بررسی روابط تکاملی و فیلوژنی در گیاهان، از طریق صفات مورفولوژیکی همواره متداول بوده است. گیاهان براساس ویژگی های موفولوژیک متمایزکننده شناسایی می شوند (du1 et al., 2006). در بعضی موارد شناسایی گونه های گیاهی براساس صفات موفولوژیک مشکل و دارای محدودیت است. در مواردی نشانگرها و صفات مورفولوژیک به علت تاثیرپذیری از محیط کارایی کمی در شناسایی و رده بندی گونه ها دارند (shen et al., 1998). در سال های اخیر از روش های مولکولی برای مطالعات پایه ای و کاربردی در انسان، حیوان و گیاه استفاده شده است، به طوری که کشف انواع مختلفی از نشانگرها باعث پیشرفت عمده ای در مطالعات سیستماتیکی گردیده است (flavell, 1980). روش های مولکولی ابزارهای بسیار مهم و قوی در ارزیابی روابط خویشاوندی، ارزیابی تنوع ژنتیکی و شناسایی گونه های جمعیت های گیاهی مختلف می باشند. این روش ها به دو دسته تقسیم می شوند: روش هایی که در آنها از نشانگرهای مولکولی استفاده می شود و نوع دیگر آن روش هایی هستند که بر پایه توالی های ژنی می باشند (williams et al., 1990; innis et al., 1990). داده های مولکولی مبتنی بر توالی ‍ های ژنی انقلاب بزرگی را در اواخر 1980 در تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی ایجاد کردند. در گیاهان اکثریت تعیین توالی ها براساس مطالعات فیلوژنتیک مولکولی به خصوص در سال های اخیر صرفا براساس dna ژنومی (dna ریبوزومی هسته- nrdna) و کلروپلاستی ( cpdna) هستند (alvaerz et al., 2003; small et al., 2004). dna ریبوزومی هسته توالی های کدکننده rna ریبوزومی می باشند که در هستک سازمان یافته اند. این ژن هسته ای یک توالی تکراری با تعداد کپی 500 تا بیش از 40000 در ژنوم است که در تکرارهای پشت سر هم آرایش یافته است به طوری که در گیاهان ده درصد کل dna را تشکیل داده است (long et al., 1980; hillis et al., 1991; buchler et al., 1996; rogers et al., 1987). بررسی ها نشان می دهد که از 244 مقاله منتشر شده درمورد روابط فیلوژنتیکی در طی سال های 1998 تا 2003، 66% مربوط به its می باشد (alvaerz et al., 2003). بنابراین یکی از مهم ترین توالی های مولکولی برای مطالعات فیلوژنتیکی در سطوح جنس و درون جنس ناحیه its ژن های s26-s5.8-s18 dna ریبوزومی هسته می باشد (feliner et al., 2007). جنس یونجه (medicago l.) یکی از مهم ترین نیام داران علوفه ای دنیا و اولین گیاه علوفه ای اهلی شده می باشد که بومی نواحی مدیترانه ای است (miller, 1984). یونجه در مناطق مختلف جهان از انتشار جغرافیایی بسیار وسیعی برخوردار است. خاستگاه اصلی این جنس به لحاظ جغرافیایی قفقاز، شمال غربی ایران، ارتفاعات ترکمنستان و شمال شرقی ترکیه است (hanson, 1988). یونجه به راسته گل سرخیان rosales))، تیره حبوبات (fabaceae)، طایفه سه برگچه ای ها (trifolieae) تعلق دارد (cronquist, 1989). تیره حبوبات از جمله بزرگترین تیره گیاهان گلدار می باشد (wojciechow ski et al., 2004; lewis et al., 2005). جنس یونجه 83 گونه دارد که 55 گونه آن یکساله و 27 گونه آن چندساله هستند (steele et al., 2010). گونه های چندساله معمولا عمدتا دگرگرده افشان و تتراپلوئید (32=x4=n2) و گونه های یک ساله خودگرده افشان و دیپلوئید (16=x2=n2) هستند (quiros et al., 1988). یونجه در بین گیاهان علوفه ای از اهمیت ویژه ای برخوردار می باشد و بنا به دلایلی به ملکه گیاهان علوفه ای شهرت یافته است. همزیستی یونجه با باکتری های ریزوبیوم و در نتیجه تثبیت نیتروژن مولکولی در این گیاه، اهمیت آن را برای تناوب با محصولات زراعی برای حاصلخیزی خاک زیادتر کرده است به طوری که در کشاورزی پایدار می تواند نقش اساسی داشته باشد (de-haan et al., 1998). با توجه به جنبه های مثبت این گونه از نظر تولید علوفه، حفاظت خاک، تناوب زراعی، تثبیت بیولوژیک ازت، کود سبز، دارا بودن مواد مغذی و خواص دارویی (hanson, 1988)، شناسایی این گونه حائز اهمیت می باشد. همچنین آگاهی از شناسایی و رده بندی گونه های یونجه و میزان تنوع ژنتیکی گونه های آن در اصلاح نباتات از اهمیت خاصی برخوردار است خصوصا برای تولید ارقام اصلاح شده مهم می باشد. bena و همکاران (a 1998) در یک تحقیق جامع، فیلوژنی جنس یونجه را با استفاده از نشانگرهای مولکولی its و ets مورد بررسی قرار داده اند. براساس نتایج این تحقیق، گونه های چندساله و دگرلقاح برخلاف نظر سایر محققین مانند lesins (1979)، ابتدایی نبوده و به نظر می رسد در مسیر تکاملی ابتدا گونه های یک ساله خودلقاح و سپس گونه های چندساله دگرلقاح تشکیل شده باشد. همچنین در سال 1998، این محققین (bena و همکاران در سال b 1998) در پژوهش دیگری عنوان کرده بودند که نتایج فیلوژنی مولکولی حاصل از نشانگر های its و ets، حاکی از تعلق داشتن گونه m. radiata l. به جنس یونجه (medicago) می باشد در حالی که small در سال 1980 نظریه نزدیکی این گونه را به جنس trigonella مطرح کرده است و نیز گاهی بیان شده است این گونه حدواسط دو جنس فوق می باشد. bena و همکاران (1998) بیان کرده اند که تناقض هایی بین مطالعات فیلوژنی مولکولی و رده بندی کلاسیک مورفولوژیک در جنس یونجه وجود دارد که باید این مشکل حل شود. در این پروژه 5 گونه از جنس یونجه (medicago l.): یک گونه چندساله (m. sativa l.) و چهار گونه یک ساله (m. orbicularis l., m. radiata l., m. scutellata l., m. minima l.) در سطح dna با استفاده از توالی یابی dna ریبوزومی هسته ای ناحیه its مطالعه شدند. همچنین به منظور حصول اطمینان از نتایج به دست آمده، یک بار دیگر آزمایشات با نشانگرهای rapd تکرار شد که از میان 4 آغازگر استفاده شده فقط الگوهای نواربندی یک آغازگر (n4) مناسب و قابل امتیازدهی بود.