به دلیل کاربردهای وسیع پروتئین اینترفرون گاما در پزشکی، تلاش های زیادی در جهت تولید انبوه آن صورت گرفته است. به نظر می رسد که دستورزی ژنتیکی گیاهان برای تولید این گروه از پروتئین ها، روشی مناسب باشد. تولید پروتئین-های نوترکیب در گیاهان (molecular farming) به دلایل متعددی از جمله پائین بودن هزینه تولید مورد توجه قرار گرفته است. در مهندسی ژنتیک گیاهی، پس از تولید گیاهان تراریخته، خصوصیات مولکولی آنها بررسی می شود. از میان آنالیزهای مولکولی، تعیین تعداد نسخه های ژن وارد شده به ژنوم بسیار ضروری است، زیرا این خصوصیت بر روی سطح بیان ژن وارد شده و پایداری بیان این ژن تاثیر می گذارد. در گذشته تکنیک سادرن بلات روش مرسوم برای تعیین تعداد نسخه ی ژن وارد شده در گیاهان تراریخت بوده و اخیراً نیز روش هایی از جمله هیبریداسیون مقایسه ای ژنومی برای این منظور استفاده شده است. اما تمام این روش ها بسیار سخت و وقت گیر هستند و به dna با کیفیت و کمیت بالا نیاز دارند، همچنین برخی از این تکنیک ها، جزء تکنیک های پرخطر محسوب می شوند. از real-time pcr می توان به منظور تعیین تعداد نسخه های ژن انتقالی در گیاهان تراریخته استفاده کرد. در این تحقیق تعداد نسخه های ژن های ifn? و nptii در نسل دوم(t1) توتون تراریخته توسط تکنیک real-time pcr و با استفاده از رنگ فلورسانس sybr green i مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج به دست آمده از این تکنیک با استفاده از روش کمیت سنجی مطلق و با به کارگیری نمودار استاندارد تجزیه و تحلیل شد. تعداد نسخه های برآورد شده از ژن ifn? در گیاهان مورد بررسی از یک تا پنج نسخه متغیر بود. برای ژن nptii نیز تعداد نسخه ها در این گیاهان بین یک تا چهار نسخه به دست آمد. امید می رود گیاهانی هموزیگوت که یک نسخه از ژن ifn? را در هر ژنوم هاپلوئید خود دارند، بیان بالا و پایداری از این ژن را در طی نسل های آینده نشان دهند. همچنین با مقایسه نتایج به دست آمده برای گیاهان و ژن های مختلف مورد بررسی، به نظر می رسد که در برخی موارد تعداد نسخه های وارد شده از دو ترانسژن یکسان، اما در برخی دیگر متفاوت است. این تفاوت با توجه به بازآرایی هایی که در فرآیند ادغام t-dna رخ می دهد، توجیه پذیر است. پس به منظور تعیین تعداد نسخه ی ژن های انتقال یافته، از یک روش سریع و قابل اعتماد استفاده شد. انعطاف پذیری این روش مناسب شرایطی است که در آن بهینه سازی دقیق تمام اجزای واکنش سخت می باشد.

از مهمترین فواید تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان می توان به اقتصادی بودن آن نسبت به سیستم های صنعتی، تولید فرآورده های بیولوژیکی فعال و مشابه شکل طبیعی، تولید بالای پروتئین نوترکیب و غیره اشاره کرد. از طرف دیگر پایین بودن سطح بیان ترنسژن ها و همچنین خاموشی آن ها در نسل های بعد از مهمترین فاکتورهای محدودکننده در این زمینه می باشد. انتخاب بافت مناسب گیاه جهت بیان و نیز بهبود قطعه ژنی از جمله راه های افزایش بیان ژن منتقل شده به گیاه می باشد. در راستای رسیدن به این هدف در تحقیق حاضر با طراحی و ساخت سازه اختصاصی بذر و انتقال آن به گیاه توتون سعی شده است تا ضمن بیان ژن gus در بذر توتون، افزایش بیان این ژن را نیز شاهد باشیم. ابتدا در سازه مدنظر، توالی های ss و kdel بعنوان سیگنال نگهدارنده پروتئین در شبکه آندوپلاسمی در بالادست ژن gus، ژن گزارشگر gus بعنوان یک ژن محک، توالی mar جهت جلوگیری از خاموشی ژن در پایین دست ژن gus تعبیه شد و این قطعه تحت کنترل پیشبرنده اختصاصی بذر napin قرار گرفت(این بخش از پژوهش توسط حسینی و همکاران در سال 1389 در دانشگاه زنجان انجام پذیرفت). ریزنمونه های برگی توتون با سازه مذکور و با استفاده از اگروباکتریوم تراریخت شدند. آنالیز گیاهان باززایی شده در سطح dna با pcr و آغازگرهای اختصاصی ژن های nptii و gus نشاندهنده انتقال این ژن ها به گیاهچه های باززایی شده بود. آزمون rt-pcr نیز جهت بررسی نسخه برداری از این ژن ها در بافت های برگی و بذری انجام و نتایج حاصل نشان داد که نسخه برداری از ژن nptii در هر بافت صورت می گیرد در حالیکه نسخه برداری از ژن gus تنها در بذر صورت می گیرد. این نتیجه با توجه به اینکه پیشبرنده nos (کنترل کننده ژن nptii ) یک پیشبرنده عمومی و napin یک پیشبرنده اختصاصی می باشد، مورد انتظار بود. در نهایت با استفاده از sds-page و آزمون هیستوشیمیایی gus، بیان این ژن در بذر گیاهان گزینش شده مورد بررسی قرار گرفت. وجود باند تقریبا kd60 در گیاهان تراریخت و نیز نتایج حاصل از آزمون هیستوشیمیایی نشاندهنده بیان ژن gus در بذور تراریخت توتون بود.

