یکی از مهمترین عوامل کاهش محصولات کشاورزی، آسیب های ناشی از حمله قارچ های پاتوژن به گیاهان زراعی است. غشاء پلاسمایی قارچ، هدف بزرگترین گروه پروتئین های ضدقارچی می باشد. بیش از 500 پروتئین طبیعی که با غشاء قارچ برهمکنش می کنند گزارش شده است. این پروتئین ها منجر به شکل گیری منفذ، جریان ترکیبات سلولی به سمت خارج و در نتیجه تغییر در پتانسیل غشاء می شوند. یکی از مهمترین پروتئین ها، defensin ها می باشند که با اثر بر روی کانال های یونی غشاء پلاسمایی قارچ های پاتوژن باعث مختل شدن جریان های یونی شده و به دنبال آن تغییر در پتانسیل غشاء و نهایتاً مرگ سلول قارچ را منجر می شوند. در این تحقیق شناسایی، کلون کردن و تعیین توالی ژن rs-afp1 از گیاه تربچه (raphanus sativus) و ژن tfgd2 از گیاه شنبلیله (trigonella foenum-graecum)صورت گرفت. در ابتدا استخراج dna ژنومی به روش ctab انجام و برای تکثیر این ژن ها از آغازگرهای اختصاصی rdeff و rdefr برای تکثیر ژن گیاه تربچه و آغازگرهای اختصاصی mdeff و mdefr برای تکثیر ژن گیاه شنبلیله استفاده گردید. قطعات مورد انتظار به طول تقریبی ??6 جفت باز مربوط به گیاه تربچه و 7?? جفت باز مربوط به گیاه شنبلیله تکثیر و در وکتور pjet1.2 کلون گردیدند. در مرحله بعد محصول بدست آمده با استفاده از الگوهای هضم آنزیمی و pcr تا?یید و به نام pjetme1 (وکتور نوترکیب حاوی ژن تربچه) و pjetme3 (وکتور نوترکیب حاوی ژن شنبلیله) نامگذاری شدند. همچنین cdna های ژن های مذکور پس از استخراج rna های مربوطه، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی سنتز گردید. cdna های حاصله به طول تقریبی 243 جفت باز مربوط به گیاه تربچه و 219 جفت باز مربوط به گیاه شنبلیله با الگوی هضم آنزیمی و الگوی pcr تا?یید و در وکتور pjet1.2 کلون شده و پلاسمیدهای حاصله به نام pjetme2 (پلاسمید نوترکیب حاوی cdna تربچه) و pjetme4 (پلاسمید نوترکیب حاوی cdna شنبلیله) نامگذاری شده و جهت تعیین توالی مورد استفاده قرار گرفتند. مقایسه توالی dna ژنومی و cdna این ژن ها نشان داد که ژن rs-afp1 گیاه تربچه حاوی یک اینترون به طول 11? جفت باز و open reading frame آن پپتیدی به طول 80 اسیدآمینه ( kda7/8) را کد می کند و ژن tfgd2 گیاه شنبلیله حاوی یک اینترون به طول 486 جفت باز و orf آن پپتیدی به طول 72 اسید آمینه (kda 2/8) را کد می کند. مقایسه توالی اسیدآمینه ای بدست آمده از ژن rs-afp1 از گیاه تربچه با توالی های ثبت شده در بانک ژنی نشان داد که این پپتید با پپتید مشابه از گیاهان brassica juncea ، orychophragmus violaceus ، brassica oleracea ، sinapis alba، arabidopsis halleri ، eutrema wasabi وbrassica rapa به ترتیب 8/98، 2/96 ، 8/93، 5/92، 2/91، 90 و 90 درصد تشابه را نشان میدهد. همچنین در مقایسه توالی اسیدآمینه ای بدست آمده از ژن tfgd2 از گیاه شنبلیله با توالی های ثبت شده در بانک ژنی نشان داد که این پپتید با پپتید مشابه از گیاهانcajanus cajan ، cicer arietinum ، medicago sativa و medicago truncatula به ترتیب 100، 100، 6/98 و 6/98 درصد تشابه را نشان می دهد.

