در این تحقیق، فرایند تولید مایکوفنولیک اسید توسط پنی سیلیوم بروی کامپکتوم در فلاسک و بیوراکتور آزمایشگاهی به صورت ناپیوسته و پیوسته انجام شد. نمودارهای تغییرات تراکم توده سلولی وغلظت های گلوکز و مایکوفنولیک اسید در هر سه فرایند، ترسیم و شار تولید یا مصرف این ترکیبات در بیوراکتور پیوسته در شرایط پایا اندازه گیری شد. سینتیک رشد قارچ و مصرف سوبسترا بر اساس پنج مدل سینتیکی مختلف بررسی شده و بیشترین انطباق با مدل کونتویس به دست آمد. یک مدل شبکه متابولیکی برای بیوسنتز مایکوفنولیک اسید در پنی سیلیوم بروی کامپکتوم طراحی شده و معادلات استوکیومتری، معادلات موازنه جرم تمامی متابولیت ها و همچنین ماتریس ضرایب استوکیومتری تعیین شدند. مقایسه شارهای محاسبه شده در مدل فوق معین با معادلات موازنه جرم، تطابق قابل قبولی را میان مدل و داده های تجربی نشان داد.کاربرد روش تجزیه و تحلیل شارهای متابولیکی نشان داد که به طور تئوری، واکنش های شماره 59 (تبدیل ایزوپنتیل دی فسفات به فارنسیل دی فسفات)،58 (تبدیل ایزوپنتیل دی فسفات به گرانیل دی فسفات)، 43 (تبدیل متیونین به اس- آدنوزیل متیونین) و 56 (تبدیل موالونات-5- دی فسفات به ایزوپنتیل دی فسفات) دارای بیشترین تاثیر مثبت و واکنش های شماره 66 (تبدیل فارنسیل دی فسفات به ارگوسترول) و10 تا 16 (مسیر پنتوز فسفات) دارای بیشترین تاثیر منفی بر تولید مایکوفنولیک اسید در این مدل می باشند. با توجه به مواد فعال کننده یا بازدارنده فعالیت آنزیمهای موثر در واکنش های فوق، ترکیباتی برای بررسی آزمایشگاهی این موضوع انتخاب شدند. کازئین تجزیه شده آنزیمی، گلیسین، استات سدیم، آرژنین، لیزین، متیونین، فلوئورید پتاسیم و ایزولوسین به ترتیب165، 112، 68، 41، 35، 29، 28 و 20 % تاثیر مثبت برتولید مایکوفنولیک اسید داشتند.

112 نمونه فرآورده های لبنی از قبیل ماست ، دوغ، شیرخام و آغوز از مناطق بکر استان های کرمانشاه، کردستان، لرستان، ایلام و مرکزی جمع آوری شد. جداسازی باکتری ها بر مبنای روش های استاندارد بین المللی انجام شد. پس از انجام کشت های متوالی بر روی محیط های اختصاصی با کسب کلنی های تیپیک و مشاهده میکروسکوپیک، 93 سویه لاکتوباسیل(سویه منتخب) جدا شد. به منظور شناسایی بیوشیمیایی سویه ها تخمیر 19 قند، همچنین رشد در دمای 15 و 45 درجه سلسیوس و واکنش در برابر اسکولین بررسی شد. سپس براساس قدرت تولید فولات و استالدئید غربالگری انجام و سویه های برتر انتخاب شدند.ژنوم سویه ها با آغازگرهای مخصوص جنس تکثیر شدند و لاکتوباسیل بودن سویه ها تایید شد. همچنین ژن s rrna 16 کامل تکثیر و در باکتری e.coli dh5? کلون شد.توالی نوکلئوتیدی ژن های همسانه سازی شده تعیین و در بانک ژن ncbi ثبت گردید. پس از مقایسه توالی های مذکور با دیگر باکتری های ثبت شده در این بانک، درخت فیلوژنی رسم گردید و مشخص شد که باکتری های تولید کننده فولات به لاکتوباسیلوس کروستوروم شباهت دارند و باکتری های تولید کننده استالدئید به لاکتوباسیلوس فرمنتوم شباهت دارند. سپس از باکتری های برتر، پروتئین استخراج و با الکتروفورز دوبعدی لکه های پروتئینی آنها از هم جدا شدند. سپس لکه های پروتئینی سویه kr43 (با توان تولید استالدئید) توسط طیف سنجی جرمی ms/ms آنالیز شدند.برخی از پروتئین های شناسایی شده معرف مسیر جدیدی برای تولید استالدئید ( از ئیدرولیز استوئین) در این باکتری می باشند. در این بررسی شناسایی و جداسازی لاکتوباسیل ها با تولید اسید فولیک بالا ( بیش از 50 میکروگرم بر لیتر) و لاکتوباسیل های دیگری با توان تولید استالدئید بالا( 20 میلی گرم بر کیلوگرم) و در نهایت معرفی یک مسیر جدید برای تولید استالدئید در لاکتوباسیل ها برای اولین بار صورت گرفته است.

با توجه به اهمیت ویروس هپاتیت c (hcv) به عنوان عامل تهدید بهداشت عمومی وعدم دسترسی به مقادیر انبوه آنتی ژن کورآن به عنوان تنها پروتئین با ثبات و پروتئین کاندید واکسن، بیان آنتی ژن کور بالغ نوترکیب نوع بومی در اشرشیا کلی مطالعه شد. بررسی بیان سه سازه بیانی ساخته شده در این تحقیق تفاوت معنی داری را به لحاظ سطح بیان نشان داد. علیرغم اختلاف ظاهرا جزیی سه سازه در سطح ژن، در سطح بیان ودر شرایط یکسان برای هر سه سازه تفاوت به لحاظ کمی چشمگیر بود. بالاترین و با ثبات ترین بیان مربوط به سازه petpelbcore بود. مطالعه بیشترو بررسی مقایسه ای میزان وفور کدونهای نادر، محتوی در صد gc ومیزان کمی بیان در سه سازه بیانی نشان داد که درصد gc سازه هادر حد طبیعی(70-30%) است ولی به لحاظ توزیع درصدکدون و انطباق کدونهای سه سازهpelbcore ، ntcore وhiscore با سیستم بیانی اشرشیا کلی به ترتیب %62، %58 و %54 می باشد. میزان بیان سازه pelbcore بیش از دوبرابر پیش بینی شده، نشان دهنده تاثیر شاخص های دیگر موثر بربیان مانند جایگاه محل اتصال ریبوزوم (rbs) و موقعیت aug آغازین در mrna بودند. برای ترشحی کردن پروتئین بیانی و همچنین توسعه کمی بیان، تاثیرچند نوع محیط کشت بر میزان بیان وامکان ترشحی کردن پروتئین در فضای پریپلاسمی بررسی شد. از بین محیط های انتخاب شده کمترین بیان مربوط به محیط واجد گلوکز و بیشترین آن مربوط به محیط lb بود اما محیط های واجد پپتون یا گلیسرول در حد هم و در مرتبه بعدی بودند. وسترن بلاتینگ و تعیین توالی پروتئین ضمن تایید صحت پروتئین نوترکیب، عدم وجود آن را در فضای پریپلاسمی و پردازش نشدن سیگنال را اثبات کرد. البته مقداری پروتئین محلول گرفتارشده در غشاء نیز وجود داشت که هنگام استحصال فرم نامحلول پروتئین، آزاد شذ. سینتیک رشد باکتری همچنین بیان پروتئین هدف در فرمانتور در شرایط fed-batch با نرخ رشد متغیر بررسی شد. طی فاز رشد نمایی حداکثر میزان بیان پروتئین هدف بالغ بر 13% پروتئین تام سلولی بود. مطالعه توالی پروتئین نوترکیب pelb::core از نظروجود توالی های مستعد بتاآگریگه شدن نشان داد که سیگنال گرچه میزان بیان را افزایش داده اما احتمالا میزان آگریگه شدن ذاتی آنرا هم توسعه داده است. البته تایید این یافته نیازمند پژوهش بیشتر است.