گونه های تریکودرما به تولید آنزیم های سلولازی با فعالیت آنزیمی نسبتاً بالا مشهورند. با این حال به علت عملکرد آنزیمی کم و هزینه بالای تولید، تلاش ها به منظور استفاده از آنزیم های سلولازی آنها در تبدیل زیستی پسماند های سلولزی چندان موفقیت آمیز نبوده است. از همین رو، تا کنون روش های متعددی در جهت ارتقای ظرفیت تولید سیستم های سلولازی در قارچ های جنس تریکودرما به کار گرفته شده است. تحقیق حاضر با هدف دستیابی به سویه های موتانتی با توان بیش تولید آنزیم سلولاز خارج سلولی در سه گونه از قارچ تریکودرما با استفاده از القای موتاسیون با پرتو گاما انجام گرفته است. سوسپانسیون اسپور spores/ml) 107) تهیه شده از هر یک از سه گونه قارچ تریکودرما شاملt.reesei ، t. virideو t. harzianum با استفاده از دستگاه گاماسل با چشمه کبالت 60 مستقر در مرکز تحقیقات کشاورزی، پزشکی و صنعتی هسته ای پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای کرج، تحت پرتو تابی گاما در محدوده دز 250 گری به عنوان دز اپتیمم قرار گرفت. پس از پرتو تابی، اسپور های جوانه زده به محیط کشت pda منتقل و از بین آنها سویه های موتانت با قابلیت اسپور زایی بهتر، انتخاب و پنج بار واکشت شدند تا پایداری آنها مورد آزمون قرار گیرد. آزمایشات تخمیر در ارلن مایر های 500 میلی لیتری حاوی 50 میلی لیتر محیط کشت تخمیری (محیط تولید آنزیم) با استفاده از سلولز والسس به عنوان منبع کربنی القا کننده انجام گرفت. محیط های کشت مذکور پس از تلقیح با میسلیوم، به مدت 48 ساعت در دمای°c 28 و دور rpm 180 گرمخانه گذاری گردید. پس از جدا کردن مایع فوقانی محیط های کشت سویه های وحشی و موتانت از توده سلولی آنها به کمک سانتریفیوژ، این مایع برای تعیین غلظت پروتئین خارج سلولی و فعالیت سلولازی مورد سنجش قرار گرفت. غلظت پروتئین بر اساس روش بردفورد و با استفاده از بوین سرم آلبومین به عنوان استاندارد اندازه گیری گردید. فعالیت سلولازی با استفاده از سوبسترا های سلولزی کاغذ صافی واتمن شماره یک، کربوکسی متیل سلولز، آویسل، سلولز باکتریایی و سلولز والسس و بر اساس دستورالعمل iupac (اتحادیه بین المللی شیمی محض و کاربردی) مورد سنجش قرار گرفت و قند های احیا کننده آزاد شده به روش دی نیترو سالیسیلیک اسید و با استفاده از گلوکز به عنوان استاندارد اندازه گیری شد. کلیه آزمایشات در سه تکرار انجام گرفت. به منظور بررسی بیان ژن های سلولازی، پروفایل پروتئین های خارج سلولی سویه های موتانت توسط الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید به همراه سدیم دو دسیل سولفات (sds-page) مورد مطالعه قرار گرفت و با پروفایل مربوط به سویه های وحشی آنها مقایسه گردید. بر اساس نتایج حاصل از فعالیت آنزیمی، از میان پنج سوبسترای سلولزی مورد آزمون، بیشترین و کمترین فعالیت سلولازی، در حضور سلولز والسس و آویسل به دست آمد. نتایج به دست آمده از sds-page نیز نشان داد که موتاسیون القایی توسط پرتو گاما منجر به ایجاد تغییر در بیان ژن های سلولازی و پروفایل پروتئینی سویه های موتانت در مقایسه با سویه مادری آنها شده است. به طور کلی، یافته های این تحقیق نشان داد که پرتو تابی گاما قادر است عملکرد و ظرفیت هیدرولیز آنزیم های سلولازی قارچ های سلولولایتیک را به شکل قابل توجهی ارتقا دهد و می تواند به عنوان روشی ساده و کارآمد در برنامه های اصلاحی به منظور دستیابی به سویه های موتانت قارچی که توانایی تولید مقادیر بالای آنزیم و دیگر متابولیت های میکروبی را داشته باشند، به کار گرفته شود.

