مقدمه شبکه آندوپلاسمی به واسطه وجود چاپرون هایی نظیر grp78 نقش مهمی در بلوغ و تاخوردگی پروتئینها بازی میکند. تجمع پروتئین های تا نخورده در شبکه آندوپلاسمی منجر به فرایند استرس شبکه آندوپلاسمی می شود که پاسخ به این فرایند با کاهش کلی سنتز پروتئین و افزایش بیان چاپرون هایی نظیر grp78 همراه می باشد. در سلولهای رنگدانه دار شبکیه چشم افراد بالغ طولانی شدن فرایند er stress باعث مرگ برنامه ریزی شده این سلولها شده و به احتمال زیاد منجر به تغییراتی در شبکیه مانند نو- رگزایی می گردد که این امر منتج به آسیب های شبکیه و بیماری های شبکیه نظیر amdوrp میشود. هدف از این مطالعه بررسی کاهش بیان grp78 در سلولهای rpe و اثر آن برروی برخی از فاکتورهای مهم رگزایی ونیز اثر آن برروی آپوپتوز و تکثیر سلولی بود. در این پژوهش سلولهای rpe از کره ی چشم انسان بالغ که از بانک چشم جمهوری اسلامی ایران تهیه شده بود ، جداسازی شد ودر محیط کشت dmem/f12 که حاوی %?? سرم جنین گوساله (fbs ) در کشت اولیه و%?? سرم جنین گوساله در پاساژهای بعدی بود کشت داده شد. هویت سلولها به وسیله ی مارکرهای اختصاصی rpe65 و سیتوکراتین 18/8 اثبات شد. سلولها بین پاساژهای 2-7 توسط sirna مخصوص knock down در سطح رونویسی علیه grp78 مورد تیمار قرار گرفتند. سلولهای تیمار شده با sc sirna ، transfection reagent و سلولهای rpe بدون تیمار به عنوان کنترل های آزمایش مورد بررسی قرار گرفتند. پس از استخراج rna از سلول ها وبررسی با real time-pcr انجام knock down برروی grp78 مورد تایید قرار گرفت. متعاقب آن rna از سلول های rpe که به شیوه قبل knock down شده بودند ونیز سلول های کنترل که در بالا به آنها اشاره شد، استخراج شد و توسط تکنیکreal time-pcr ، در سطح رونویسی، تغییرات میزان بیان ژنهایvegfa ، vegfr-2 ، mmp-2، mmp-9،ctgf ،timp-1 ، timp-2، cathepsin d، ?-sma مورد بررسی قرار گرفت. همچنین تکثیر،زنده ماندن ومرگ سلولهایrpe تیمار شده با استفاده از تکنیک elisa بررسی شد. نتایج real time pcr کاهش قابل ملاحظه ای دربیانgrp78 نشان داد. بیان ژنهای timp-2 vegf-a ، (kdr or flk-1)vegfr-2 و mmp-2 کاهش معنی داری را نشان داد. مقدار رونوشت هایctgf,mmp-9، timp-1 ، cathepsin dو ?-sma بدون تغییر باقی مانده بود. تیمارهای rnai هیچ اثر ناخواسته ای برروی مرگ برنامه ریزی شده و تکثیر سلولی در سلولهای ترانسفکت شده در مقایسه با کنترل ها نداشت.

نقص در فاکتور? انعقادی شایعترین عامل در بیماری هموفیلی b است. در حال حاضر بیماران هموفیلی b با روش جایگزین درمانی با پلاسمای ذخیره شده یا فاکتور ? نوترکیب مورد مداوا قرار می گیرند. گاما کربوکسیلاسیون گلوتامیک اسیدهای ناحیه ی gla فاکتور ? که توسط آنزیم گاماکربوکسیلاز انجام میگیرد به عنوان یکی از تغییرات بعد از ترجمه کلیدی برای فعالیت بیولوژیک این پروتئین ضروری است و همواره باید در هنگام تولید فاکتور9 نوترکیب مورد توجه قرار گیرد. توانایی بالقوه mirnaهای مصنوعی بیان شونده در درمان بیماری ها را باید منتسب به توانایی آنها در برش اختصاصی rnaی هدف آنها دانست. این نوع rnai (mirnai)، مزایای اصلی هر دو نوع sirna و mirna که به ترتیب هدف گیری اختصاصی و بیان دائم باشند را داراست. با در نظر گرفتن نقش باز دارندگی کالومنین بر روی گاماکربوکسیلاز، در این پژوهش ضمن طراحی دو mirna مصنوعی اینترونی بر علیه کالومنین، تاثیر آن بر بیان فاکتور 9 انسانی مورد بررسی قرار گرفته است. توالی رمز کننده ی mirna های مصنوعی ضد کالومنین در اینترون 1 کوتاه شده فاکتور 9، با اثر افزایندگی، در بالادست cdna ی فاکتور 9 انسانی قرار داده شد. پس از بررسی توالی ژن کالومنین انسان و همردیفی 6 واریانت آن دو sirna علیه توالی حفظ شده از این ژن طراحی شد و عملکرد هر یک از آنها در چارچوب یک mirna ی طبیعی، بنام mir-30a در داخل اینترون کوتاه شده 1 فاکتور 9 با بهره گیری از روش های نرم افزاری مورد پیش ‍ بینی قرار گرفت. توالی های طراحی شده طوری در نظر گرفته شدند تا در پردازش اینترون و تولید و بالغ شدگی mirna خللی وارد نگردد. پس از سنتز توالی رمز کننده دو mirna با نام های mir6 و mir5 که در اینترون 1 کوتاه شده فاکتور 9 قرار گرفته بودند، قطعه های مزبور با روش های مولکولی در ناحیه بالادست cdna فاکتور 9 در یک وکتور بیانی مجهز به پروموتر cmv قرار داده شد. پس از بررسی صحت مراحل همسانه سازی، پلاسمید های نوترکیب به صورت موقت به سلول های hek293t منتقل شدند و در ادامه میزان بیان ژن های کالومنین و فاکتور 9 انسانی در سلول های ترانسفکت شده در سطح رونویسی با روشreal-time pcr مورد بررسی قرار گرفت. نتایج اولیه بدست آمده از بررسی سلول های ترانسفکت شده با سازه های حاوی mir6 دلالت بر تولید mirnaی بالغ داشت اما کاهش بیان کالومنین مشاهده نشد که علت آن می تواند اشباع شدن exportin 5 بخاطر ازدیاد mirna های بیان شده باشد. با توجه به نتایج بدست آمده به نظر می رسد که mirnaی مصنوعی با اسکلت mir-30a بتواند از متن یک اینترون خارج شده و مراحل بلوغ را طی کند. علاوه بر این بیش بیان فاکتور ? نیز در این سلول ها در مقایسه با سلول های کنترل مشاهده شد که نشانگر پردازش کامل اینترون معرفی شده بود. به این ترتیب، علاوه بر تایید فراوری صحیح mirna مصنوعی بیان شده، کاربرد دوگانه اینترون شامل عملکرد ذاتی آن در بیان ژن مربوطه و نقش آن در حمل و تولید mirna مصنوعی مورد تایید قرار گرفت.