در این مطالعه بمنظور ساخت پیشبرهای القاء شونده توسط بیمارگر ها سه عنصر کنشی سیس شامل عناصر f، e17 و d باکس به عنوان عناصر بالقوه القاء شونده توسط بیمارگر ها بر اساس مطالعات گذشته انتخاب شدند و عملکرد آنها در پاسخ به یک محرک عمومی، دو هورمون گیاهی مرتبط با سیستم دفاعی، چند بیمارگر قارچی و شرایط محیطی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور با استفاده از روش ساخت پرموترهای مصنوعی، توالی های دو نسخه ای و ترکیبی از عناصر انتخاب شده در بالادست توالی مینیمال پیشبر مربوط به camv 35s کلون گردید و سازه های pgff، pgee، pgffdd، pgffee و pgddee ساخته شدند که به ترتیب پیشبر های sp-ff، sp-ee، sp-ffdd، sp-ffee و sp-ddee را در برداشتند. همچنین پیشبر minp با ساخت سازه pgmp به عنوان کنترل منفی و سازه pgc حامل پیشبر کامل cam v35s جهت بهینه سازی مراحل آنالیز بیان تهیه شد. بمنظور بررسی عملکرد پیشبرها ابتدا پتانسیل روش اگروانیجکشن برای آنالیز بیان پیشبرها در گیاه کلزا مورد بررسی قرار گرفت. در این آزمایش ها از سازه pgc و ناقل pbi121 استفاده شد و بیان ژن gus در گیاهان کلزا، توتون و لوبیا مقایسه شد. نتایج اگروانیجکشن نشان داد سازه pgc در برگ توتون و بافت غلاف لوبیا قادر به بیان ژن gus می باشد. در این آزمایش ها بیان باکتریائی ژن gus در محل نفوذ سوسپاسیون اگروباکتریوم حامل ناقل pbi121 در برگ کلزا و لوبیا مشاهده نشد. با استفاده از روش ریزپرتابی نشان داده شد که سازه pgc قادر به بیان ژن gus در برگ کلزا می باشد. با توجه به نتایج بدست آمده نشان داده شد که سازه pgc در گیاه کلزا، لوبیا و توتون فعال است. بمنظور آنالیز عملکرد، پیشبرها بطور دائمی با استفاده از روش کوتیلدونی به گیاه کلزا منتقل شدند و تراریختی گیاهان حاصل با استفاده از آزمون pcr و بیان ژن gus تایید شد. دیسک های برگی مربوط به گیاهان تراریخت حامل پیشبرهای مختلف، جهت آنالیز عملکرد استفاده شدند. نتایج هیستوشیمیائی نشان داد پیشبرهای مورد استفاده در پاسخ به آلودگی مستقیم با قارچ های اسکلروتینیا اسکلروتیوروم، رایزوکتونیا سولانی و فوزاریوم گرامیناروم سطح بیان و القاء پذیری متفاوتی نشان دادند. مطالعات فلوریمتری نشان داد مواد آزاد شده از قارچ های مورد مطالعه نیز قدرت القاء کنندگی دارند. واکنش پیشبرها به قارچ های اسکلروتینیا و رایزوکتونیا کاملاً متفاوت بود در حالیکه در پاسخ به تیمار قارچ فورازیوم تمامی آنها القاء پذیری نشان دادند. در این بین پیشبر sp-ff به قارچ اسکلروتینیا و پیشبر sp-ee به قارچ رایزوکتونیا واکنش نشان دادند. در حالیکه پیشبرهای sp-ffee، sp-ddee و sp-ffdd در پاسخ به بیمارگر بیوتروف رایزوکتونیا القاء پذیری بالائی نشان دادند. در این مطالعه عملکرد پیشبرها در پاسخ به تیمارهای کیتین، سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات نیز مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد پیشبرهای sp-ddee و sp-ff به تیمار کیتین، sp-ddee، sp-ffee، sp-ee به تیمار سالیسیلیک اسید و پیشبرهای sp-ff، sp-ffdd و sp-ddee به تیمار متیل جاسمونات القاء پذیری بالائی نشان دادند. پیشبرهای ساخته شده در پاسخ به تیمار زخم شدگی و سرما از خود واکنش نشان ندادند، همچنین در پاسخ به تیمارهای گرما و uv عمده پیشبرها غیر فعال بودند و تنها دو پیشبر sp-ddee و sp-ffdd تاحدی القاءپذیر بودند. براساس نتایج بدست آمده میتوان نتیجه گیری کرد که در گیاه کلزا عنصر e17 تا حد زیادی با مسیرهای پیام رسانی سالیسیلیک اسید در ارتباط است در حالیکه عنصر f با مسیر پیام رسانی متیل جاسمونات ارتباط بیشتری دارد و عنصر d القاء پذیری عمومی در پاسخ به محرک های مختلف نشان داد.

سیب زمینی (solanum tuberosum l.) یکی از گیاهان زارعی مهم جهان می باشد که به عوامل بیماری-زای قـارچی از جمله rhizoctonia solani (ag-3) عامل بیماری رایزوکتـونیایی حساس می باشد. قارچ های بیماری زا یکی از مهم ترین عوامل ایجاد خسارت به محصولات زارعی می باشند. یکی از روش های کنترل بیماری های قارچی، استفاده از مهندسی ژنتیک برای انتقال ژن های رمزکننده آنـزیم های تخریب کننده دیواره سلولی قارچ ها، خصوصاً کیتینازها و گلوکانازها به گیاهان زراعی می باشد. قارچ-های آنتاگونیست مانند تریکودرما، با تولید آنزیم های هیدرولازی قدرتمند کیتیناز و گلوکاناز، اثر بازدارنده قابل توجهی بر رشد قارچ های بیماری زا دارند و در غلظت های بالا برای گیاه غیر سمی بوده و اثر مخربی بر رشد و نمو گیاهان تراریخته ندارند. آنزیم های جدا شده از گونه های مختلف این قارچ در مقایسه با آنزیم های جدا شده از منابع دیگر مثل آنزیم های گیاهی، فعالیت ضد