چکیده وجود غذاهای کم قند با طعم و کیفیت بالا به عنوان رژیم غذایی در افراد مبتلا به بیماری دیابت مهم است.پروتئین¬های شیرین به دلیل کیفیت خوب و کالری پایینشان قابلیت استفاده به جای ساکارز را دارند. پروتئین برازئین از یک میوه خوراکی به دست می¬آید و به عنوان یک شیرین کننده¬ی بالقوه¬ی تجاری استفاده می¬شود. ویژگی¬های منحصر به فرد پروتئین برازئین شامل اندازه کوچک آن (53 باقی¬مانده اسید آمینه)، پایداری بالای آن در محدوده وسیعی از دما و ph، و مشابهت شیرینی آن با ساکارز است. برازئین به عنوان یک پروتئین شیرین به طور طبیعی در یک گیاه گرمسیری وجود دارد و تولید اقتصادی آن در مقیاس بزرگ غیر عملی است، بنابراین قابلیت دسترسی آن برای استفاده در محصولات غذایی محدود است. همچنین استخراج برازئین از منابع طبیعی آن گران است و بنابراین از لحاظ اقتصادی قابل اجرا نیست. باکتری¬ها برای تولید پروتئین¬های نوترکیب ساده و مقرون به صرفه هستند. در این مطالعه با استفاده از تکنولوژی dnaی نوترکیب یک روش متفاوت برای تولید انبوه و ارزانتر از برازئین فراهم کردیم. ژن برازئین طراحی، سنتز و سویه بیانی برازئین فاقد پیروگلوتامات ساخته و در بانک ژن با کد kf013250.1ثبت شد. پروتئین نوترکیب برازئین به صورت فرم محلول بعد از القاء توسط iptg بیان شد. این پروتئین نوترکیب به وسیله¬ی ستون کروماتوگرافی تمایلی با نیکل آگارز تخلیص و بیان توسط ژل sds-page شناسایی شد. بررسی¬ها نشان داد که در دمای 32 درجه سانتیگراد، بیان فراورده برازئین به صورت محلول و در مقدار نسبتا زیاد انجام گرفته است. کلمات کلیدی: پروتئین¬های شیرین، پروتئین برازئین، تکنولوژی dnaی نوترکیب، پروتئین نوترکیب.

جذابیت سیستم¬های گیاهی برای بیان پروتئین¬های نوترکیب به دلیل مزایای همچون ایمنی بالا، هزینه پایین، تغییرات پس از ترجمه و حجم بالای تولید است. بیان بالای ترنسژن در گیاه، مستلزم آماده کردن سازه ژنی مناسب حاوی پیشبرنده مناسب، عوامل افزایش دهنده بیان، عوامل ممانعت کننده از خاموشی ژن و... قبل از انتقال به گیاه است. در این تحقیق از سازه اختصاصی بذر، حاوی توالی افزاینده¬ بیان (ω) در بالا دست ژن gus و نیز توالی جلوگیری کننده از خاموشی ترنسژن (sar)در پایین دست ژن gus تحت کنترل پیشبرنده napin (پیشبرنده اختصاصی بذر) که قبلا تهیه شده بود، استفاده گردید. سازه ω-gus-sar ابتدابه اگروباکتریوم سویه lba4404 و سپس به ریزنمونه¬های برگی توتون انتقال داده شد. باززائی و گزینش جوانه¬ها درمحیط گزینشگر (شاملms، mg/l 1/0 naa، mg/l3 bap ، mg/l 25 کانامایسین، mg/l 200 سفاتوکسیم) انجام شد سپس گیاهان به محیط طویل شدن ساقه، ریشه¬زایی و نهایتا به پرلیت و خاک منتقل شدند. ارزیابی گیاهان تراریخت با استفاده از واکنش pcr و rt-pcr،sds¬-page وآزمون هیستوشیمیایی gusانجام شد. واکنش pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن های nptii و gus نشاندهنده انتقال این ژن ها به گیاهچه های باززایی شده بود. واکنش rt-pcr نیز انجام رونویسی و تولید mrna ژنgus را در بذر اثبات نمود.آزمون sds-page باند kd68پروتئین gus را نشان داد و نتایج حاصل از آزمون هیستوشیمیایی نشاندهنده بیان ژن gus در بذور تراریخت توتون بود.