مولکول tnra یک تنظیم کننده گلوبال است که به قابلیت در دسترس بودن منابع نیتروژن پاسخ داده و نقش تنظیمی بر روی نسخه برداری از ژنها در حضور نیتروژن دارد. ملکول scoc یک پروتئین متصل شونده به dna است که تنظیم کننده شروع اسپورزایی و تولید پروتئاز قلیائی (apre) است. برای بررسی ارتباط این دو عامل نسخه برداری با تولید پروتئاز قلیائی، ژن های tnra،scoc و apre باکتری بومی b. clausii ehy l2 تکثیر، کلون و تعیین توالی شد. نتایج حاصل از انتقال به صورت طبیعی و الکتروپوریشن b. clausii ehy l2 نشان دهنده پایداری و غیرقابل ترایخته شدن این باکتری بود. انتقال سازه های حاوی ژن های جهش یافته به باکتری های b. licheniformis و b. subtilis صورت پذیرفت. در سویه نوترکیب b. licheniformis-ptcc1525-scoc میزان تول.....

عامل اصلی شیگلوزدر کشورهای صنعتی شیگلا سونئی بوده و مقاومت به آنتی بیوتیک های متعدد عامل گسترش باکتری است. در هر سال حدود 164 میلیون مورد آلودگی و 1/1 میلیون مورد مرگ در اثر این بیماری در سرتاسر جهان گزارش میشود. اخیرا در ایران تغییر الگوی گسترش از شیگلا فلکسنری به شیگلا سونئی گزارش شده است. در حال حاضر هیچگونه واکسن متداولی علیه شیگلا وجود ندارد. علت این امر بروز مشکلاتی در توسعه واکسن علیه این باکتری می باشد. فقدان مدل حیوانی مناسب، شواهد غیرمستقیم از مکانیسم های درگیر در ایمنی انسان و احتمالاً وفور بالای تبدیل فرم باکتری از جمله این مشکلات میباشند. شیگلا سونئی دارای دو فرم i وii میباشد که فرم i با از دست دادن پلاسمید بیماریزایی، به فرم iiتبدیل میشود. این وضعیت برای باکتری تخفیف حدت یافته نیز میتواند رخ دهد، بنابراین باکتری حاصل، توان ورود به سلول اپیتلیال را نخواهد داشت ودر نتیجه امکان القاء سیستم ایمنی را از طریق سلولهای دندریتیک از دست خواهد داد. مطالعات بیشتری جهت پایدار نمودن شیگلا در فرم i ضروری به نظر میرسد که در واقع اولین قدم در راستای دستیابی به یک واکسن کارآمد بر علیه شیگلا خواهد بود. شیگلا پس از اتصال از طریق طریق سیستم ترشحی نوع iii خود و با واسطه ipab به رشته های لکتین سطح سلولهای اپی تلیال روده عوامل بیماریزایی خود یعنی پروتئین های d، c،b ، a ipa را به داخل غشاء سیتوپلاسمی سلول میزبان وارد می نماید. این امر سبب ورود باکتری با مکانیسم ماکروپینو سیتوز به سلولهای m شده و با عبور ازاین سلولها به محل تجمع ماکروفاژها می رسد و وارد آنها می شود. با ادامه یافتن تولید پروتئین ipab روند آپاپتوز ماکروفاژ آغاز می گردد. در جهت دستیابی به یک باکتری تخفیف حدت یافته شیگلا سونئی بومی ایران که به غیر از ipab یعنی عامل مرگ ماکروفاژها، سایر آنتی ژنهای باکتری را در خود داشته و تحت شرایط کشت آنها را حفظ نماید در این پژوهش دو دسته فعالیت انجام شدند. 1-بهینه سازی شرایط محیط کشت شیگلا سونئی با هدف پایدار سازی این باکتری در فرم i. 2- غیر فعال سازی ژن کد کننده پروتئین ipab (ipab) که نقش محوری در رفتار تهاجمی باکتری دارد به منظور دستیابی به شکل پایدار کلنی شیگلا سونئی تاثیر دمای رشد و نوع محیط کشت بر شکل کلنی های باکتری جدا شده از بیمار بررسی شدند. همچنین ترکیباتی مانند ویتامینهای ب کمپلکس، ریبوفلاوین، نیکوتینیک اسید و کازامینواسید به محیط کشت پایه افزوده و تاثیر آنها بر شکل کلنی شیگلا سونئی ارزیابی شد. کشت شیگلا سونئی بر روی محیط دارای ریبوفلاوین و نیکوتینیک اسید رشد کلونی هایی صاف و گرد یعنی فرم i را در پی داشت و به عبارت دیگر باعث تثبیت کلنی ها در فرم i گردید . در مرحله دوم و به منظور تهیه باکتری فاقد ژن ipab استفاده از dna دو رشته ای خطی با 500 جفت باز همسان با بالادست و پایین دست این ژن در دو طرف ژن جایگزین شونده یعنی bla و انتقال آن به شیگلا سونئی مستعد دارای سیستم نوترکیبی ?-red باعث دستیابی به باکتری نوترکیب و جایگزینی ژن هدف با bla گردید. در مرحله بعد ژن ipab در پایین دست پروموتر آرابینوز کلون گردید و در پایین دست ipab ژن gfp کلون شده پلاسمید حاصل به شیگلا سونئی نوترکیب منتقل شد. در نهایت شیگلا سونئی نوترکیب فاقد ژن ipab، شیگلا سونئی نوترکیب دارای سازه کد کننده ipab و شیگلا سونئی وحشی(والد باکتریهای نوترکیب مذکور) هر سه از نظر توان ورود به سلول یوکاریوتی مورد مطالعه قرار گرفتند. نتایج نشان داد که شیگلا سونئی وحشی و باکتری نوترکیب دارای سازه کد کننده ipab و القاء شده با غلظت 1% آرابینوز می توانند وارد سلول های hela گردیده و در آنها تکثیر نمایند. این مشاهده در مورد شیگلا سونئی فاقد ژن ipab مطابق با انتظار و با عدم توانایی در آلوده سازی سلول اپیتلیال همراه بود. بدین ترتیب باکتری اخیر می تواند به عنوان سویه کاندید برای مطالعات تهیه واکسن زنده مورد استفاده قرار گیرد. کلید واژه: شیگلا سونئی، ipab، آپاپتوز، محیط کشت، نیکوتینیک اسید، سیستم نوترکیبی ?-red

