در این مطالعه ژن کد کننده sox2 در وکتور بیانی paav-mcs کلون شده سپس این سازه به سلول های hek293a ترانسفکت می شود سپس ویروس های تولید شده جمع آوری شده و به سلول های rpe اینفکت خواهد شد و توانایی تولید سلول های پیش ساز عصبی از سلول های اپیتلیالی رنگدانه دار بررسی خواهد شد.

بیماری هموفیلی b، بصورت مغلوب وابسته به جنس به ارث می رسد و فراوانی آن در جمعیت مردان 30000/1 می باشد. فقدان و یا نقص در عملکرد پروتئین فاکتور9 در پلاسما منجر به این بیماری می گردد. سلولهای کبدی به عنوان جایگاه اصلی تولید فاکتور 9 انعقادی، میزبان مناسبی جهت بررسی بیان فاکتور 9 قلمداد می شوند. جهت بیان اختصاصی در سلولهای کبدی، به توالی های تنظیمی اختصاصی کبدی نیاز است. در این ارتباط تلفیقی از توالی افزاینده آلدولاز b کبدی رت با پروموتر اختصاصی کبدی آلفا-1 آنتی تریپسین و با پروموتر cmv جهت ساخت پلاسمیدهای غیر ویروسی به منظور بیان فاکتور 9 در سلولهای کبدی انجام پذیرفت. سپس کارائی پلاسمیدهای ساخته شده در سلولهای مقاوم hepg2 توسط آزمون الایزا بر روی محیط کشت و درون سلولهای نوترکیب و آزمون نیمه کمی rt-pcr بررسی گردید. توالی افزاینده آلدولازb ، عملکرد هر دو پروموتر اختصاصی کبدی و غیر اختصاصی را به ترتیب 8 و 3 برابر بهبود بخشید. بالاترین بیان فاکتور 9 از تلفیق توالی افزاینده آلدولاز b با پروموتر ویروسی cmv حاصل گردید که بالاترین تجمع فاکتور9 در درون سلول نیز از این سازه ژنی بدست آمد. بنابراین، توالی افزاینده آلدولاز کبدی به عنوان یک توالی تنظیمی سیس مناسب جهت بیان پروتئین های مختلف در هپاتوسیتها پیشنهاد می گردد. با توجه به نقش و عملکرد اینترون ها در مراحل پس از رونویسی، در نسل دوم پلاسمیدهای نوترکیب، اینترون های 1، 2 بتا گلوبین انسانی بطور جداگانه و بطور همزمان در موقعیت مشابه در cdna فاکتور9 قرار داده شدند. همچنین، جهت افزایش کارائی ترجمه، توالی کوزاک قبل از شروع کدون ترجمه در سازه های ژنی ساخته شده قرار داده شد. استفاده از اینترون های بتا گلوبین در cdna فاکتور9 بیان این پروتئین را کاهش داد. این کاهش بیان را می توان با احتمال، به اسپلایسینگ نادرست اینترون های بتا گلوبین در cdna فاکتور9 نسبت داد.

افزایش کارآیی فرآیند ترشح بوسیله طراحی و یا انتخاب یک پپتید نشانه مناسب، می تواند به عنوان راهکاری جدید برای افزایش بیان پروتئین های نوترکیب در سامانه های بیانی هترولوگ مورد استفاده قرار گیرد. در ارتباط با بهینه سازی بیان فاکتور 9 انعقادی انسانی در رده های سلولی پستانداران، اثر پپتید نشانه های پروتئین های لوسیفراز از جاندار دریایی به نام gaussia princeps در مقایسه با عملکرد پپتید نشانه بومی فاکتور 9 انسانی و فاکتور انعقادی 7 انسانی بر تولید و ترشح فاکتور 9 مورد مطالعه قرار گرفت. بر مبنای بررسی های نرم افزاری برای پردازش پپتید نشانه های بکار گرفته شده و بهینه سازی توالی کننده پپتید نشانه لوسیفراز، سازه های حاوی توالی رمز کننده این پپتید نشانه ها به همراه ناحیه رمز کننده فاکتور 9 طراحی و ساخته شد. پس از انتقال سازه های نوترکیب به سلول های سلول های hek-293t و cho-k1 به ترتیب برای بیان گذرا و پایدار، حضور فاکتور 9 انسانی در محیط های کشت هر یک از آن ها در زمان های مختلف بعد از ترانسفکشن با روشهای الایزا، تست انعقادی مورد بررسی قرار گرفت. فرآیند رونویسی از سازه های مختلف در هر یک از حالات بیانی گذرا و پایدار با روش rt-pcr مورد تائید قرار گرفت. در مجموع، هم در شرایط گذرا و هم شرایط پایدار پپتید نشانه های گرفته شده از لوسیفراز gaussia princeps و فاکتور 7 انسانی، در مقایسه با پپتید نشانه بومی فاکتور 9، در شرایط یکسان، کارآیی بالاتری را برای ترشح فاکتور 9 انسانی نشان دادند. در عین حال بیشترین سطح بیان فاکتور 9 زمانی بدست آمد که پپتید نشانه لوسیفراز در حالت گذرا مورد استفاده قرار گرفت. از نتایج بدست آمده میتوان برای بهبود بیان/ترشح فاکتور 9 در سامانه های بیانی مختلف بهره برد.