زعفران (.crocus sativus l) گیاهی تریپلویید و عقیم است که از طریق رویشی با استفاده از بنه تکثیر می گردد. اصلاح این گیاه با استفاده از شیوه های سنتی با مشکلات زیادی روبرو بوده است. تکنیک کشت بافت و مهندسی ژنتیک می تواند در راستای اهداف اصلاحی این گیاه مورد استفاده قرار گیرد. هدف این پژوهش استقرار یک دستورالعمل باززایی کارا برای استفاده در پروژه های انتقال ژن به این گیاه می باشد. به این منظور از بخش های مختلف گیاه شامل بنه، برگ و جوانه انتهایی به عنوان ریزنمونه استفاده شد. پس از ضدعفونی کردن مواد گیاهی، از آن ها ریزنمونه های لایه ی سلولی نازک با ضخامت حدود یک میلی متر تهیه شد. ریزنمونه ها در محیط ms با غلظت های مختلف bap،naa و 2,4-d کشت شدند. برای القای کالوس، نمونه های کشت بافتی برای سه ماه در تاریکی در دمای 2± 20 نگهداری شدند. کالوس های القا شده برای باززایی به محیط ms با غلظت های مختلف bap و naa منتقل شدند. بیشترین میزان کالوس زایی به میزان 100 درصد در ریزنمونه های لایه سلولی نازک عرضی جوانه های انتهایی در محیط حاوی 2 میلی گرم در لیتر bap و naa ایجاد شد. بیشترین میزان باززایی در محیط حاوی نیم میلی گرم در لیتر bap به میزان 75 درصد مشاهده شد. بیشترین تعداد شاخساره در یک ریزنمونه (4/8) نیز در محیط حاوی 2 میلی گرم در لیتر bap ایجاد شد.

در پروژه های انتقال ژن، آنالیزهای مولکولی پس از تراریختی جهت بررسی پایداری ژن انتقال یافته و گزینش لاین های مناسب در نسل های پیشرفته، حائز اهمیت است.در این تحقیق آنالیزهای مولکولی برروی نسل دوم (t1) گیاهان تراریخت توتون حاوی سازهkozak-ifn?-kdelبه منظور بررسی پایداری ژن انتقال یافته انجام گرفت. واکنش pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی حضور ژن ifn?وnptiiرا نشان داد و واکنش rt-pcr نیز انجام رونویسی و تولید mrna مربوطه را اثبات کرد. نتایجhplc بر روی اسیدهای آمینه رضایت بخش و امیدوار کننده بود و نشان داد که پروتئین ifn? به مقدار 85/83میکروگرم در میلی لیتر در بذر تولید می شود.نتایج حاصل نشان داد که با در نظر گرفتن پروسه های بعدی از جمله تخلیص و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پروتئین تولید شده، از بذر گیاهان می-توان به عنوان یک بیوراکتور مناسب جهت تولید پروتئینهای نوترکیب بهره برد.

تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان با دو استراژی انتقال پایدار ژن و انتقال موقت ژن صورت می-گیرد. برای انتقال پایدار لازم است گیاهان والدی تراریخت طی چندین نسل تحت انواع آنالیزهای مولکولی و فنوتیپی قرار گیرد تا وضعیت انتقال و بیان ترانسژن مدنظر مشخص شود.

