در این مطالعه بمنظور ساخت پیشبرهای القاء شونده توسط بیمارگر ها سه عنصر کنشی سیس شامل عناصر f، e17 و d باکس به عنوان عناصر بالقوه القاء شونده توسط بیمارگر ها بر اساس مطالعات گذشته انتخاب شدند و عملکرد آنها در پاسخ به یک محرک عمومی، دو هورمون گیاهی مرتبط با سیستم دفاعی، چند بیمارگر قارچی و شرایط محیطی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور با استفاده از روش ساخت پرموترهای مصنوعی، توالی های دو نسخه ای و ترکیبی از عناصر انتخاب شده در بالادست توالی مینیمال پیشبر مربوط به camv 35s کلون گردید و سازه های pgff، pgee، pgffdd، pgffee و pgddee ساخته شدند که به ترتیب پیشبر های sp-ff، sp-ee، sp-ffdd، sp-ffee و sp-ddee را در برداشتند. همچنین پیشبر minp با ساخت سازه pgmp به عنوان کنترل منفی و سازه pgc حامل پیشبر کامل cam v35s جهت بهینه سازی مراحل آنالیز بیان تهیه شد. بمنظور بررسی عملکرد پیشبرها ابتدا پتانسیل روش اگروانیجکشن برای آنالیز بیان پیشبرها در گیاه کلزا مورد بررسی قرار گرفت. در این آزمایش ها از سازه pgc و ناقل pbi121 استفاده شد و بیان ژن gus در گیاهان کلزا، توتون و لوبیا مقایسه شد. نتایج اگروانیجکشن نشان داد سازه pgc در برگ توتون و بافت غلاف لوبیا قادر به بیان ژن gus می باشد. در این آزمایش ها بیان باکتریائی ژن gus در محل نفوذ سوسپاسیون اگروباکتریوم حامل ناقل pbi121 در برگ کلزا و لوبیا مشاهده نشد. با استفاده از روش ریزپرتابی نشان داده شد که سازه pgc قادر به بیان ژن gus در برگ کلزا می باشد. با توجه به نتایج بدست آمده نشان داده شد که سازه pgc در گیاه کلزا، لوبیا و توتون فعال است. بمنظور آنالیز عملکرد، پیشبرها بطور دائمی با استفاده از روش کوتیلدونی به گیاه کلزا منتقل شدند و تراریختی گیاهان حاصل با استفاده از آزمون pcr و بیان ژن gus تایید شد. دیسک های برگی مربوط به گیاهان تراریخت حامل پیشبرهای مختلف، جهت آنالیز عملکرد استفاده شدند. نتایج هیستوشیمیائی نشان داد پیشبرهای مورد استفاده در پاسخ به آلودگی مستقیم با قارچ های اسکلروتینیا اسکلروتیوروم، رایزوکتونیا سولانی و فوزاریوم گرامیناروم سطح بیان و القاء پذیری متفاوتی نشان دادند. مطالعات فلوریمتری نشان داد مواد آزاد شده از قارچ های مورد مطالعه نیز قدرت القاء کنندگی دارند. واکنش پیشبرها به قارچ های اسکلروتینیا و رایزوکتونیا کاملاً متفاوت بود در حالیکه در پاسخ به تیمار قارچ فورازیوم تمامی آنها القاء پذیری نشان دادند. در این بین پیشبر sp-ff به قارچ اسکلروتینیا و پیشبر sp-ee به قارچ رایزوکتونیا واکنش نشان دادند. در حالیکه پیشبرهای sp-ffee، sp-ddee و sp-ffdd در پاسخ به بیمارگر بیوتروف رایزوکتونیا القاء پذیری بالائی نشان دادند. در این مطالعه عملکرد پیشبرها در پاسخ به تیمارهای کیتین، سالیسیلیک اسید و متیل جاسمونات نیز مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد پیشبرهای sp-ddee و sp-ff به تیمار کیتین، sp-ddee، sp-ffee، sp-ee به تیمار سالیسیلیک اسید و پیشبرهای sp-ff، sp-ffdd و sp-ddee به تیمار متیل جاسمونات القاء پذیری بالائی نشان دادند. پیشبرهای ساخته شده در پاسخ به تیمار زخم شدگی و سرما از خود واکنش نشان ندادند، همچنین در پاسخ به تیمارهای گرما و uv عمده پیشبرها غیر فعال بودند و تنها دو پیشبر sp-ddee و sp-ffdd تاحدی القاءپذیر بودند. براساس نتایج بدست آمده میتوان نتیجه گیری کرد که در گیاه کلزا عنصر e17 تا حد زیادی با مسیرهای پیام رسانی سالیسیلیک اسید در ارتباط است در حالیکه عنصر f با مسیر پیام رسانی متیل جاسمونات ارتباط بیشتری دارد و عنصر d القاء پذیری عمومی در پاسخ به محرک های مختلف نشان داد.