قارچی بیشتری داشته و بر طیف وسیع تری از گونه های بیماری زا عمل می کنند. در عین حال به کار بردن هم زمان آنزیم های تخریب گر دیواره سلولی قارچ، اثر هم افزایی در مبارزه با قارچ های بیماری زا دارد. در این تحقیق، از ژن کیتیناز chit42 جدا شده از قارچ های trichoderma atroviride و ژن گلوکاناز bgn13.1 جدا شده از قارچ t. virens، جهت ساخت سازه های بیانی گیاهی شامل دو سازه تک ژنی واجد ژن chit42 (pbike1) و واجد ژن bgn13.1 (pbike2) و یک سازه واجد هر دو ژن (pbike3) استفاده شد. در این سـازه هـا، هر یـک از ژن های یاد شده، تحت کنترل پیشبر camv 35s و خاتمه دهنده نوپالین سینتاز (nos) قرار گرفتند. همچنین ناقلی با نام pbi121gus- مبتنی بر ناقل pbi121 طراحی و ساخته شد که فاقد ژن gus بوده و ضمن داشتن کاست کامل بیانی ژن مقاومت به کانامایسین، دارای دو جایگاه آنزیم های برشی xbai و bamhi برای همسانه سازی ژن های مورد نظر بین پیشبر camv 35s و خاتمه دهنـده nos مـی باشد. برای انتقال سازه های مـورد نظر به گیاه سیب زمینی، ریز غده پنج رقم مهم سیب زمینی در ایران (ساوالان، آگریا، مارفونه، ساتینا و بورن) تولید شده و سازه های واجد ژن های کیتیناز و گلوکاناز با استفاده از سویه lba4404 باکتری agrobacterium tumefaciens به برش های ریز غده (به عنوان جداکشت) منتقل شدند. حضور ژن های مورد نظر در گیاهان تراریخته و بیان آنها در سطح رونویسی به ترتیب توسط pcr و rt-pcr تایید گردید. همچنین با استفاده از روش های زیست سنجی مختلف، مشخص شد پروتئین های حاصل از بیـان ژن های منتقل شده به گیاهان تراریخته، فعالیت ضد قارچی قابل ملاحظه ای برابر r. solani (ag-3) دارند. از آنجا که در این تحقیق ناقل pbi121 که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین بر روی آن قرار دارد، جهت انتقال ژن مورد استفاده قرار گرفت، برای یافتن بهترین غلظت آنتی بیوتیک کانامایسین، رشد و مقاومت گیاهچه های سیب زمینی پنج رقم سیب زمینی مورد استفاده در غلظت های مختلف آنتی بیوتیک گزینشگر کانامایسین نیز مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاکی از رشد گیاهچه های غیر تراریخت سیب زمینی تا غلظت 100 میلی گرم در لیتر کانامایسین بود گرچه نشانه هایی از قبیل عدم گسترش مناسب اندام های هوایی، کوتاهی و نازکتر شدن ساقه گیاهچه ها، رنگ پریدگی و کاهش تعداد و ریز شدن برگ ها مشاهده گردید. بر اساس نتایج به دست آمده، ارقام ساوالان و مارفونه حساسیت بیشتری نسبت به کانامایسین داشته و رقم ساتینا مقاوم ترین رقم سیب زمینی نسبت به کانامایسین در بین ارقام مورد بررسی این پروژه می-باشد. همچنین cdna ژن های chit42 و bgn13.1 به طور جداگانه در ناقل بیانی pet-26b(+) تحت کنترل پیشبر باکتریوفاژ t7 و در پایین دست توالی راهنمای pelb همسانه سازی شدند. پس از انتقال سازه های بیانی پروکاریوتی به سویه bl21(de3) plyss باکتری escherichia coli مشخص شد که پروتئین نوترکیب chit42 در میزبان پروکاریوتی بیان شده و پس از انتقال به فضای پریپلاسمی، به محیط کشت ترشح می گردد. نتایج آزمون های مختلف نشان داد که این پروتئین نوترکیب قادر به تجزیه کیتین بوده و اثر بازدارنـده آن نیز بر رشد قـارچ r. solani (ag-3) در شرایط in vitro تایید گردید.

چکیده محصولات کشاورزی نقش مهمی در تأمین غذای جهان ایفا می کنند، رشد جمعیت دنیا و کمبود مواد غذایی باعث شده است که محققین در جستجوی روش‏های موثر برای افزایش مواد غذایی باشند. استرس های زیستی و غیرزیستی از عوامل مهم در کاهش عملکرد و تولید محصولات کشاورزی می باشند. در این میان در طول کشت گیاهان زراعی کاهش محصول ناشی از حمله قارچهای پاتوژن به گیاهان همواره به عنوان اصلی‏ترین عامل زیانهای اقتصادی محسوب می شود. چغندر قند از مهمترین گیاهان صنعتی بوده و بازده محصول تحت تاثیر بسیاری از پاتونهای قارچی به نسبت زیادی کاهش می یابد. آنزیمهای پلی گالاکتوروناز (pg) مهمترین فاکتور بیماریزای قارچهای پاتوژن هستند. بسیاری از قارچهای پاتوژن برای تخریب ترکیبات هموگالاکتورونان دیواره سلول گیاهی نیاز به تولید آنزیم pg دارند. یکی از مهمترین ژن های دفاعی گیاهان در مقابل حملات پاتوژن های قارچی از دسته ژنهای مهاری آنزیم های پکتینازی به نام پروتئین مهار کننده آنزیم پلی گالاکتوروناز(pgip) می باشند. آنزیم های پلی گالاکتوروناز pg)) توسط اغلب قارچ های فیتوپاتوژن تولید می شوند و فرمهای ایزوآنزیمی مختلفی را نشان می دهند. pgipها به علت پتانسیل برهمکنش با pgهای قارچی مهمترین فاکتور سیستم دفاعی گیاه بر علیه قارچ های پاتوژن هستند. در نتیجه این بر همکنش تجزیه پکتین دیواره سلول گیاهی کاهش می یابد و