قارچ های خوراکی از جمله آگاریکوس بیسپاروس بخش مهمی از رژیم غذایی در بسیاری از کشور های جهان می باشند. تشکیل اندام باردهی در این قارچ مستلزم تغییر فاز رویشی به زایشی است. قارچ آگاریکوس بیسپاروس به یک لایه خاک پوششی با ویژگی های فیزیکی، شیمیایی و میکروبیولوژیکی خاصی، برای تحریک و آغاز پریموردیا نیاز دارد. تغییر فاز به طور خاص با کاهش دما و غلظت دی اکسید-کربن و همچنین حضور باکتری های سودوموناس پوتیدا انجام می شود. مکانیسم های تحریک رشد و توسعه قارچ توسط باکتری ها به طور دقیق شناخته نشده است. اما تصور می شود که سودوموناس پوتیدا از طریق ترشح ترکیبات شبه هورمونی، مصرف ترکیبات تولید شده توسط میسلیوم قارچ، تولید سیدروفور و حل کردن فسفات های آلی و معدنی مسئول این فرآیند است. قارچ دکمه ای سفید آگاریکوس بیسپاروس به عنوان محصولی که می تواند در تمام طول سال پرورش داده شود، شناخته شده و از سوی دیگر به علت بازده اقتصادی مناسب، به عنوان یک صنعت موفق درآمده است. بنابراین ارائه هرگونه پیشنهاد عملی و قابل اجرا برای افزایش رشد و بازدهی قارچ خوراکی آگاریکوس بیسپاروس لازم و ضروری است. در این پژوهش، وضعیت فلور میکروبی لایه پوششی 14 مزرعه پرورش قارچ خوراکی در سال 1388 مورد بررسی میکروبیولوژیکی قرار گرفت. 274 سویه باکتریایی از این نمونه ها با کشت بر روی محیط های عمومی(lb) luria-bertani و اختصاصی s1، به ترتیب جداسازی شدند. آزمون های بیوشیمیایی، برای تمامی سویه ها انجام شد. رشد در حضور ترکیب فرار 1-octen-3-ol، توان تولید سیدروفور و حل کنندگی فسفات های آلی و معدنی، در سویه ها بررسی شد. نتایج نشان داد که 97% از سویه ها توانایی رشد در حضور مقادیر بالای ترکیب فرار 1-octen-3-ol را دارند. همچنین، 36% و 52% از سویه ها به ترتیب، توانایی حل کردن فسفات های معدنی و آلی، را داشتند. در نهایت با توجه به ویژگی های مذکور (بیوشیمیایی، رشد در حضور 1-octen-3-ol، توان تولید سیدروفور و توانایی حل کردن فسفات های آلی و معدنی) 27 سویه برای ادامه تحقیقات انتخاب شدند. نتایج آزمون های مزرعه نشان داد که سه سویه bt4، ps7 و pd8، با 14%، 12% و 43/11%، به ترتیب، بیشترین افزایش در تولید و بازدهی کمی و دو سویه pd12 و ps7 با 23% و 11% به ترتیب، بیشترین افزایش در بازده کیفی قارچ آگاریکوس بیسپاروس را نسبت به شاهد نشان دادند. این سویه ها (bt4، ps7 و pd8) شناسایی مولکولی شدند. dna کروموزومی سویه ها استخراج و ژن های 16s rrna توسط pcr و با استفاده از پرایمر های عمومی fd1 و rd1 تکثیر و سپس در وکتور پلاسمیدی ptz57r/t کلون و به باکتریe.coli dh5? منتقل شدند. تأیید نهایی کلونینگ ژن، توسط تعیین توالی انجام شد. توالی ژن16s rrna در بانک ژن مرکز اطلاعات بیوتکنولوژی آمریکا (ncbi) ثبت شد. کد دسترسی به این ژن ها در این سایت عبارتند از bt4 (hq613735) و ps7 (hq613736) می باشد. در نهایت سویه های سودوموناس پوتیدا bt4، ps7، pd8 و pd12 به عنوان مایه تلقیح برای افزایش تولید و بازدهی (کمی و کیفی) محصول قارچ خوراکی دکمه ای سفید (agaricus bisporus) معرفی شدند که از اهداف پژوهش حاضر بود.

انتقال نفت سنگین توسط خط لوله یکی از مهمترین و مناسب ترین روشهای انتقال بوده و ویسکوزیته بالای ترکیبات سنگین نفتی و رسوب گذاری آنها در مسیر انتقال، بارزترین مشکل این نوع انتقال است. امولسیون نمودن نفتهای سنگین در آب یکی از بهترین روشهای حل این مشکل محسوب می شود. در این پروژه برای تشکیل امولسیون پایدار و مناسب، از چهار سویه میکروبی aco4، aco1، 91-b و1072 برای تولید امولسیون کننده های زیستی استفاده شده است. این امولسیون کننده ها با رشد سویه ها در محیط کشت و شرایط مناسب، تولید و طی فرآیندی چند مرحله ای، جداسازی شده اند. با بکار گیری این مواد و اجرای دقیق فرآیند امولسیون سازی، امولسیون های مختلف نفت در آب برای تمام سویه ها و دو نمونه نفت سنگین تهیه شده از میادین نفتی نوروز و سروش، ساخته شدند. مطابق مدل طراحی آزمایش تاگوچی آزمایش های کاهش ویسکوزیته و پایداری امولسیون انجام شده و توانایی این امولسیون کننده های زیستی در ایجاد یک امولسیون پایدار نفت در آب به اثبات رسید. در شرایط بهینه (35% آب، 32/1% امولسیون کننده حاصل از سویه aco4 و 45 درجه سانتیگراد دما) میزان ویسکوزیته نمونه های نفت سنگین تا 98% کاهش یافته و تا 48 ساعت پایدار ماندند. این کاهش بعد از گذشت 8 روز به 60% رسید. با توجه به توان بالای این امولسیون کننده در امولسیون سازی نفت سنگین در آب، در بخش دوم این پروژه از این ماده برای امولسیون سازی در مقیاس پایلوت استفاده شد. با تشکیل امولسیون نفت در آب در مقیاس نیمه صنعتی و ایجاد شرایط بهینه، ویسکوزیته نمونه نفت سنگین بعد از کاهش تا cp 830 تا 72 ساعت پایدار ماند. با عبور امولسیون تولیدی از خط لوله نیمه صنعتی و مقایسه میزان رسوب گذاری آن با نفت سنگین، کاهش رسوب گذاری در اثر عبور نفت به شکل امولسیون مشخص است. این مزیت، شرایط راحتتر و کم هزینه تری را برای انتقال نفت سنگین توسط خط لوله، فرآهم می آورد.