قارچ ها جهت غلبه بر سیستم دفاعی گیاه از ابزار مختلفی بهره می گیرند. ترکیبات فیتوآنتی سیپین از جمله مواد دفاعی است که در گیاه جهت جلوگیری از حمله پاتوژن ها تولید می شود. آنزیم توماتیناز، که یک آنزیم گلیکوزیل هیدرولازی است، جهت تجزیه فیتوآنتی سیپین و غلبه بر سیستم دفاعی گیاه توسط طیفی از قارچ ها از جمله تعدادی از فرم های اختصاصی قارچ fusarium oxysporum تولید می شود. با توجه به جایگاه خربزه در کشاورزی استان خراسان و اهمیت بیماری زردی و پژمردگی آوندی خربزه در این مطالعه حضور ژن توماتیناز در جدایه های مربوط به نژاد 1و 1.2 قارچ f. oxysporum f. sp. melonis با هدف تکثیر، همسانه سازی توالی ژنومی و ساخت سازه بیانی آن انجام شد. بدین منظور آغازگرهای اختصاصی psh30-f/r بر اساس توالی ژن توماتیناز در فرم اختصاصی f. oxysporum f. sp. lycopersici طراحی شد. نتایج الگوی الکتروفورزی محصول واکنش زنجیره ای پلی مراز جدایه ها، اختصاصی بودن آغازگرهای طراحی شده و وجود ژن توماتیناز در قارچ fom را تأیید نمود. قطعه تکثیر یافته جهت مطالعات تکمیلی در ناقل ptg19-t همسانه سازی گردید. نتایج توالی یابی دو جهته سازه ساخته شده، وجود چندین جهش را در توالی توماتیناز fom نشان داد. به منظور ساخت سازه بیانی توماتیناز fom ، آغازگرهای اختصاصی توماتیناز با نام psh30.3-f/r براساس جایگاه برشی spe1 و sac1 طراحی شد. انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز با استفاده از این آغازگرها قطعه ای با تعداد 1056 جفت باز را تکثیر کرد که این قطعه جایگاه های برشی مورد نظر را دارد. به منظور بیان پروتئین، قطعه توماتیناز تکثیر یافته به ناقل pet21 متصل شده و به سویه bl21 انتقال یافت . سازه ساخته شده با نام petfom به صورت دو جهته توالی یابی گردید. نتایج توالی یابی نشان داد که سازه ساخته شده در جهت صحیح قرار گرفته و فاقد کدون پایان است. بعد از تأیید سازه، بیان توماتیناز در سطح پروتئینی بررسی گردید. نتایج به دست آمده نشان داد که بیان پروتئینی توماتیناز نیازمند تغییر عوامل دیگری از قبیل تغییر سویه باکتری میزبان، اعمال تغییرات دمایی پایین تر و یا غلظت های دیگری از iptg است. به منظور بررسی بیان توماتیناز در سطح رونویسی واکنش rt-pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی توماتیناز انجام شد و نتایج آن نشان داد که توماتیناز در سطح رونویسی بیان شده است.

خربزه گیاهی جالیزی و اقتصادی به شمار می رود که سطح زیر کشت قابل توجهی را در ایران و استان خراسان به خود اختصاص داده است. بکارگیری تکنیک های نوین در سرعت بخشیدن به برنامه های اصلاحی می تواند در جبران کاستی های گذشته نقش مهمی ایفاء نماید. اکوتیپ خاتونی می تواند به عنوان رقمی محلی و بازارپسند در برنامه های اصلاحی مورد توجه قرار گیرد. در این مطالعه اثر دو فاکتور ریزنمونه و مقادیر مختلف هورمون bap در محیط کشت با هدف بهینه سازی شرایط باززائی مستقیم در اکوتیپ خاتونی بررسی شد. جوانه ی جانبی انتهای برگ های لپه ای، برگ-های حقیقی و محور زیرلپه در محیط های کشت rm1 (حاوی 1/0 میلی گرم در لیتر bap)، rm2 (حاوی 25/0 میلی گرم در لیتر bap)، rm3 (حاوی 5/0 میلی گرم در لیترbap)، rm4 (حاوی 75/0 میلی گرم در لیتر bap) و rm5 (حاوی 1 میلی گرم در لیتر bap) کشت شدند. ریزنمونه ی برگ لپه ای در مقایسه با سایر ریزنمونه ها باززائی بیشتری نشان داد. القاء ساقه زایی در محیط کشت با افزایش میزان bap افزایش یافت. با استفاده از این پروتکل، راندمان باززایی ریزنمونه های ترانسفرم شده با بررسی اثر سویه اگروباکتریوم (lba4404 و gv3101)، سازه مورد انتقال (pbi121 و pgc) و غلظت هورمون bap در محیط هم کشتی ریزنمونه ها با سویه های اگروباکتریوم (mc1 : حاوی 5/0 میلی گرم در لیتر bap و mc2: حاوی 5/0 میلی گرم در لیتر bap و 01/0 میلی گرم در لیتر naa) مورد ارزیابی قرار گرفت. سویه lba4404 و محیط mc1 نسبت به سایر فاکتورهای مورد ارزیابی، راندمان باززایی بالاتری در ریزنمونه های ترانسفرم شده داشتند.