ogهای تولید شده باعت القائ سیستم دفاعی گیاه می گردند. بنابراین با بیان pgip در گیاهان تراریخت، فاکتور بیماریزای پاتوژن قارچی (pg) غیر فعال شده و رشد و توسعه آن کاهش می یابد. در این راستا ژنهای pvpgip1 و pvpgip2 که از گیاه لوبیا واریته ناز استخراج و بترتیب در وکتورهای بیانی گیاهی pbiah17 وpbiah23 کلون شده بود، در این تحقیق ضمن ساخت ژن کایمریک sp-pgip2-aaa-pgip1، این ژنها از طریق باکتریa. tumefaciens gv3101 به دو ژنوتیپ sbsi-01 و sbsi-02 گیاه چغندر قند (بصورت منفرد و توام) منتقل گردیدند. سازه واجد ژن کایمری pgip1 sp-pgip2–aaa- حاوی ژنهای pgip1 و pgip2 که بوسیله لینکر 3 اسید آمینه ای آلانین به هم متصل شده اند جهت انتقال به گیاه طراحی و ساخته شد. آنالیز های بیوانفورماتیکی نشان داد که بطور همزمان هر دو نوع پروتئین خاصیت مهاری خود را اعمال خواهند کرد. ارزیابی ساختار ثانویه mrna کایمری pgip2-aaa-pgip2 نشان داد که این ساختار، انرژی قابل قبولی برای یک mrna به منظور ترجمه در سیستم گیاهی می باشد. قبل از انتقال به چغندر قند به منظور اطمینان از ساختار سازه pbirmpp جهت بیان پروتئین کایمر sp-pgip2-aaa-pgip1 با استفاده از روش agroinfitration بصورت بیان موقت (transient) در برگ گیاه توتون بیان گردید. نتایج حاصل از انجام وسترن بلات پروتئین نشان داد که سازه pbirmpp در گیاه توتون بیان شده و پروتئین مورد انتظار در محدوده 70 کیلو دالتون قابل شناسایی می باشد. از برگ حاصل از کشت بافت جوانه رأسی جهت تراریختی استفاده شد. جهت تراریختی از دو روش پایه جوانه و ایجاد خراش با تیغ در ناحیه رگبرگ اصلی جداکشت های برگی استفاده گردید. از ژن مقاومت به کانامایسین برای انتخاب گیاهان تراریخت استفاده شد. به منظور تائید انتقال ژنهای pgip1 و pgip2 بصورت منفرد و توام به دو رقم sbsi-01 وsbsi-02 گیاه چغندر قند، از آزمون pcr و ساترن بلات استفاده گردید. با استفاده از آنالیز pcr حضور ژنpvpgip1 در 20 و 19 تا از گیاهان سبز مقاوم به کانامایسین بترتیب 4 در صد و 8/3 در صد، حضور ژنpvpgip2 در 22، 21 تا از گیاهان سبز مقاوم به کانامایسین بترتیب 4/4 در صد و 2/4 در صد، حضور ژن کایمر sp-pgip2-aaa-pgip1 در 17 و 15 تا از گیاهان سبز مقاوم به کانامایسین بترتیب 5 در صد و 5/5 در صد بترتیب در رقم های sbsi-01 و sbsi-02 تأیید گردید. جهت سنجش فعالیت مهارکنندگی پروتئین های pgip در گیاهان چغندرقند تراریخت از پلی گالاکتوروناز (pg) قارچ colletotrichum lindemuthianum برای غربال گری گیاهان تراریخت حاوی pgip1، از pg قارچ f. phyllophilum جهت غربال گری گیاهان تراریخت حاوی pgip2 و از pg قارچ f. oxysporum. f. sp. betae (fob) جهت غربال گری گیاهان تراریخت حاوی پروتئین کایمر استفاده گردید، فعالیت مهارکنندگی pgip بر علیه آنزیمهای پلی گالاکنوروناز توسط روش assay agarose diffusion سنجش گردید. پروتئین استخراج شده از گیاه غیر تراریخت (control) هیچ گونه فعالیت مهاری بر علیه fg های مورد استفاده نشان نداد. سایر گیاهان تراریخت فعالیت های مهاری متفاوتی نشان دادند. حضور ژنهای pvpgip1 و pvpgip2 با استفاده از آزمون ساترن بلات در این گیاهان مورد تائید قرار گرفت. گیاهان تراریخت pvpgip1 حاوی 2 کپی از ژن و یک گیاه حاوی 3 کپی و بقیه تک کپی بودند. و از گیاهان تراریخت pvpgip2 دو تا حاوی 2 کپی از ژن و بقیه تک کپی بودند. هیج گونه تغییراتی در فنوتیپ و نیز در رشد و نمو گیاهان تراریخت مشاهده نشد. در مطالعه دیگر ژنهای pgip1، pgip2 و ژن کایمر pgip2-aaa-pgip2 جهت مطالعات پروئینی در سیستم مخمر p. pastoris با استفاده از وکتور بیانی pgapz?a بیان گردید. بعد از تایید پلاسمید های نوترکیب pgapz?apgip1، pgapz?apgip2 و pgaprmpp با تعیین توالی، این سازه های بیانی به سلولهای مخمر p. pastoris جهت بیان منتقل شدند. پروتئین های pgip2 و موتانت های آن pgip2t37d و pgip2t177d که با استفاده از site-direction mutation تهیه شدند و پروتئین کایمر pgip2-aaa-pgip1 در سیستم p. pastoris با موفقیت بیان گردیدند. پروتئین pgip1 به دلایل نا مشخص در این سیستم بیان نشد. بیان و فعالیت پروتئین ها با استفاده از وسترن بلات و روش سنجش فعالیت مهارکنندگی agarose diffusion assay مورد بررسی و تائید قرار گرفت. تغییر اسیدآمینه t37 به d37 در موتانت pgip2t37d تاثیری در فعالیت پروتئین pgip2 نداشت ولی تغییر اسیدآمینه t177 به d177 در موتانتpgip2t177d باعث غیر فعال شدن pgip2 گردید. بنابراین می توان نتیجه گرفت که اسید آمینه t177 در ناحیه گلیکوزیلاسیون که در جایگاه فعال pgip2 قرار دارد قرار گرفته و در فعالیت پروتئین نقش کلیدی دارد.