مایکوفنولیک اسید با مهار آنزیم اینوزین منوفسفات دهیدروژناز باعث جلوگیری از انجام مرحله ی کلیدی سنتز نوکلئوزیدهای پورینی یعنی اکسیداسیون اینوزین منوفسفات به گوانوزین منوفسفات می شود.علیرغم اهمیت این دارو و کاربردهای رو به افزایش آن، اطلاعات کمی راجع به آنزیم های درگیر در مسیر تولید mpa در قارچ ها ی تولید کننده ی این ماده موجود است بنابراین، لزوم طراحی یک سیستم بیولوژیکی در تولید این ترکیب احساس می شود.ژن کدکننده آنزیم اینوزین منوفسفات دهیدروژناز (impdh) با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی توسط pcr از ژنوم قارچ پنی سیلیوم بروی کامپکتوم تکثیر شد. قطعه موردنظر در t/a وکتور همسانه سازی و حضور ژن به روشهای colony pcr، برش آنزیمی و تعیین توالی تائید شد. سپس ژن مورد نظر در وکتور بیانی ppiczb کلون و برای انتقال به مخمر پیکیا پاستوریس آماده شد. انتقال ژن به سلول های مخمری به روش الکتروپوریشن انجام گردید و پروتین نوترکیب تحت کنترل پروموتر aox1در محیط القایی حاوی متانول بیان شد. سپس مقاومت سلول های نوترکیب نسبت به mpa بررسی شد. هم چنین میزان فعالیت آنزیم نوترکیب با بررسی میزان nadh آزادشده در محیط محاسبه گردید. نتایج بدست آمده حاکی از تولید سویه ی نوترکیبی است که در مقایسه با سویه ی وحشی ده برابر نسبت به mpa مقاوم تر است.

پروتئازها آنزیم هایی هستند که هیدرولیز کلیه پروتئین ها را بر عهده دارند و از مهمترین و پرکاربردترین آنزیم ها به شمار می روند. هدف از این تحقیق تثبیت باکتری باسیلوس کلوزیehy_l2 به منظور افزایش تولید پروتئاز قلیایی بود. بهینه سازی شرایط تثبیت با استفاده از نرم افزار آماری انجام شد. سپس تغلیظ و خالص سازی آنزیم جهت تعیین برخی ویژگی های آن صورت گرفت. روش بهینه سازی پاسخ سطحی rsm با استفاده از روش ccd برای تعیین شرایط بهینه تولید پروتئاز و کاهش رها شدن سلول از دانه های کلسیم آلجینات صورت گرفت. در این روش سه فاکتور غلظت سدیم آلجینات، کلسیم کلراید و میزان تلقیح بهینه سازی شدند و میزان پروتئاز تولیدی و رها شدن سلول از دانه های آلجینات نیز مورد سنجش قرار گرفت. مدل ارائه شده دارای r2 برابر9965/0 و f-value برابر18/1492بود، لذا برای تتبیین شرایط آزمایش در محدوده مورد نظر قابل استفاده می باشد. شرایط بهینه پیش گویی شده توسط نرم افزار شامل مقادیر (w/v)%3 و (w/v) %44/3 به ترتیب برای سدیم آلجینات و کلسیم کلراید بود و میزان بهینه تلقیح نیز برابر ml15 بود. نتایج حاصل از آزمایش در شرایط بهینه مقادیر u/ml956 و 2/2 را برای پروتئاز و رها شدن سلول را به دست داد که به مقدار پیشگویی شده نزدیک بود. تثبیت بر روی حامل های اسفنج پلی یورتان و باگاس نیز صورت گرفت. این نتایج نشان داد که آلجینات برای تولید آنزیم و حفظ سلول ها مناسب تر از سایر حامل های به کار رفته است. کشت های غیر مداوم تکراری با استفاده از سلول های تثبیت شده در حامل آلجینات در مقیاس فرمانتور 2 لیتری صورت گرفت. شرایط بهینه بدست آمده در برنامه rsm، جهت راه اندازی فرمانتور مورد استفاده قرار گرفت، سه بار کشت های غیر مداوم درون فرمانتور تکرار شدند و میزان پروتئاز بدست آمده و مقدار سلول های رها شده از دانه های آلجینات در تکرار اول u/ml1400 و 4 و در تکرار دوم u/ml1250 و 3/3 و در تکرار آخر نیز برابر u/ml1110 و 3 بود که مجموعاً در این سه تکرار u/ml3760 پروتئاز به دست آمد. تغلیظ آنزیم پروتئاز با استفاده از سولفات آمونیوم %70 و تخلیص آن با استفاده از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی deae-52 صورت گرفت. درصد بازیافت آنزیم بعد از کروماتوگرافی نسبت به نمونه اولیه به %64 رسید و فاکتور تخلیص بعد از کروماتوگرافی 02/3 بود. همچنین فعالیت ویژه حاصل از تخلیص آنزیم برابر u/ml935 بود که میزان پروتئین آن mg7/0 و با فعالیت u/ml655 گزارش شد. با استفاده از ژل الکتروفورز جرم ملکولی آنزیم حدود 30 کیلودالتون تعیین شد. km و vmax آنزیم پروتئاز خالص شده با استفاده از کازئین به عنوان سوبسترا تعیین شد و به ترتیب برابر mµ370 و u/ml360 بود. همچنین اثر بازدارنده های pmsf و edta بر آن باعث کاهش فعالیت آن شد و ki در حضور این بازدارنده ها به ترتیب mµ 250 و mµ 252 بود و همچنین میزان vmax این دو مهارکننده به ترتیب u/ml 64 و u/ml 92 به دست آمد. همچنین اثر بازدارنده ها بر آنزیم بر روی ژل زایموگرام باعث محو شدن باندهای مربوطه گردید که نشان دهنده وجود متالو و سرین پروتئازها در نمونه بود.