بیماری زردی و پژمردگی آوندی یکی از بیمار های مهم خربزه می باشد که قارچ fusarium oxysporum f.sp. melonis (fom) عامل این بیماری است و از نظر بیماریزائی در چهار نژاد صفر، 1، 2و 1.2 گروه بندی می شود. ژن fom2 به عنوان عامل مقاومت در مقابل نژاد صفر و 1 قارچ fom شناخته شده است. در این مطالعه با توجه به حساسیت اکوتیپ های خربزه ایرانی در مقابل نژاد 1، حضور ژن fom2 به عنوان عامل مقاومت در برابر این نژاد در سطح ژنوم اکوتیپ های مثل: طالبی شهد شیراز، خربزه مشهدی، خربزه خاتونی، خربزه خاقانی، charentais fom1 و charentais fom2 مورد بررسی قرار گرفت. توالی گزارش شده ژن fom2 از بانک ژن بازیابی شد و با انجام آنالیزهای بیوانفورماتیک مناطق حفاظت شده آن تعیین و جهت طراحی پرایمر داخلی (psh20-f/r) به کار گرفته شد. نتایج pcr با استفاده از این پرایمر حضور ژن fom2 را در اکوتیپ های مورد مطالعه تایید نمود و به تکثیر تک باند در اندازه مورد انتظار منتج شد. قطعه داخلی ژن fom2 جهت توالی یابی در ناقل ptg19 کلون شد و به وسیله تکنیک کلنی pcr با استفاده از پرایمر داخلی ژن fom2 و پرایمر یونیورسال psh10.2-f/r تایید گردید. آنالیز نتایج توالی یابی نشان داد که اکوتیپ های حساس همانند خربزه مشهدی، خربزه خاقانی، charentais fom1 تنوع نوکلئوتیدی و پروتئینی متفاوتی را نسبت به اکوتیپ های مقاوم نشان می دهند، که همین تنوع نوکلئوتیدی، ساختار پروتئینی اکوتیپ های حساس را تغییر و آن ها را نسبت به نژاد صفر و 1 عامل بیماری حساس می نماید. شناسایی تفاوت سطح مقاومت در اکوتیپ ها به دلیل وجود تنوع در توالی ژن و در سطح بیان پروتئینی ژن fom2 می باشد. سپس به منظور بررسی توالی کامل ژن fom2 و همسانه سازی آن، یک جفت پرایمر اختصاصی (psh20.2-f/r) بر اساس ابتدا و انتهای ژن، جهت تکثیر توالی کامل ژن طراحی گردید. با توجه به مقاوم بودن اکوتیپ طالبی شهد شیراز (m6) ژنوم این اکوتیپ پس از استخراج بعنوان dna الگو مورد استفاده قرار گرفت. در الگوی الکتروفورزی محصول pcr تک باندی به اندازه مورد انتظار (حدود 3.3 کیلوباز) مشاهده شد. بعد از کلون کردن قطعه مورد نظر در ناقل ptg19 و توالی یابی، آنالیز نتایج وجود موتاسیون را در اکوتیپ مقاوم طالبی شهد شیراز مشخص نمود که این موتاسیون ها بر عملکرد ژن fom2 تاثیر نداشته است. به طور کلی هدف از کلون قطعه کامل در این تحقیق انتقال ژن fom2 به ناقل بیانی و بعد از آن انتقال ژن به گیاه می باشد، که در مطالعات تکمیلی مورد بررسی قرار خواهد گرفت. fom2