نقص در فاکتور? انعقادی شایعترین عامل در بیماری هموفیلی b است. در حال حاضر بیماران هموفیلی b با روش جایگزین درمانی با پلاسمای ذخیره شده یا فاکتور ? نوترکیب مورد مداوا قرار می گیرند. گاما کربوکسیلاسیون گلوتامیک اسیدهای ناحیه ی gla فاکتور ? که توسط آنزیم گاماکربوکسیلاز انجام میگیرد به عنوان یکی از تغییرات بعد از ترجمه کلیدی برای فعالیت بیولوژیک این پروتئین ضروری است و همواره باید در هنگام تولید فاکتور9 نوترکیب مورد توجه قرار گیرد. توانایی بالقوه mirnaهای مصنوعی بیان شونده در درمان بیماری ها را باید منتسب به توانایی آنها در برش اختصاصی rnaی هدف آنها دانست. این نوع rnai (mirnai)، مزایای اصلی هر دو نوع sirna و mirna که به ترتیب هدف گیری اختصاصی و بیان دائم باشند را داراست. با در نظر گرفتن نقش باز دارندگی کالومنین بر روی گاماکربوکسیلاز، در این پژوهش ضمن طراحی دو mirna مصنوعی اینترونی بر علیه کالومنین، تاثیر آن بر بیان فاکتور 9 انسانی مورد بررسی قرار گرفته است. توالی رمز کننده ی mirna های مصنوعی ضد کالومنین در اینترون 1 کوتاه شده فاکتور 9، با اثر افزایندگی، در بالادست cdna ی فاکتور 9 انسانی قرار داده شد. پس از بررسی توالی ژن کالومنین انسان و همردیفی 6 واریانت آن دو sirna علیه توالی حفظ شده از این ژن طراحی شد و عملکرد هر یک از آنها در چارچوب یک mirna ی طبیعی، بنام mir-30a در داخل اینترون کوتاه شده 1 فاکتور 9 با بهره گیری از روش های نرم افزاری مورد پیش ‍ بینی قرار گرفت. توالی های طراحی شده طوری در نظر گرفته شدند تا در پردازش اینترون و تولید و بالغ شدگی mirna خللی وارد نگردد. پس از سنتز توالی رمز کننده دو mirna با نام های mir6 و mir5 که در اینترون 1 کوتاه شده فاکتور 9 قرار گرفته بودند، قطعه های مزبور با روش های مولکولی در ناحیه بالادست cdna فاکتور 9 در یک وکتور بیانی مجهز به پروموتر cmv قرار داده شد. پس از بررسی صحت مراحل همسانه سازی، پلاسمید های نوترکیب به صورت موقت به سلول های hek293t منتقل شدند و در ادامه میزان بیان ژن های کالومنین و فاکتور 9 انسانی در سلول های ترانسفکت شده در سطح رونویسی با روشreal-time pcr مورد بررسی قرار گرفت. نتایج اولیه بدست آمده از بررسی سلول های ترانسفکت شده با سازه های حاوی mir6 دلالت بر تولید mirnaی بالغ داشت اما کاهش بیان کالومنین مشاهده نشد که علت آن می تواند اشباع شدن exportin 5 بخاطر ازدیاد mirna های بیان شده باشد. با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد که mirnaی مصنوعی با اسکلت mir-30a بتواند از متن یک اینترون خارج شده و مراحل بلوغ را طی کند. علاوه بر این بیش بیان فاکتور ? نیز در این سلول ها در مقایسه با سلول های کنترل مشاهده شد که نشانگر پردازش کامل اینترون معرفی شده بود. به این ترتیب، علاوه بر تایید فراوری صحیح mirna مصنوعی بیان شده، کاربرد دوگانه اینترون شامل عملکرد ذاتی آن در بیان ژن مربوطه و نقش آن در حمل و تولید mirna مصنوعی مورد تایید قرار گرفت.