لیپازها یا تری آسیل گلیسرول هیدرولازها (ec. 3.1.1.3)، آنزیمهایی هستند که در صنایع گوناگون مانند غذا، دارو، تولید شوینده ها، و غیره کاربرد دارند. لیپازهای تولید شده توسط میکروارگانیسم های گرما دوست به دلیل پایداری در دماهای بالا، حلال های آلی و نیز phهای قلیایی, برای استفاده در صنعت مناسبترند. لیپاز btl2 مربوط به باکتری گرما دوست باسیلوس ترموکاتنولاتوس علی رغم این ویژگیهای مطلوب، دارای محدودیتهایی است که از آن جمله می توان به عدم توانایی در تجزیه سوبستراهای بزرگ اشاره کرد. افزایش فضا و کاهش ممانعت فضایی در جایگاه فعال، احتمالاً سبب تسهیل ورود سوبستراهای بزرگتر و در نتیجه باعث تغییر ویژگی سوبسترایی آنزیم خواهد شد. به این منظور، آمینواسید فنیل آلانین 17 که به سمت جایگاه فعال قرار گرفته و به دلیل زنجیره جانبی بزرگ خود، باعث کاهش فضا و افزایش ممانعت فضایی در جایگاه فعال شده است با آمینواسید کوچکتر آلانین جایگزین شد. سپس فعالیت آنزیم جهش یافته در حضور سوبستراهای مختلف و نیز اثر عوامل گوناگون مثل دما، ph، حلال های آلی، دترجنت ها و یون های فلزی بر فعالیت آنزیم بررسی شد. نتایج نشان داد که جهش اعمال شده، فعالیت آنزیم را در حضور همه سوبستراها به جز سوبسترای 14 کربنه، نسبت به آنزیم طبیعی افزایش داد ولی تغییر قابل ملاحظه ای در ویژگی سوبسترایی آنزیم ایجاد نشد. نتایج همچنین نشان داد که در حضور عوامل گوناگون، لیپاز جهش یافته در مقایسه با لیپاز طبیعی فعالیت بالاتری دارد ولی با این حال، مقایسه فعالیت لیپازهای طبیعی و جهش یافته نسبت به نمونه کنترل نشان داد که جهش تنها باعث افزایش پایداری حرارتی لیپاز شده است و در حضور عوامل دیگر، لیپاز جهش یافته پایداری کمتری در مقایسه با لیپاز طبیعی نشان می دهد. این نتایج نشان می دهد که با جایگزین شدن فنیل آلانین 17 با آلانین، ممانعت فضایی کاهش و به دنبال آن فضای جایگاه فعال افزایش یافته است که این امر احتمالاً سبب تسهیل ورود سوبسترا به جایگاه فعال شده است.

مایکوفنولیک اسید، یکی از متابولیت های ثانویه است که توسط بعضی از گونه های قارچی تولید می شود. این دارو که دارای خاصیت آنتی بیوتیکی و بازدارنده ی سیستم ایمنی می باشد توسط چندین سویه پنی سیلیوم تولید می شوند که در این میان پنی سیلیوم بروی کامپکتوم بیشترین تولید را نشان داده است. قارچ های تولیدکننده ی متابولیت های ثانویه، به فراوانی در خاک یافت می شوند. حضور قارچ های تولید کننده ی این آنتی بیوتیک نیز در خاک گلخانه ها، جنگل های بارانی گرمسیری و زمین های کشاورزی و نیز مواد غذایی، میوه و لبنیات فاسد گزارش شده است. در این تحقیق به منظور جداسازی سویه پنی سیلیوم بومی مولد مایکوفنولیک اسید، از خاک مناطق مختلف و نیز مواد فاسد ذکر شده نمونه برداری انجام شد. پس از کشت نمونه ها روی محیط کشت اختصاصی، 140 سویه پنی سیلیوم جداسازی گردید. تمامی این سویه ها در محیط کشت مایع (czapek-dox) و به مدت 12 روز در دمای 28 درجه سانتی گراد گرماگذاری شدند. سپس از محلول رویی کشت نمونه-برداری و از نظر تولید این آنتی بیوتیک با hplc آنالیز شدند. 3 سویه پنی سیلیوم بومی تولیدکننده ی مایکوفنولیک اسید جداسازی شد و سویه ی با بالاترین تولید از نظر مورفولوژیکی(ماکروسکوپی و میکروسکوپی) و ملکولی(توالی s rdna18) شناسایی شد. نتایج نشان داد که این سویه پنی سیلیوم گلابروم می باشد که تاکنون تولید این آنتی بیوتیک توسط آن گزارش نشده است. همچنین حضور دو ژن hmg و mddاز ژن های اصلی مسیر بیوسنتز این آنتی بیوتیک، در سویه تولیدکننده شناسایی شد. برای این کار از پرایمرهای طراحی شده قبل استفاده شد. این پرایمرها پس از انجام همردیفی چندگانه توالی بر اساس توالی-های آمینواسیدی کد شده توسط این ژن ها در گونه های قارچی دیگر، از نواحی حفاظت شده ی بین توالی ها طراحی شدند. قطعات به دست آمده از این ژن ها درون وکتور کلون و تعیین توالی شدند. همچنین برای اثبات بیان این ژن ها، ابتدا استخراج rna و سپس rt-pcr انجام و حضور mrna ی این ژنها اثبات شد. قطعات dna حاصل از rt-pcr کلون و تعیین توالی شدند. در آخر توالی نوکلئوتیدی به دست آمده از ژن و cdna آنها مقایسه شدند