کیتین پس از سلولز بزرگترین منبع بیومس تجدید پذیر در طبیعت می باشد. این پلیمر در ساختار پوشش خارجی (exoskeleton) حشرات، سخت پوستان و دیواره سلولی برخی از قارچ ها وجود دارد. اولین و مهمترین مرحله در تجزیه طبیعی کیتین، ترشح آنزیم های کیتینازی است. کیتینازها اتصالات n-acetylglucosamine در پلیمر تشکیل دهنده زنجیرهای کیتین را هیدرولیز می کنند. در این تحقیق به منظور افزایش کارایی آنزیم کیتیناز42 (chit42)در تجزیه ساختارهای کیتینی موجود در دیواره سلولی قارچهای پاتوژن، دومین اتصال به کیتین (chitin binding domain) به انتهای کربوکسیلی آنزیم کیتیناز 42 متصل شده و فعالیت کیتینولیتیکی آنزیم هیبرید بیان شده مورد ارزیابی قرار گرفت. کیتیناز42 و کیتیناز کایمری فعالیت مشابهی علیه کیتین کلوئیدی داشته و ثابت اختصاص برای هر یک به ترتیب 83/0 و 07/1 بر دقیقه است. دما و ph بهینه برای هر دو تقریباً یکسان می باشد. در حضور کیتین کریستالی، کیتیناز کایمری فعالیت کیتینازی بیشتری (70 درصد) و هم چنین ثابت اتصال به کیتین در مقایسه با کیتیناز42 به طور قابل توجه بالاتر می باشد. مطالعات اسپکتروسکوپی نشان می دهد که تشکیل کایمر کیتیناز با تغییراتی در ساختار آنزیم همراه می باشد که باعث کاهش ساختارهای مارپیچ آلفا در ساختمان کیتیناز کایمری می شود. مطالعات پایداری دمایی نشان می دهد که کیتیناز کایمری نسبت به کیتیناز42 از لحاظ ساختاری پایدارتر می-باشد.. در این تحقیق به منظور انتقال ژن کیتیناز کایمری به گیاه نیشکر (sugarcane) و افزایش مقاومت آن علیه آفات و عوامل بیماریزای قارچی، ابتدا کشت بافت و انتقال ژن به این گیاه بهینه شد و تأثیر پارامترهای مختلف در کشت بافت و انتقال ژن به گیاه نیشکر دو واریته cp57 و nco310 به روش بمباران ذره ای مورد بررسی قرار گرفت. هم چنین، اثرات پارامترهای فیزیکی و بیولوژیکی مختلف مانند غلظت dna ، نوع محیط اسموتیک، نوع ذره، تعداد بمباران، فاصله ذرات پرتاب شونده از بافت هدف روی بیان موقت ژن gus ارزیابی شد. بدین منظور کالوس جنین زای حاصل از کشت ریز نمونه ساقه نیشکر در محیط ms حاوی هورمون 2,4-d توسط حامل های ژنی حاوی ژن uida تحت کنترل پروموترهای camv 35s, act1 و ubi بمباران شد. به منظور بررسی انتقال ژن از تعداد لکه های آبی ظاهر شده پس از رنگ آمیزی با ماده x-gluc استفاده شد. نتایج حاصل نشان داد که شرایط بهینه بیان ژن gus در کالوس جنین زای نیشکر در واریته cp57 شامل ژن تحت کنترل پروموتر ubi، بمباران با ذرات طلا یک میکرومتر پوشانده شده با یک میکروگرم dna و با فشار psi 1100 ، شش سانتی متر فاصله ذرات پرتاب شونده از بافت هدف و در محیط اسموتیک m 2/0 مانیتول و m 2/0 سوربیتول و در واریته nco310 شامل ژن تحت کنترل پروموترact1، بمباران با ذرات طلا یک میکرومتر با 5/12 میکروگرم dna و با فشار psi 1100 ، cm 9 فاصله ذرات پرتاب شونده از بافت هدف و در محیط اسموتیک m 2/0 مانیتول وm 2/0 سوربیتول هستند. از شرایط بهینه فوق برای انتقال ژن کیتیناز کایمری به گیاه نیشکر استفاده شد و ایجاد گیاهان تراریخت با روش های مولکولی تایید و مقاومت آن ها به قارچ های بیماریزا بررسی شد. نتایج حاصل نشان می دهد که مقاومت به عوامل بیماری زا در لاین های تراریخت نسبت به گیاه کنترل بیشتر می باشد. بدین ترتیب می توان با استفاده از ژن های مهندسی مقاوم به قارچ ها، قارچ های بیماری زای را کنترل نمود.

