معنی دار بود. همچنین آزمون اپسونوفاگوسیتوز نشان داد که میزان باکتری های کشته شده ( رقت 1:32) با کونژوگه آلژینات-omv و آلژینات-پپتید294 به ترتیب 81 % و 53 % بود که در مقایسه با گروههای کنترل معنی دار بود.( p<0.05). میزان بقا موشهای ایمن شده با کونژوگه آلژینات-omv و آلژینات-پپتید294 بعد از ایجاد عفونت حاد ریوی با یک سویه بالینی جدا شده از بیماران مبتلا به سیستیک فیبروسیس (به شماره 6494) به ترتیب 83 % و 66 % بود. میزان بقا بعد از چالش با سویه استاندارد (m 8821) سودوموناس آئروژینوزا به ترتیب 100 % و 83 % بود. در ادامه نشان داده شد که موشهای ایمن شده با کونژوگه ها به طور معنی داری قادر به پاکساری ریه از سودوموناس آئروژینوزا سویهm 8821 و یا سویه بالینی سودوموناس آئروژینوزا (6494) در مقایسه با گروه کنترل می باشند. نتایج این تحقیق امکان بررسی دو کونژوگه آلژینات-omv و آلژینات-پپتید294 را جهت مطالعات بعدی و با هدف معرفی یک واکسن جدید بر ضد سودوموناس آئروژینوزا را فراهم می آورد.

مقدمه و هدف: سودوموناس آئروجینوزا (pseudomonas aeruginosa) مقام سوم ایجاد عفونتهای بیمارستانی و مقام اول در بخش سوختگی را دارا است. مقاومت بالای این باکتری نسبت به مواد ضد میکروبی از جمله آنتی بیوتیک ها باعث پیچیده تر شدن درمان عفونتهای ناشی از این باکتری شده است و بنابراین محققان تمرکز فعالیت های خود را روی تحقیقات واکسن گذاشته اند. آزمایشات بالینی متعددی نشان می دهد که فلاژل و دو پروتئین غشا خارجی به نام هایoprf و opriاز نظر توالی های مربوط به خاصیت آنتی ژنی در سویه های مختلف باکتری p. aeruginosa حفاظت شده اند. بنابراین ایمن سازی با آنتی ژن حفاظت شده ای مانند oprf می تواند در مبارزه با بیشتر یا تمام سروتیپ هایp. aeruginosa امید بخش باشد. با این نگرش این تحقیق با هدف ایمنی زایی پروتئین نوترکیب oprf علیه سودوموناس آئروجینوزا طراحی و مورد بررسی قرار گرفت. روش اجرای پژوهش: ابتدا ژن oprf با روش pcr تکثیر و پس از هضم با آنزیم های محدودگر hindiii و xho i واکنش الحاق توسط آنزیمdna لیگازt4در وکتور pet28a(+) انجام شد. پلاسمیدdna نوترکیب به سلول مستعد e. colibl21)de3) به عنوان میزبان بیانی انتقال و پروتئین بیان شده پس از تایید و تخلیص به مدل های سوختگی حیوانی در گروه های مختلف موش تزریق و نتایج مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته ها و نوآوری پژوهش: موش هایbalb/c با استفاده از پروتئینoprf ایمن و تیتر آنتی بادی با آزمایش الایزا تعیین شد. به منظور ارزیابی ایمنی سطح مشخصی از موش های ایمن را سوزانده و با p. aeruginosa مورد چالش قرار دادیم. کاهش معنی داری (p <0.001) درمیزان باکتریها در پوست، خون وارگان های داخلی بدن در موش ایمن آلوده به سودوموناس نسبت به گروه کنترل مثبت مشاهده شد. داده ها نشان می دهد کهigg ضدoprf نقش مهمی در مهار گسترش سیستمیک سودوموناس ازناحیه عفونت به ارگان های داخلی بدن ایفا می کند. ایمنی با پروتئینoprf مانع گسترش عفونت در بدن میزبان گردید.