لیپازها خصوصاً لیپازهای با منشأ میکروبی، گسترده ترین گروه آنزیم هایی هستند که کاربردهای زیست -فناوری و شیمی آلی همچون کاربرد در صنایع غذایی، شوینده ها، صنایع دارویی، کشاورزی و... دارند. لیپازهای باکتریایی عضو خانواده ?/? هیدرولازها هستند که هیدرولیز و سنتز اسیل گلیسرول ها در حدفاصل آب-چربی را کاتالیز می کنند. بهبود ویژگی ها و فعالیت کاتالیتیک لیپازها به عنوان سومین آنزیم صنعتی دنیا جهت کاربردهای تجاری اهمیت زیادی دارد. مقایسه ساختار ?/? هیدرولازها و لیپازهای ژئوباسیلوسی نشان می دهد که جایگاه اتصال فلز zn2+ (?3 ،b1 و b2) تا کنون در تاخوردگی متعارف ?/? هیدرولازها دیده نشده است. این پژوهش به بررسی اثر حذف مارپیچ ?3 بر فعالیت لیپاز geobacillus thermocatenulatus (btl2) که لیپازی ترموآلکالوفیل است می پردازد. بدین منظور ابتدا مطالعات بیوانفورماتیکی و پیشگویی ساختمان جهت بررسی اثر حذف مارپیچ ?3 بر ساختمان و عملکرد لیپاز انجام شد. پیشگویی عملکرد لیپاز با حذف ناحیه ?3، افزایش فعالیت لیپاز در برابر سوبستراهای 4 تا 10 کربنه را نشان داد. سپس مارپیچ ?3 با روش soe-pcr از ژن لیپاز btl2 حذف شد، بیان ژن لیپاز جهش یافته در مخمر pichia pastoris و خالص سازی با روش کروماتوگرافی تعویض یونی انجام شد. بررسی فعالیت لیپاز جهش یافته نشان داد که حذف ناحیه ?3، فعالیت کلی لیپاز در حضور سوبسترای 4 کربنه (سوبسترای مطلوب این لیپاز) را 8/1 برابر (u/mg 13418)، در حضور سوبسترای 8 کربنه 2/2 برابر (u/mg 10974) و برای سوبسترای 18 کربنه 1/2 برابر (u/mg 3635) افزایش می دهد. ویژگی سوبسترایی به سمت هیدرولیز سوبستراهای بزرگتر تغییر یافت. محدوه فعالیت لیپاز جهش یافته در دماهای 50 تا 60 درجه سانتی گراد و ph 7 تا 10 افزایش یافت. پایداری دمایی لیپاز جهش یافته تغییر چندانی نداشت. یون-های فلزی mn2+ و k+ فعالیت نسبی لیپاز جهش یافته را افزایش دادند اما افزایش فعالیت لیپاز جهش یافته در حضور یون zn2+ بسیار قابل توجه بود در حالیکه یون zn2+ فعالیت لیپاز طبیعی را مهار کرد. فعالیت لیپاز جهش یافته در حضور یون های ca2+ و mg2+ همانند فعالیت لیپاز طبیعی بود و در حضور یون na+ فعالیت لیپاز جهش یافته تغییری نکرد. در حضور حلال های آلی غیر قطبی فعالیت لیپاز جهش -یافته افزایش یافت، اما اثر سورفکتانت ها بر فعالیت لیپاز جهش یافته، همانند لیپاز طبیعی بود. بنابراین از لیپاز جهش یافته می توان جهت کاربرد در بخش های مختلف صنعت استفاده کرد.

لیپازها آنزیم هایی هستند که هیدرولیز تری گلیسریدها را در حد فاصل آب و سوبسترا کاتالیز می کنند. لیپازهای ترموآلکالوفیل به دلیل داشتن ویژگی های منحصر به فرد از قبیل مقاومت به پروتئازها، دترجنت ها و سایر عوامل همراه با پایداری شدید آنها در دماهای بالا و حلال های آلی، از مهمترین کاتالیزورهای زیستی می باشند. لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس (btl2) نوعی لیپاز ترموآلکالوفیل است که در دمای 75-60 درجه سانتیگراد و ph برابر 10 -8 فعالیت می کند. این ویژگی ها باعث تبدیل این لیپاز به یک گزینه مناسب برای کارهای تحقیقاتی و همچنین کاربردهای صنعتی شده است. در این تحقیق، کل توالی پنتا پپتیدی (ala-his-ser-gln-gly) ناحیه زانوی هسته دوست لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس با توالی پنتا پپتیدی (gly-glu-ser-ala-gly) ناحیه مشابه از لیپاز قارچ کاندیدا روگوزا جایگزین شد. برای این منظور ابتدا جهش مورد نظر با استفاده از روش جهش زایی در محل در ژن btl2 ایجاد شد. در مرحله بعد لیپاز btl2 جهش یافته در باکتری e. coli کلون و در مخمر pichia pastoris به صورت یک پروتئین ترشحی بیان شد. در پایان فعالیت آنزیمی لیپاز طبیعی و جهش یافته در حضور سوبستراهای مختلف اندازه گیری شد. همچنین اثر عوامل مختلف از قبیل دما، ph، دترجنت ها، حلال های آلی و یونهای فلزی بر روی فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدست آمده نشان داد که فعالیت آنزیمی لیپاز جهش یافته برای همه سوبستراهای بکاربرده شده به غیر از تری مریستین (14c) و تری پالمیتین (16c) بیشتر از آنزیم طبیعی می باشد، همچنین جهش ایجاد شده پایداری دمایی، و مقاومت آنزیم نسبت به عوامل بررسی شده از قبیل دترجنت ها، حلال ها و یونهای فلزی، را افزایش داده است.

لیپازها (تری آسیل گلیسرول آسیل هیدرولازها ec 3.1.1.3 ) هیدرولیز تری آسیل گلیسرول به اسیدهای چرب و گلیسرول را در حد فاصل لایه چربی و آب کاتالیز می کند.این آنزیم ها کاربردهای فراوانی در صنایع غذایی، کشاورزی، روغن، چوب و کاغذ، پزشکی و دارویی دارند. از مهمترین کاربردهای لیپاز استفاده در شوینده های خانگی برای از بین بردن لکه های چربی می باشد. لیپازهای باکتریایی نوترکیب بخش مهمی از تجارت آنزیم ها هستند. در این تحقیق لیپاز باکتریایی که قبلا" از یک باسیلوس پامیلوس( bacillus pumilus) بومی از خاک جداسازی و ژن مربوط به آن توالی یابی شده بود، در میزبان مخمری پیکیا پاستوریس(( pichia pastoris کلون و بیان شد. پس از تکثیر ژن لیپاز دارای توالی راهنمای باسیلوسی وبدون توالی راهنمای باسیلوسی (لیپاز بالغ) با روش pcr ، محصول pcr در وکتور pgem5zf کلون گردید. سپس ژن لیپاز از حامل کلونینگ خارج ودر حامل بیانی تحت کنترل دو پروموتر الکل اکسیداز و گلیسرآلدهیدفسفات دهیدروژناز کلون شده وسازه حاصل پس از تأیید کلونینک با روش های ملکولی و آنزیمی با روش الکتروپوریشن به درون مخمر بیانی پیکیا پاستوریس( pichia pastoris ) انتقال داده شد. بیان آنزیم لیپاز در محیط کشت بیانی تأیید آن با تست پارانیتروفنیل پالمیتات(pnpp ) و روش sds-page انجام شد. سپس برای بیان بهتر و بالای این آنزیم در مخمر، بهینه سازی قابلیت ترجمه پذیری کدون های ژن باسیلوسی براساس میزبان مخمری انجام و ژن بهینه به صورت مصنوعی ساخته شد و در درون ژنوم مخمر میزبان کلون وبیان شد.در نهایت میزان بیان این دو با هم مقایسه شد.