هموفیلی b یا کریسمس از بیماریهای مسیر انعقادی است که درنتیجه اختلال یا کمبود فاکتور9 حاصل میشود. درمان این بیماری مانند بسیاری از بیماری های سیستمیک دیگر به روش جایگزین درمانی انجام می گیرد. فاکتور 9 در طی مراحل بلوغ خود متحمل برخی تغییرات پس از ترجمه می شود. از جمله این تغییرات کربوکسیله شدن 12 اسید آمینه گلوتامیک اسید است. کربوکسیلاسیون توسط آنزیم گاما کربوکسیلاز در شبکه آندوپلاسمیک انجام می شود. عموما فاکتور 9 انسانی نوترکیب بیان شده در رده های سلولی پستاندار بطور مناسب گاماکربوکسیله نمی شوند. تحقیقات نشان داده است که پروتئین چپرونی بنام کالومنین مهار کننده گاماکربوکسیلاز است. به نظر میرسد که با کاهش بیان کالومنین بتوان بیان فاکتور 9 نوترکیب را در سلول های پستاندار از نظر کیفی و کمی اصلاح نمود. rnai یک راهبرد شناخته شده برای خاموش سازی ژن هاست. در این راستا میکروrna ها (mirna)، به عنوان rna های کوچک غیر کد کننده از جمله مرکزی ترین عوامل تنظیم کننده بیان بسیاری از ژن ها محسوب می شوند. این عمل تنظیمی بر پایه جفت شدن توالی های 2-8 نوکلئوتیدی (ناحیه seed) mirna بالغ با mrna هدف است که موجب سرکوب ترجمه و یا تخریب mrna و در نتیجه کاهش بیان می شود. لذا به نظر میرسد که برای کاهش اختصاصی و دائمی بیان یک ژن ، استفاده ازmirna مصنوعی روش مفیدی باشد. با توجه به نقش باز دارندگی کالومنین بر روی گاماکربوکسیلاز، در این تحقیق یک اینترون نوترکیب دارای mirna مصنوعی (ضد کالومنین) را در پایین دست cdnaی فاکتور 9 قرار داده و تاثیر آن بر بیان ژن کالومنین و همچنین فاکتور 9 نوترکیب در سلول های پستانداران مورد مطالعه قرار گرفت. در این تحقیق اثر دو sirna ضد کالومنین انسانی که در جایگاه mirna ی بالغ در چارچوب یک mirna ی طبیعی در داخل اینترون 1کوتاه شده فاکتور 9 در موقعیت 3’utr در یک وکتور بیانی جاسازی شده بودند، بر بیان کالومنین و همینطور بیان فاکتور 9 انسانی نوترکیب در یک رده سلولی پستاندار مورد مطالعه قرار گرفت. به این منظور پس از انتقال پلاسمید های نوترکیب به سلول های hek293t ، میزان بیان ژن های کالومنین و فاکتور 9 انسانی با روش real-time pcr و میزان فاکتور 9 نوترکیب بیان شده با الایزا مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدست آمده از سلول های ترانسفکت شده با سازه های حاوی mirna ها کاهش بیان کالومنین (ناک دان بیش از 99 درصد) را نشان داد. با بهره گیری از روش pcr با استفاده از پرایمر های stem-loop وجود mirna های بالغ طراحی شده بر ضد کالومنین نشان داده شد. این نتایج نشان داد که mirnaهای مصنوعی از متن اینترون خارج شده و پس از طی مراحل بلوغ عمل مهاری خود بر روی ژن هدف بطور موفق انجام داده اند. بیش بیان فاکتور ? درسلول های دارای سازه اینترون دار در مقایسه با سلول های کنترل مشاهده نشد.