با روند افزایشی جمعیت کره زمین، کمبود محصولات کشاورزی به یک نگرانی مهم تبدیل شده است. از جمله عوامل کاهش این محصولات عوامل بیماریزای گیاهی به ویژه حملات قارچی می باشد. گیاهان راه کارهای گوناگونی برای مقابله با عوامل بیماریزا دارند که از آن جمله می توان به پپتیدهای ضدمیکروبی اشاره کرد. در این میان پروتئین های وابسته به پاتوژن )پروتئین های (pr، دارای اهمیت ویژه ای می باشند. خانواده pr10 از مهمترین اعضای این گروه می باشد که تا کنون فعالیت های ضدقارچی، ضدباکتریایی و ضدویروسی اعضای مختلف این خانواده اثبات شده است. در این تحقیق به پروتئین pr10 ذرت پرداخته و فعالیت ضدقارچی آن بر انواع قارچ های بیماریزای گیاهی بررسی شد. بدین منظور ژن pr10 ذرت از dna ژنومی و cdna گیاه zea mays استخراج و به ترتیب در ناقل های pjet1.2 و ptz57r/t همسانه¬سازی شد. پس از تأیید همسانه¬سازی، cdna ژن pr10 توسط هضم آنزیمی از سازه نوترکیبptznz1 خارج و در ناقل بیانی پروکاریوتی pet26 b(+) زیرهمسانه¬سازی و تأیید شد. پس از انتقال سازه نوترکیب petnz1 به میزبان بیانی e. coli rosetta(de3) و e. coli bl21(de3) مراحل بهینه سازی بیان انجام و پروتئین بیان شده توسط روش وسترن بلات تأئید شد. مکان یابی پروتئین حاکی از بیان آن به صورت inclusion body بود که بر روی آن مراحل واسرشتگی، بازآرایی و دیالیز انجام شد. در نهایت با استفاده از روش کروماتوگرافی میل ترکیبی توسط ستون ni-nta، پروتئین نوترکیب pr10 تخلیص شده و غلظت آن به روش برادفورد تعیین شد. عملکرد پروتئین نوترکیب توسط آزمون هضم dna مورد ارزیابی قرار گرفت. در ادامه به منظور بررسی فعالیت پروتئین pr10 ذرت در برابر قارچ¬های بیماری¬زای botrytis cinerea، sclerotinia sclerotiorum، fusarium oxysporum، verticillium dahlia و alternaria solani، از آزمون¬های زیست¬سنجی radial diffusion assay، disk diffusion assay و spore germination assay استفاده شد. نتایج این آزمون ها حاکی از فعالیت بازدارندگی پروتئین pr10 ذرت در برابر قارچ های آزموده شده می باشد. همچنین نتیجه آزمون ایمنی زیستی همولیز حاکی از آن بود که پروتئین نوترکیب بیان شده برای سلول¬های پستانداران سمی نیست.

در این تحقیق ژن اسموتین گیاه توتون با تکنیک pcr از dna ژنومی گیاه توتون جداسازی و سپس در ناقل pjet1.2 همسانه سازی شد. صحت همسانه سازی ژن در ناقل با روش های colony pcr، هضم آنزیمی و تعیین توالی تأیید و ناقل نوترکیب حاصله pjaa-1 نام گذاری شد. ژن اسموتین پس از همسانه سازی توسط هضم آنزیمی از ناقل همسانه سازی خارج و در ناقل بیانی pet26b(+) کلون شد. صحت همسانه سازی ژن با روش های colony pcr، هضم آنزیمی و تعیین توالی تأیید و ناقل نوترکیب حاصله peaa-2 نام گذاری شد. ناقل peaa-2 به سویه های باکتریایی e. coli bl21(de3) و e. coli rosetta (de3) منتقل شد. بیان اسموتین در دو سویه فوق در شرایط مشابه انجام و با استخراج پروتئین تام سلولی و با تکنیک sds-page باند پروتئینی مورد نظر مشاهده و با تکنیک لکه گذاری وسترن تایید شد. با توجه به رشد بهتر باکتری های e. coli bl21(de3) در شرایط مشابه و سطح بالاتر بیان، این سویه برای ادامه کار استفاده شد. اثر فاکتورهای iptg، دما و زمان نمونه گیری بر روی بیان اسموتین با کمک روش تاگوچی بهینه سازی شد. نتایج به دست آمده نشان دادند که شرایط بهینه بیان دمای 33، زمان 16 ساعت و غلظت القا کننده iptg 7/0 میلی مولار است. بررسی ها نشان داد پروتئین نوترکیب بیان شده عمدتاً به شکل نامحلول اینکلوژن بادی در سلول انباشته می شود؛ لذا پس از محلول ساختن این توده ها در بافرهای حاوی مواد واسرشت ساز نظیر اوره و احیا کننده مانند مرکاپتواتانول شرایط ایجاد ساختمان طبیعی تأمین شد. پروتئین بدست آمده پس از دیالیز، توسط ستون نیکل تخلیص و غلظت آن با کمک روش برادفورد سنجیده شد. اثر اسموتین نوترکیب بر قارچ های rhizoctonia solani، botrytis cinerea، sclerotinia sclerotiorum، fusarium oxysporum، verticillium dahliae و alternaria solani توسط روش های radial diffusion، disk diffusion و spore germination بررسی و مشاهده شد که این پروتئین رشد قارچ های فوق را مهار می کند. از این رو می توان نتیجه گرفت که پروتئین مزبور در سیستم پروکاریوتی به صورت فعال بیان می شود و می تواند رشد قارچ را مهار کند.