بیماری بورس عفونی در جوجه ها سبب سرکوب سیستم ایمنی جوجه شده و از این طریق عفونت های بعدی ایجاد می گردد. در حال حاضر انواع واکسن های حاصل از تکثیر ویروس برای مقابله با این عفونت استفاده می شود. استفاده از واکسن های زیر واحدی در سال های اخیر مورد توجه قرار گرفته است. آنتی ژن سطحی vp2 بعنوان آنتی ژن هدف جهت تولید واکسن زیر واحدی گزینه مناسبی است. مطالعات متعددی بر روی تولید این پروتئین در سیستم های مختلف پروکاریوت و یوکاریوت صورت گرفته است. در مطالعات قبل آنتی ژن vp2 به صورت خالص شده و از طریق محیطی و یا بصورت میکروارگانیزم کامل و از طریق خوراکی استفاده شده است. در مطالعه حاضر پروتئین vp2 از ویروس ibdv بعنوان کاندید واکسن جهت بیان در قارچ رشته ای آسپرژیلوس نایجر مورد استفاده قرار گرفت. پروتئین مذکور در قارچ تراریخته بیان و بیان آن از طریق روش های الکتروفورز و وسترن بلات تائید شد. قارچ تراریخته در فرمانتور تکثیر و توده زیستی حاصل در رژیم غذائی جوجه های یک روزه استفاده شد. در این مطالعه نشان داده شد که قارچ رشته ای بعنوان حامل واکسیناسیون خوراکی قابل بکارگیری است. هر چند که تحریک سیستم ایمنی توسط آنتی ژن vp2 از راه خوراکی بطور نسبی محقق شده ولی وجود آنتی سرم علیه سایر پروتئین های قارچی موید تحریک سیستم ایمنی و امکان استفاده از قارچ خوراکی بعنوان واکسن خوراکی می باشد. از نکات بارز این مطالعه استفاده از قارچ آسپرژیلوس نایجر بعنوان میزبان بیان vp2 برای اولین بار و همچنین بکارگیری این قارچ رشته ای بعنوان حامل در استفاده خوراکی و واکسیناسیون از راه خوراکی می باشد.

تحقیق حاضر با هدف دستیابی به تک کلون های مولد طول کامل زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی منوکلونال داروئی تراستوزومب طی مراحل مختلفی صورت پذیرفت. در ابتدا توالی کدکننده طول کامل هر کدام از زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی با در نظر گرفتن توالی های مناسب برای آغاز و خاتمه رونویسی و ترجمه در ناقل یوکاریوتی طراحی و ساخته شد. سپس هر کدام از توالی ها در داخل ناقلین دوگانه poptivec-topo و pcdna 3.3 topo وارد شد. بعد از انجام مراحل همسانه سازی و انتخاب در میزبان پروکاریوتی، سازه هایی که توالی هر زنجیره را بطور کامل و در جهت درست دریافت کرده بودند، برای تراریختی در میزبان یوکاریوتی (cho dg44) استفاده شدند. تراریختی به روش لیپوفکشن صورت پذیرفت و در نهایت طی مراحل مختلف انتخاب، سلولهایی بدست آمدند که هر دو سازه حاوی ژن زنجیره سبک و سنگین را دریافت نموده بودند. در مرحله بعد انتخاب کلون ها در محیط نیمه جامد با هدف دستیابی به تک کلون های پایدار بیان کننده زنجیره سبک و سنگین آنتی بادی منوکلونال داروئی تراستوزومب صورت پذیرفت. در این مرحله از میان جمعیت تراریخت شده اولیه، هجده سازه بدست آمد که به ترتیب std 3-18, 20, 21 نام گذاری شدند. از طرف دیگر dna ی ژنومی مربوط به هر کدام از کلون ها استخراج شد و با استفاده از pcr چندگانه حضور ژن زنجیره های سبک و سنگین آنتی بادی مورد نظر در داخل ژنوم هر سازه به اثبات رسید. بدنبال این مرحله برای تایید بیان پروتئین اختصاصی از آزمون های sds-page و وسترن بلاتینگ استفاده شد. برای نمونه های سوپ سلولی بعد از تغلیظ، sds-page بر روی ژل 10% انجام پذیرفت و بدنبال آن نمونه ها بر روی غشا pvdf منتقل گردیدند. در اکثر نمونه های بدست آمده از سوپ سلولی، زنجیره سبک با وزن مولکولی kda 28 بصورت یک باند پهن مشاهده شد، در حالیکه باند مربوط به زنجیره سنگین خیلی قابل تمیز نبود. در این مرحله با توجه به اینکه ژن زنجیره سنگین همراه با ناقل poptivec و در کنار ژن dhfr، به داخل ژنوم سلولها وارد شده بود، امکان تکثیر ژنومی با متوترکسات برای ورود نسخه های بیشتری از ژن زنجیره سنگین به داخل ژنوم سلولها وجود داشت. به این ترتیب طی هفت مرحله تیمار سلولها با متوترکسات، سازه هایی بدست آمدند که میزان مساوی از هر دو ژن را بیان کرده و به داخل محیط کشت ترشح می نمودند. در ادامه میزان بیان گیرنده her2 بر روی انواع رده های سلولی بدست آمده از سرطانهای تخمدان و پستان با استفاده از روش های اختصاصی ایمنوسایتوشیمی و فلوسایتومتری و با استفاده از آنتی بادی تجاری هرسپتین و آنتی بادی مشابه تولیدی در این پژوهش مورد مطالعه قرار گرفت. در این میان رده های سلولی sk-br-3 و sk-ov-3 بیشترین توانائی را در اتصال به آنتی بادی های مورد نظر داشتند که نشانگر بیان بالای گیرنده مورد مطالعه بر روی سطح این سلولها می باشد. مقایسه نتایج نشان دهنده قدرت قابل توجه آنتی بادی تولیدی در اتصال به گیرنده هدف در مقایسه با نمونه تجاری هرسپتین می باشد.