چکیده در این تحقیق فاکتورهایی موثر بر بیان پروتئین هورمون رشد انسانی در فضای پری پلاسمی 5 سویه باکتری e. coli با پروموتورها و ساختارهای متفاوت ژنتیکی مورد ارزیابی قرار گرفت. انتخاب یک سویه برتر از بین 5 سویه مذکور بر اساس سه فاکتور: سرعت رشد، پایداری پلاسمید و میزان بیان انجام شد. سویه برگزیده در آزمایشات بهینه سازی جهت بیشینه سازی رشد و تولید هورمون رشد انسانی در فلاسک و کشت ناپیوسته در بیوراکتور استفاده شد. برای غربال فاکتورهای موثر در بیان پری پلاسمی هورمون رشد انسانی از طراحی آماری آزمایشات استفاده شد. فاکتور های با اهمیت شامل دمای تخمیر، غلظت iptg به عنوان القا کننده، زمان پس از القا و od کشت در لحظه القا بودند. داده های حاصل از تاثیر فاکتور های مختلف با استفاده از یک طرح آزمایشی کسری از فاکتویل در دو سطح مورد ارزیابی قرار گرفت. کلیه متغیر های آزمایشی از لحاظ آماری معنادار تشخیص داده شدند. زمان پس از القا به عنوان مهمترین فاکتور در تولید پری پلاسمی هورمون رشد انسانی شناخته شد. انتخاب محیط مناسب بر اساس قابلیت بافر کنندگی محیط کشت، سرعت رشد ویزه و کیفیت ظاهری محیط کشت از لحاظ تشکیل رسوب صورت گرفت. در استفاده از گلوکز به عنوان منبع کربن مکانیسم محرومیت القا کننده در سویه شناسایی شد. با جایگزینی گلیسرول به عنوان منبع کربن این محدودیت بر طرف شد. در ارزیابی سویه در کشت ناپیوسته با استفاده بیوراکتور bioflo3000 استراتژی القا تعیین شد و با استفاده از نتایج قبلی بهره دهی حجمی معادل با mgl-1 68 حاصل شد.

چکیده: فاکتور 9 انعقادی انسان (hfix) که نقص یا کمبود آن منجر به هموفیلی نوع b می شود، به عنوان یک پروتئین وابسته به ویتامین k (vkd)، گاماکربوکسیلاسیون تعدادی از گلوتامیک اسیدهای دمین gla برای فعالیت زیستی آن ضروری است. سلول پستاندار که به عنوان بهترین میزبان تولید پروتئین های نوترکیب دارویی انسان شناخته می شود، از ظرفیت کافی برای گاماکربوکسیلاسیون کامل پروتئین بیش بیان شده برخوردار نیست. بنابراین، گاماکربوکسیلاسیون عامل محدود کنندهی تولید hfix به شمار می رود.