در این تحقیق به منظور افزایش میزان فعالیت بیوکنترلی قارچ t. harzianum بعنوان یکی از مهمترین عوامل آنتاگونیست بیمارگر های گیاهی، مهندسی پروتئین آنزیم کیتیناز 42 انجام شد. در راستای افزایش فعالیت کیتینازی آنزیم کیتیناز 42 بر روی ساختارهای کیتین تشکیل دهنده دیواره سلولی قارچ ها سه راه کار اصلی به کار گرفته شد. روش اول افزایش تعداد ژن کیتیناز 42 در قارچ t. harzianum بود. در روش دوم chbd آنزیم کیتیناز 18-10 از قارچ t. atrovirideجداسازی شد و توسط لینکر به انتهای آمینی کیتیناز42 بعد از ناحیه سیگنال پپتید اضافه شد و کیتیناز کایمر حاصل به قارچ t. harzianumانتقال یافت. در روش سوم chbd آنزیم کیتیناز chi1 از قارچ r. oligosporus گرفته شد و با لینکر به انتهای کربوکسیلی کیتیناز42 افزوده شد و سپس به قارچ t. harzianum انتقال یافت. پس از مطالعات بیوانفورماتیکی و بررسی اثر افزودن chbd روی ساختار دوم و سوم آنزیم های کایمری حاصل، ساختار های ژنی دو بخش کیتیناز42 و chbd تکثیر و به کمک soeing pcr به هم متصل شدند. صحت ساخت ژن های کایمری نوترکیب با روش های مولکولی تایید و سپس توالی یابی شدند. سپس ژن های کیتینازکایمری و کیتیناز42 در سازه بیانی همسانه سازی شدند. شرایط بهینه برای تولید پروتوپلاست (/ml108×5) بعنوان سلول های مستعد دریافت ژن مورد مطالعه قرار گرفت که، عبارت بود از استفاده از ریسه های 5 روزه، سن 24 ساعت برای سوسپانسیون کنیدیایی، بکارگیری آنزیم با غلظت mg/ml 6/6 در دمای °c30 و زمان دو ساعت برای انکوبه شدن در محلول آنزیمی. بهترین شرایط انتقال هم زمان دو ژن به پروتوپلاست ها هنگامی بود که ?l 16(?g 10dna) از هر ناقل با?l 330 پروتوپلاست مخلوط گردید. سپس ژن های کیتیناز کایمری(chit42-chbd و chit42rchbd) و کیتیناز42 پس از همسانه سازی در ناقل بیانی، به پروتوپلاست های قارچt. harzianum منتقل شدند. بیان ژن های مورد نظر پس از تائید مولکولی، بوسیله real time rt-pcr بررسی شد. فعالیت آنزیمی برای جدایه های تراریختی که ژن کیتیناز کایمر (chit42-chbd) را دریافت کرده بودند u/ml 86/1 تا u/ml2/6 و برای جدایه های تراریخت با کیتیناز42، بین u/ml 16/1 تا u/ml 15/3 بود. میزان میانگین بازدارندگی هفت بیمارگر مهم گیاهی، بوسیله جدایه های تراریخت chit42-chbd بین 6/31 تا 6/88 درصد بود که در مقایسه با نمونه غیر تراریخت، کنترل (5/49-10درصد) و جدایه های تراریخت با ژن کیتیناز42 (4/63-7/24 درصد) اختلاف چشمگیری نشان داد. جدایه chit42-chbd15 بیشترین میزان بازدارندگی در برابر هفت بیمارگر را از خود نشان داد. همچنین فعالیت آنزیمی جدایه های تراریختی که دومین ژن کیتیناز کایمر(chit42rchbd) را دریافت کرده بودند u/ml 76/1 تا u/ml1/4 و برای جدایه های تراریخت با کیتیناز42، u/ml 16/1 تا u/ml 01/3 بود. میزان میانگین بازدارندگی هفت بیمارگر گیاهی، بوسیله جدایه های تراریخت chit42rchbd بین 7/30 تا 7/69 درصد بود که در مقایسه با نمونه غیر تراریخت، کنترل (49-12درصد) و جدایه های تراریخت با ژن کیتیناز42 (5/62-24 درصد) اختلاف نشان داد. در این گروه، جدایه chit42rchbd3 بیشترین میزان بازدارندگی در برابر هفت بیمارگر را از خود نشان داد. مجموع یافته ها نشان داد که جدایه chit42-chbd15 دارای بیشترین توان بیوکنترلی در بین کلیه جدایه ها است. حفظ توان بیوکنترلی جدایه ها توسط میکروسکوپ الکترونی نیز مورد بررسی و تائید قرار گرفت. یافته های این تحقیق نشان داد که بیان ژن های کیتیناز کایمر در قارچ t. harzianum سبب افزایش توان بیوکنترلی آن شده و جدایه های تریکودرما حاصل می توانند بعنوان بیوکنترل در برابر بیمارگر های مهم کشاورزی مورد استفاده قرارگیرند.

هر روز میزان استفاده از سوخت های فسیلی و بهای آن افزایش و منابع آن کاهش می یابد. به همین علت استفاده از منابع تجدیدپذیر انرژی و تولید سوخت های زیستی(بیواتانول) مورد توجه قرار گرفته است. یکی از مناسب ترین مواد اولیه برای تولید سوخت های زیستی ترکیبات سلولزی می باشد. از مهمترین میکروارگانیسم های تولید کننده ی آنزیم سلولاز قارچ trichoderma reesei می باشد. کمپلکس سلولازی شامل 3 آنزیم اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز و بتا-گلوکوزیداز می باشد. آنزیم اندوگلوکانازii از کلیدی ترین آنزیم های این کمپلکس و آغازگر حمله به زنجیره سلولزی است. در این تحقیق جهت بیان مناسب آنزیم نوترکیب، ژن جدیدegii بر اساس ترجیح کدونی مخمر پیکیاپاستوریس و هانسنولا پلی مورفا سنتز شد. تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم اندوگلوکاناز نوترکیب نشان دهنده بهینه فعالی در دمای ?c75 و 8/4=ph بود. با بهینه سازی شرایط بیان آنزیم از جمله دمای بیان، ph بیان، غلظت متانول و ترکیبات محیط کشت میزان بیان آنزیم به u/ml 2359 افزایش یافت. در ادامه جهت بهبود خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم از جمله فعالیت آنزیمی و مقاومت حرارتی آنزیم از روش مهندسی پروتئین و جهش زایی هدفمند استفاده گردید. در مقایسه ساختار آنزیم اندوگلوکاناز t. reesei با آنزیم مقاوم به حرارت thermoascus aurantiacus مشخص گردید که 2 باند دی سولفیدی مهم در آنزیم مقاوم به حرارت حذف شده است؛ بنابراین با ایجاد 2 جهش جداگانه c169v و c393h دو باند دی سولفیدی از ساختار پروتئینی آنزیم اندوگلوکاناز t. reeseiحذف گردید. بررسی خصوصیات بیوشیمیایی نشان داد که میزان ثابت ویژگی در دو آنزیم جهش یافته egii-c169v و egii-c393h نسبت به آنزیم فاقد جهش به ترتیب 9/1 و 6/1 برابر افزایش یافته است و همچنین میزان پایداری حرارتی هر دو آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم فاقد جهش بیش از 2 برابر افزایش نشان می دهد. به نظر می رسد با توجه به فعالیت آنزیمی و مقاومت حرارتی بالا ، اندوگلوکانازهای مهندسی شده پتانسیل مناسبی جهت استفاده در صنعت بیواتانول را دارا باشند.