کنترل دقیق بیان تراژن به هدف افزایش مقاومت به بیماریها یکی از چالشهای مهم مهندسی ژنتیک گیاهی می باشد. با توجه به نقش پیشبر در تنظیم بیان ژن، انتخاب پیشبر مناسب در برنامه های اصلاحی تولید ارقام مقاوم از اهمیت زیادی برخوردار است. در میان پیشبرهای گیاهی، پیشبرهای القا پذیر با بیمارگر که ژن خود را تنها در واکنش به حمله بیمارگر بیان می کنند، مورد توجه بیشتری قرار گرفته اند. با این حال بسیاری از این پیشبرها، سطوحی از بیان پایه را نشان می دهند که کاربرد آنها را برای اهداف بیوتکنولوژیک نامناسب می سازد. با توجه به ویژگیهای یک پیشبر مناسب القاپذیر با بیمارگر و فقدان این ویژگیها در پیشبرهای طبیعی، امروزه از استراتژیهای طراحی و ساخت پیشبرهای مصنوعی استفاده می شود. در ساختار این پیشبرها از عناصر تنظیمی سیس و توالی های حداقل پیشبری به هدف افزایش بیان و قدرت ژن در پاسخ به عوامل القاکننده و کاهش بیان پایه استفاده می گردد. عملکرد پیشبرهای مصنوعی القا پذیر با بیمارگر به روشهای مختلف مورد ارزیابی قرار می گیرد. در این مطالعه به هدف آنالیز پیشبر مصنوعی و القا پذیر sp-dd (متشکل از دو نسخه از عنصر تنظیمی سیس d box)، از روش بیان موقت مبتنی بر اگروباکتریوم استفاده شد. با در نظر گرفتن برهمکنش میزبان گیاهی و سویه اگروباکتریوم، شرایط بیان موقت بهینه سازی شد. همچنین بیان درونزاد ژن gus در گونه های گیاهی مختلف ارزیابی شد. عملکرد پیشبر القایی sp-dd با اگرواینجکشن آن به گیاه میزبان، تعیین بیان پایه، پاسخ آن به مسیر دفاعی سالیسیلیک اسید و تاثیر تنشهای محیطی سرما، گرما و اشعه ماورا بنفش بررسی شد. نتایج این مطالعه نشان دهنده وجود برهمکنش مناسب گیاه توتون گونه بنتامیانا با سویه gv3101 اگروباکتریوم و همچنین عدم وجود بیان درونزاد ژن gus در گیاه فوق بود. همچنین آنالیز پیشبر مزبور بیانگر پاسخگویی آن به هورمون پیام رسان دفاعی سالیسیلیک اسید به صورت موضعی و سیستمیک بود. القا پذیری این پیشبر با افزایش زمان از 2 ساعت تا 24 ساعت از اعمال تیمار سالیسیلیک اسید افزایش یافت. پیشبر فوق در پاسخ به تنشهای گرما و سرما حساسیت اندکی نشان داد ولی تنش اشعه ماورا بنفش بر القا آن بی¬اثر بود. بر اساس نتایج بدست آمده با توجه به حساسیت پیشبر مصنوعی sp-dd نسبت به مسیر پیام رسانی سالیسیلیک اسید، انتظار می رود این پیشبر نسبت به بیمارگرهای بیوتروف نیز واکنش القایی بالایی نشان دهد.