فاکتور 9 انسانی، نقش محوری در مسیر انعقاد خون ایفا می کند و متحمل چندین نوع تغییر پس از ترجمه می گردد، که در میان آنها گاماکربوکسیلاسیون برای فعالیت فاکتور 9 ضروری است. گزارشات قبلی نشان دادند که تعویض پروپپتید در پروتئین های وابسته به ویتامین k با پروپپتید پروترومبین انسانی که گرایش کمی به آنزیم گاماکربوکسیلاز دارد سبب افزایش گاماکربوکسیلاسیون در رده سلولی hek293 شد. این احتمال وجود دارد که پروپپتید که بلافاصله پس از پپتید نشانه است، تاثیر زیادی در ترشح پروتئین نیز داشته باشد. در این مطالعه، با هدف بهبود کارایی گاماکربوکسیلاسیون و ترشح فاکتور 9 نوترکیب، جایگزینی توالی پری پروی فاکتور 9 انسانی با توالی های پری پروی دو پروترومبین پستاندار در نظر گرفته شد. مقایسه اولیه پروترومبین های چندین پستاندار نشاندهنده شباهت زیاد بین پروترومبین انسانی و خوکی بود. همچنین، مطالعات رایانه ای کارایی ترشح بالاتری را برای پپتیدهای نشانه مشتق از پروترومبین در مقایسه با پپتید نشانه بومی فاکتور 9 پیشگویی کرد. بنابراین، پس از جایگزینی پری پروپپتید فاکتور 9 با پری پروپپتید پروترومبین های انسانی و خوکی، عملکرد آنها بر بیان فاکتور 9 در حالت های گذرا و پایدار در رده سلولی hek293 بررسی شد. ارزیابی بیان پروتئین در حالت گذرا نشان داد که بیشترین و کمترین میزان کارایی ترشح بترتیب متعلق به پپتیدهای نشانه پروترومبین خوکی(91%) و بومی فاکتور 9(86%) است. نتایج حاصل از فعالیت انعقادی فاکتور 9 بیان شده توسط دو سازه مجهز به پروترومبین های خوکی(mu/ml180) و انسانی(mu/ml160) افزایش 10 و 9 برابری را بترتیب نسبت به سازه بومی فاکتور 9(mu/ml 18) نشان دادند. بررسی های کمی در سطح رونویسی نیز نشان دهنده افزایش معنی دار دو سازه هترولوگ بود که نتایج حاصل از بررسی ساختار ثانویه mrna با محاسبه کمترین مقدار انرژی آزاد موید آن بود. پس از انجام ترانسفکشن در حالت پایدار، مقدار فاکتور 9 بیان شده توسط کلون pprot-hfix افزایش معنی داری نسبت به دو سازه دیگر نشان داد(ng/ml/106 cell2000). علاوه بر افزایش بیان، سازه pprot-hfix کارایی ترشح بالاتری(98%) نیز نشان داد که با نتایج حاصل از بیان گذرا مطابقت داشت. پس از آن، محیط های جمع آوری شده از کشت های پایدار سه گانه برای جداسازی پروتئین فاکتور 9 با روش کروماتوگرافی تبادل یونی تخلیص شدند.

هورمون محرک فولیکولی (fsh) یک هورمون گلیکوپروتئینی است که از غده ی هیپوفیز پیشین ترشح می شود. این هورمون با تحریک تخمک گذاری در زنان و کمک به روند اسپرماتوژنز در مردان نقش مهمی را در تولیدمثل و باروری ایفا می کند. امروزه به علت خلوص بالا و ایمن بودن پروتئین های نوترکیب، تنها از این نوع fsh برای مصارف درمانی استفاده می شود. با توجه به پایین بودن میزان بیان پروتئین ها در لاین های سلولی پستانداران و به منظور افزایش بیان آن ها، از روش های مختلفی استفاده می شود که یکی از آن ها تغییر کدون های ژن مزبور با کدون های رایج در سلول های میزبان است. در این مطالعه کدون های توالی زنجیره بتای هورمون fsh انسانی، با توجه به codon usage سلول های تخمدان همستر چینی (cho)، بهینه و به همراه زنجیره آلفای fsh به درون سلول هایcho ترنسفکت شد. سپس با استفاده از تکنیک هایsds-page و وسترن بلاتینگ بیان پروتیئن fsh در سلول ها تایید و درنهایت از طریق تکنیک الایزا میزان بیان آن سنجیده شد. نتایج این پروژه حاکی از آن است که تغییر کدون های ژن زیرواحد بتای fsh انسانی مطابق با کدون های رایج در سلول های cho، منجر به افزایش چشمگیری در تولید پروتئین نوترکیب fsh می گردد. بنابراین روش فوق روش مناسبی جهت بهینه سازی بیان ژن محسوب می شود.

چکیده ندارد.