پروموتر بتافازئولین یکی از پروموترهای اختصاصی بذر لوبیا است که بیان حدود 50 درصد پروتئن های بذر لوبیا را کنترل می کند. استفاده از این پروموتر برای بهینه کردن تولید پروتئین های بذری در لوبیا و یا بذر گیاهان دیگر همچنین تولید پروتئین های نوترکیب مفید خواهد بود. هدف از این تحقیق جداسازی پروموتر اختصاصی بذر فازئولین از لوبیا و استفاده از آن در تهیه ی سازه های ژنی می باشد. ابتدا مطالعات بیوانفورماتیکی شامل مطالعه توالی کامل ژن بتافازئولین، طراحی پرایمرهای اختصاصی و انتخاب سایت های آنزیمی صورت گرفت. با استفاده از تکنیک pcr قطعه ی مورد نظر استخراج و سپس از ژل استخراج گردید و در مرحله ی بعد واکنش اتصال در ناقل ptz57r/t و ترانسفورماسیون به باکتری e.coli سویه xl-blue انجام شد و در مرحله ی آخر در پلاسمید بیانی pbi121 ساب کلون و جایگزین پروموتر قبلی شد.

استراتژی های مختلفی برای افزایش بیان و تجمع پروتئین نوترکیب در گیاهان در نظر گرفته می شود. از مهمترین عوامل موثر بر افزایش میزان تولید پروتئین نوترکیب در گیاه، بیان آن در بافت مناسب و نیز افزایش پایداری و تجمع پروتئین با استفاده از عوامل هدف گیری کننده به جایگاههای مناسب در سلول است. بیان پروتئین نوترکیب در بذر، موجب تجمع پایدار آن در غلظت نسبتا بالا در حجم کوچک و فشرده می شود که برای استخراج و ذخیره سازی بسیار مناسب می باشد. از طرف دیگر شبکه آندوپلاسمی سلول بدلیل حضور پروتئینهای چپرونی مختلف و ایزومرازها موجب بسته بندی صحیح پروتئینها شده و پایداری و تجمع پروتئین نوترکیب به میزان قابل توجهی افزایش می یابد. استراتژی دیگر استفاده از ژن اولئوسین گیاهی به منظور هدف گیری پروتئین نوترکیب به اجسام روغنی بذر می باشد. اتصال ژن اولئوسین به ژن مورد نظر و استفاده از پیشبرنده اختصاصی بذر، موجب قرار گرفتن پروتئین نوترکیب در اجسام روغنی بذر می شود. که علاوه بر تولید زیاد پروتئین، استخراج راحت تر و ارزانتر آن را نیز به دنبال خواهد داشت. در این تحقیق از دو استراتژی مذکور برای بیان پروتئین اینترفرون گامای انسانی در بذر گیاه کلزا استفاده شد. برای این منظور 3 نوع سازه مختلف طراحی و ساخته شد: 1) سازه pbi121-ifnγ 1 شامل ژن infγ + پیشبرنده napin، 2) سازه pbi121-ifnγ 2 شامل توالی kdel + ژن infγ + توالی kozak +پیشبرنده napin، 3) سازه pbi121-ifnγ-oleosin شامل infγ + توالی برشی + ژن اولئوسین+ پیشبرنده napin. سازه ها ی مذکور در ناقل گیاهی pbi121کلون و تائید شدند. سپس این سازه ها با روش انجماد و ذوب به اگرباکتریوم سویه lba4404 معرفی و این باکتری برای تراریختی گیاه کلزا از طریق ریزنمونه های لپه ای مورد استفاده قرار گرفت. گزینش نوساقه های باززائی شده در محیط انتخابی حاوی آنتی بیوتیک (کانامایسین و سفاتوکسیم) انجام شد. حضور سازه pbi121-ifnγ 2 و pbi121-ifnγ-oleosinدر گیاهان تراریزش شده در سطح dna با استفاده از pcr تائید شد. بررسی در سطح پروتئین با استفاده از sds-page نشان دهنده بیان پروتئین infγ در برخی گیاهان تراریخت شده با سازه pbi121-ifnγ 2 بود. در گیاهان مذکور فعالیت پروتئین تولید شده با تستهای elisa و dot blot و western blot نیز تائید شد. در مورد سازه pbi121-ifnγ-oleosin، علاوه برتائید انتقال سازه در سطح dna ژنومی، بررسی بیان در سطح rna با rt-pcr نشانگر نسخه برداری ژن ترکیبی بود. نتایج حاصل نشان داد که با در نظر گرفتن پروسه های بعدی از جمله تخلیص و ارزیابی فعالیت بیولوژیکی پروتئین تولید شده، بذر گیاه کلزا می تواند بعنوان یک بیوراکتور مناسب جهت تولید پروتئین های نوترکیب مورد استفاده قرار گیرد.