دفنسین ها می توانند بعنوان عوامل ضد قارچی در کنترل قارچ های بیماریزای گیاهی مورد استفاده قرار گیرند. بدین منظور cdna ژن دفنسین گیاه شنبلیله بعد از تایید، در ناقل همسانه سازی pjet1.2 زیرهمسانه سازی شد. پس از تأیید همسانه سازی این ژن، از سازه نوترکیبpjetsh1 خارج و در ناقل بیانی پروکاریوتی pet26 b(+) همسانه سازی و تأیید شد. پس از انتقال سازه نوترکیب جدید به نام petsh1 به میزبان بیانی e. coli bl21(de3) مراحل بهینه سازی بیان به وسیله تست تاگوچی انجام و پروتئین بیان شده به وسیله روش وسترن بلات تأیید شد. در نهایت با استفاده از روش کروماتوگرافی میل ترکیبی به وسیله ستون ni-nta، پروتئین نوترکیب tfgd2 تخلیص شده و غلظت آن به روش برادفورد تعیین شد. در ادامه به منظور بررسی فعالیت پروتئین tfgd2 در برابر قارچ های بیماری زای sclerotinia sclerotiorum، fusarium oxysporum، verticillium dahlia و alternaria solani ، از آزمون های زیست سنجی radial diffusion assay، disk diffusion assay و رنگ آمیزی sytox green و تست مورفولوژی(clean slide culture ) استفاده شد. نتایج این آزمون ها حاکی از فعالیت بازدارندگی پروتئین دفنسین گیاه شنبلیله در برابر قارچ های مورد بررسی می باشد.

به منظور مطالعه عملکرد آنزیم کیتیناز کایمری42 که یک دمین متصل شونده به کیتین از منشأ کیتیناز قارچ t. atroviride18.10 به انتهای آمینی آن افزوده شده است، این آنزیم در میزبان پروکاریوتی بیان گردید و فعالیت ضد قارچی آن بر برخی از قارچ های بیماریزای گیاهی مورد مطالعه و بررسی قرار گرفت.

پژوهش حاضر با هدف شناسایی توالی ژن laea، که یکی از اجزای کمپلکس ولوت می باشد، در قارچ p. brevicompactum انجام می شود. ابتدا ژن پروتئین laea با استفاده از روش tail-pcr شناسایی شده، سپس بررسی های بیوانفورماتیکی با استفاده از نرم افزارهای موجود در داده پایگاه های مختلف بر روی توالی بدست آمده انجام می گردد.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.

بیماری های قارچی از بزرگترین عواملی هستند که باعث افت شدید عملکرد در محصول می شوند. در این تحقیق بهینه سازی کشت بافت و شرایط انتقال ژن به گیاه کلزا لاین r line hyola 308 انجام پذیرفت. در بهینه سازی کشت بافت با انتخاب غلظت mg/l bap5/3 میزان باززایی به 112 درصد رسید. سه پارامتر مهم در انتقال ژن توسط آگروباکتریوم شامل زمان پیش کشت، زمان هم کشتی و غلظت استوسیرینگون مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از ژن gus که در وکتور pbi121 تحت بیان پروموتر camv 35s بود شرایط بهینه برای انتقال ژن بدست آمد. با بهینه سازی زمان پیش کشت به 48 ساعت، زمان هم کشتی باآگروباکتریوم به 48 ساعت و غلظت استوسیرینگون به 100 میکرومول میزان انتقال ژن از حد پایه 4 درصد به 33 درصد افزایش یافت. در مرحله بعد ژن کیتیناز36 همسانه سازی شده دروکتور pbi121 (pbimy3)، از طریق آزمون pcr و الگوی هضم آنزیمی مورد تأیید قرار گرفت. این پلاسمید نوترکیب به دو لاین r line hyola308 و rgs003 از طریق انتقال بوسیله آگروباکتریوم منتقل گشت. به منظور انتقال ژن به گیاه کلزا از برگ های لپه ای گیاهان 5 روزه با طول دمبرگی حدود 2 میلیمتر که جوانه انتهایی آنها به طور کامل حذف گردیده بود استفاده گردید. نمونه ها به محیط انتخابی حاوی کانامایسین و سفاتوکسیم منتقل گشتند. گیاهان تراریخت به علت وجود ژن مقاومت به کانامایسین می توانستند در این محیط تشکیل نوساقه های سبز رنگ دهند. حضور ژن کیتیناز 36 در گیاهان بدست آمده با استفاده از آزمون pcr با آغازگرهای اختصاصی chit36f/chit36r، rt-pcr، آزمون لکه گذاری dna، آزمون زیست سنجی و آزمون مطالعه فعالیت آنزیمی علیه قارچsclerotinia sclerotiorum اثبات گردید.