عامل تحریک کننده رده گرانولوسیت -ماکروفاژ ‏‎(gm-csf)‎‏یکی از عوامل رشد خونساز و تنظیم کننده خونسازی می باشد که تولید و فعال سازی گرانولوسیت ها و ماکروفاژها را از سلول های پیش ساز کنترل می نماید.‏‎gm_csf‎‏ کاربردهای دارویی متعددی دارد و به دلیل برخی محدودیت ها در بدست آوردن این پروتئین از منابع طبیعی ، تولید آن در سیستم های بیان ژنی هم ساخت ترجیح داده می شود.به منظور مطالعه بیان پری پلاسمی ‏‎gm_csf‎‏ انسانی در ‏‎‏‎e.coil‎‏ ، ‏‎dna‎‏ ی ‏‎hgm-csf‎‏ به داخل دو پلاسمید بیان کننده که دارای ترادف نشانه ‏‎pelb‎‏بوده و یکی مجهزبه پروموتر ‏‎t7‎‏و دیگری مجهز به پروموتر ‏‎lac‎‏بود وارد گردید.‏‎cdna‎‏ ی ‏‎hgm_csf‎‏ با روش ‏‎pcr‎‏و با استفاده از دو آغازگر اختصاصی که با یکی از جایگاهای برش ‏‎ncol‎‏ یا ‏‎bamhi‎‏در انتها ‏‎3‎‏ آنها طراحی شده بودند تکثیر شد.الگوی پروتئینی به دست آمده از کل سلول سیتوپلاسم و پری پلاسم ( تهیه شده با شوک اسمزی ) باکتریهای نوترکیب ، نشان داد که ‏‎rhgm_csf‎‏ در فضای پری پلاسمی تجمع می یابد که توسط ترادف نشانه ‏‎pelb‎‏ هدایت می شود.نتایج نشان دادند که سطح بیان ‏‎rhgm+csf‎‏تحت کنترل پروموتر ‏‎‏‎t7‎‏ می تواند به حدود 43 درصد کل پروتئین باکتریایی برسد که بسیار بالاتر از سطح بیان ‏‎hgm_csf‎‏ تحت کنترل پروموتر ‏‎lac‎‏ می باشد.

عامل تحریک کننده رده گرانولوسیت-ماکروفاژ ‏‎gm-csf‎‏ یکی از عوامل رشد خونساز و تنظیم کننده خونسازی می باشد که تولید و فعالسازی گرانولوسیت ها و ماکروفاژها را از سلول های پیشساز کنترل می نماید.‏‎gm-csf‎‏ کاربردهای دارویی متعددی دارد و به دلیل برخی محدودیت ها در به دست آوردن این پروتئین از منابع طبیعی ، تولید آن در سیستم های بیان ژن غیرهمساخت ترجیح داده می شود. به منظور مطالعه بیان ‏‎gm-csf‎‏ انسانی تحت القا حرارتی ، با استفاده از پلاسمید پرنسخه ‏‎pbc(sk)‎‏ و با هدف معرفی یک سیستم بیان کننده جدید براساس القا حرارتی ، وکتور بیان کننده ای با بهره گیری از پروموتر ‏‎

انتقال پروتئین های نوترکیب به فضای پریپلاسمی باکتری اشریشیاکلی، در بسیاری از موارد از جمله پروتئین های دارویی نسبت به بیان سیتوپلاسمی ارجحیت دارد. در این تحقیق ضمن طراحی و ساخت دوپلاسمید نوترکیب ، تولید، پردازش و انتقال هورمون رشد انسانی نوترکیب به فضای پریپلاسمی باکتری اشریشیاکلی توسط دو توالی نشانه مجزا تحت کنترل پروموترهای ‏‎t5‎‏ و ‏‎pl‎‏لاندا مورد مطالعه قرار گرفت.نتایج این بررسی نشان داد به منظور دستیابی به شرایط بهینه بیان پریپلاسمی هورمون رشد انسانی، سازه های نوترکیب ، قابلیت بیان هورمون رشد انسانی و انتقال آن به فضای پریپلاسمی را در شرایط القایی 0شیمیایی و حرارتی ) دارا می باشند، اما کارایی پپتید نشانه ‏‎peib‎‏ چه در سیستم القا شیمیایی و چه در سیستم القا حرارتی بیشتر از پپتید نشانه ‏‎ompa‎‏ می باشد. همچنین نتایج بررسی ها نشان می دهد که در سیستم القا شیمیایی ، لاکتوز را می توان جایگزین ‏‎iptg‎‏ نمود. بررسیهای انجام شده در زمینه افزایش پردازش نشان می دهد که اضافه کردن ساکاروز به محیط کشت باکتریهای نوترکیب می تواند پردازش را تا حدود 2 برابر افزایش دهد.