پژمردگی آوندی خربزه که به وسیله یک پاتوژن خاکزی به نام fusarium oxysporum f. sp melonis (fom) ایجاد می شود، یک بیماری مخرب است. استفاده از ارقام مقاوم یک راه موثر برای کنترل کردن این قارچ است. دید واضح و روشن درباره برهمکنش بین ژن های مقاومت و بیماری زایی یک نقش مهم را در طول برهمکنش گیاه و پاتوژن ایفا می کند. بررسی همولوگ های ژن های افکتوری، در فرم های اختصاصی مختلف آغاز شده است، تا جایی که تعدادی از ژن های افکتوری از فرم fusarium oxysporum f. sp. lycopersici گزارش شده است. با استفاده از روش های بیوانفورماتیکی، همولوگ ژن افکتوری fol-six1 از فرم fom گزارش گردیده است. مطالعه حاضر با هدف نشان دادن برهمکنش بین fol-six1 و ارقام مختلف ملون که دارای ژن های مقاومتی معینی هستند انجام شد. توالی کدکننده fol-six1 از dna ژنومی نژاد یک fol، با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی psh51-f5/r5 که دارای سایت آنزیمی ncoi است، به دست آمد. توالی در وکتور ptg19 کلون شد و سپس در وکتور جفتی pcambia3301 بازهمسانه سازی شد. سازه ها با استفاده از روش های کلنی pcr و بررسی الگوی هضم آنزیمی تایید شدند. صحت سازه بیانی pcas1 با توالی یابی مورد تایید قرار گرفت. بیان موقت مبتنی بر اگروباکتریوم، برای بیان fol-six1 در برگ های ارقام ملون استفاده شد. سازگاری دو سویه lba4404 و gv3101 اگروباکتریوم، در برگ های ملون ارزیابی شد. نتایج نشان داد که سویه lba4404 با تمام ارقام ملون بسار سازگارتر است. به این صورت که هیچ گونه علائمی بر روی برگ ها تا 48 ساعت پس از آلودگی ظاهر نشد. به منظور بهینه سازی بیان موقت در ارقام ملون، سازه pcambia3301 دارای ژن گزارشکر gus اینترون دار به سویه lba4404 منتقل شد و به برگ ارقام ملون تزریق شد. سنجش ژن گزارشکر gus نشان داد که ژن gus می تواند به صورت موقت در برگ-های ملون بیان شود. آنالیز عملکرد fol-six1 با استفاده از اگرواینجکشن سویه lba4404 دارای سازه pcas1 به درون برگ ارقام ملون نشان داده شد. برگ های رقم c-t و c-f2 در پاسخ به بیان موقت fol-six1، علائم سبز خشکی را پس از 24 ساعت از تزریق نشان دادند. در حالی که، ارقام c-f1 و bg واکنش به تزریق تا 48 ساعت پس از تزریق نشان ندادند. نتایج نشان داد که مرگ سلولی به صورت سبز خشکی میتواند از بیان موقت ژن افکتوری fol-six1 در بعضی از ارقام ملون ناشی شود. شناسایی برهمکنش هایی که سبب بروز پاسخ مرگ سلولی در ارقام حساس ملون شده است، بسیار مورد توجه خواهند بود.

چکیده فارسی ویروس موزائیک توتون (tmv) ، یکی از مهمترین عوامل بیماریزا در سراسر دنیا است که بیش از 200 گونه گیاهی را آلوده می نماید. هر یک از اجزای مختلف ژنوم دارای نقش مهمی در ساختار ژنوم ویروس می باشد، از جمله پروتئین حرکتی که در حرکت سلول به سلول در tmv موثراست و پروتئین پوششی که نقش مهمی در پایداری و انتقال ویروس ایفا میکند. درایران در خصوص تعیین توالی کامل ژنوم ویروس موزائیک توتون تا کنون اقدامی صورت نگرفته است. لذا تعیین توالی ویروس و مطالعه تفاوت های جدایه های موجود در کشور با اطلاعات موجود در منابع از جمله اقدامات اولیه و ضروری جهت انجام مطالعات مولکولی روی این ویروس است، بنابراین با هدف بررسی توالی ژن کدکننده پروتئین حرکتی و پروتئین پوششی در جدایه گزارش شده از ایران و مقایسه توالی تعیین ترادف شده با جدایه های مختلف در بانک ژن ncbi مطالعه حاضر انجام شد. توالی ژن کدکننده این پروتئین ها در جدایه های مناطق مختلف دنیا گزارش شده است. استخراج rna ژنومی ویروس از برگ گیاهان توتون آلوده بدست آمد و با استفاده از پرایمر psh60-r1 مرحله ساخت cdna انجام شد. با استفاده از آغازگرهای اختصاصی psh63-f و psh60-r1 منطقه کدکننده پروتئین حرکتی و پروتئین پوششی تکثیر و بصورت دو جهته توالی یابی شد. همردیفی توالی بدست آمده با توالی مشابه از نژادهای مختلف انجام شد و درخت خویشاوندی رسم گردید. نتایج نشان داد جدایه گزارش شده از ایران با نژاد tmv-u1 قرابت بالائی دارد. از بین 799 جایگاه در سطح نوکلئوتید برای پروتئین حرکتی 6 جهش در مقایسه با نژاد tmv-u1 مشاهده و در مجموع 266 اسید آمینه 2 جهش دیده شد. آنالیزهای انجام شده براساس توالی نوکلئوتیدی کد کننده ناحیه پروتئین پوششی ویروس در مقایسه با نژاد tmv-u1 2 جهش در سطح نوکلئوتید را نشان داد. در توالی های بالادست و بینابین دو ژن کدکننده پروتئین پوششی و حرکتی نیز جهش هایی مشاهده شد. جهش در این مناطق به دلیل نقش تنظیمی در بیان ژن حائز اهمیت است.