ویروس زردی غربی چغندرقند (bwyv) beet western yellows virus یکی از ویروس های مهم بیماری زا در گیاهان می باشد. تشخیص سریع و به موقع این ویروس نقش به سزایی در اتخاذ روش های کنترل و خسارت آن دارد. از روش های متداول، معتبر و ارزان برای تشخیص ویروس در سطح وسیع، روش سرولوژیکی می باشد که در این روش تامین منبع آنتی ژن ویروسی برای استفاده در فرآیند تولید آنتی بادی پلی کلونال ضروری است. در تحقیق حاضر ژن رمزکننده پروتئین پوششی bwyv، جدا شده از ایران (bwyv-cl10)، طی واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) تکثیر شد و در ناقل بیانی pet26b همسانه سازی گردید و سازه حاصل pet-bwyv-cp نامیده شد. سپس این سازه به سویه بیانی (bl21) باکتری escherichia coli منتقل شد و بیان پروتئین پوششی نوترکیب با iptg القاء گردید. سپس نمونه برداری در ساعات مختلف (2، 4، 6 و 8 ساعت) پس از القاء انجام شد. پروتئین محلول کل استخراج و به کمک الکتروفورز در ژل sds-page تفکیک گردید و باند پروتئین مورد نظر مشاهده شد. صحت پروتئین بیان شده توسط روش لکه گذاری وسترن و با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال اختصاصی تولید شده علیه ذرات ویروسی تأیید شد. با الکتروفورز قطعه ژل حاوی پروتئین نوترکیب در کیسه دیالیز این پروتئین خالص سازی گردید و برای حذف بافر الکتروفورز، پروتئین نوترکیب به مدت 24 ساعت علیه آب مقطر دیالیز شد. سپس پروتئین خالص سازی شده با استفاده از دستگاه لیوفیلیزه کننده تغلیظ و به خرگوش جهت تولید آنتی سرم تزریق شد. آنتی سرم تولید شده، پروتئین پوششی نوترکیب را در عصاره باکتری نوترکیب القاء شده و مخلوط با عصاره پروتئینی گیاه کلزا سالم با استفاده از تکنیک وسترن بلات با رقت 1:45000 شناسایی نمود اما واکنش مثبتی با عصاره گیاهان کلزای آلوده مشاهده نشد. نتایج این مطالعه پیشنهاد می کند که تولید آنتی بادی تشخیصی علیه ویروس زردی غربی چغندر بوسیله پروتئین پوششی نوترکیب آسان نیست و نیاز به استراتژی های خاص دارد.

لیپازها (تری آسیل گلیسرول آسیل هیدرولاز ec 3.1.1.3 ) از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که در صنایع مختلف از جمله صنایع غذایی، شوینده ها، تولیدات دارویی، چرم، پارچه، لوازم آرایشی، و کاغذ کاربرد دارند. لیپازهای باکتریایی عضوی از خانواده ?/? هیدرولازها هستندکه تری آسیل گلیسرول ها را در فاز بین آب-چربی هیدرولیز می کنند. لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس (btl2) نوعی لیپاز ترموآلکالوفیل است که در دمای 75-60 درجه سانتیگراد و ph برابر 10 -8 فعالیت می کند. این ویژگی ها باعث تبدیل این لیپاز به یک گزینه مناسب برای کارهای تحقیقاتی و همچنین کاربردهای صنعتی شده است. این پژوهش به بررسی اثر جایگزینی فنیل آلانین 17 با سرین بر فعالیت لیپاز کایمریک باسیلوس ترموکاتنولاتوس ( که کل توالی پنتا پپتیدی (ala-his-ser-gln-gly) ناحیه زانوی هسته دوست لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس با توالی پنتا پپتیدی (gly-glu-ser-ala-gly) ناحیه مشابه از لیپاز قارچ کاندیدا روگوزا جایگزین شده بود) می پردازد. بدین منظور ابتدا مطالعات بیوانفورماتیکی و پیشگویی ساختمان جهت بررسی اثر جایگزینی فنیل آلانین 17 با سرین بر ساختمان لیپاز انجام شد. سپس جهش مورد نظر با استفاده از روش جهش زایی در محل در ژن نوترکیب btl2 ایجاد شد. در مرحله بعد لیپاز btl2 جهش یافته در باکتری e.coli کلون و بیان شد. در پایان فعالیت آنزیمی لیپاز های کایمریک در حضور سوبستراهای مختلف اندازه گیری شد. همچنین اثر عوامل مختلف از قبیل دما، ph، دترجنت ها، حلال های آلی و یونهای فلزی بر روی فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدست آمده نشان داد که فعالیت آنزیمی لیپاز کایمریک جدید برای همه سوبستراهای بکاربرده شده به غیر از تری بوترین (4c) بیشتر از آنزیم کایمریک قبلی می باشد، همچنین جهش ایجاد شده، در بیشتر موارد مقاومت آنزیم کایمریک جدید را نسبت به عوامل بررسی شده از قبیل دترجنت ها، حلال ها و یونهای فلزی را افزایش داده است.

لیپاز ها ec 3.1.1.3) ) پیوندهای استری را هیدرولیز می کنند. در میان لیپازهای تولید شده توسط میکروارگانیسم ها، انواع به دست آمده از میکروارگانیسم های گرمادوست در دماهای بالا پایداری و فعالیت بیشتری نشان می دهند. باکتری گرمادوست باسیلوس ترموکاتنولاتوس لیپاز btl2 را تولید می کند که 43 کیلو دالتون وزن دارد و در دمای 50 درجه سانتیگراد، محدوده ph 9 -11 و حلال-های آلی ایزوپروپانول ، استن و متانول پایداری نشان می دهد اما دارای محدودیت هایی است که از آن جمله می توان به نا توانی در تجزیه سوبستراهای بزرگ اشاره کرد. افزایش فضا و کاهش ممانعت فضایی در جایگاه فعال، احتمالاً سبب تسهیل ورود سوبستراهای بزرگتر و در نتیجه تغییر ویژگی سوبسترایی آنزیم خواهد شد. تعویض فنیل آلانین 17 با آلانین با توجه به اینکه در حفره اکسی آنیون و به سمت جایگاه فعال قرار دارد، ممکن است باعث افزایش فعالیت لیپاز به علت سهولت ورود سوبسترا شود. همچنین با توجه به اینکه فنیل آلانین 181 در ناحیه ی درپوش قرار دارد، تعویض آن با آلانین ممکن است باعث سهولت کنار رفتن درپوش و افزایش فعالیت گردد. در این تحقیق، ایجاد هم زمان این دو جهش در لیپاز btl2 مطالعه شد. جهش f17a با اعمال pcr روی ژن btl2 دارای جهش f181a اعمال شد. پروتئین حاصل در میزبان باکتری اشرشیاکلی بیان و سپس فعالیت آنزیم جهش یافته در حضور سوبستراهای مختلف و نیز اثر عوامل گوناگون مثل دما، حلال های آلی، دترجنت ها و یون های فلزی بر فعالیت آنزیم بررسی شد. نتایج نشان داد که تلفیق دو جهش، فعالیت آنزیم را به علت ناپایدار کردن ساختار پروتئین کاهش می دهد. پایداری دمایی لیپاز با دوجهش در مقایسه با لیپاز تک جهشی افزایش یافته است. سایررفتارهای لیپاز با دوجهش f17-181a در مقابل یون های فلزی، حلال های آلی و دترجنت ها همانند لیپازf181a است اما پایداری این لیپاز در حضور فلزات و دترجنت sds تا حدودی افزایش یافته است، هرچند همه این عوامل فعالیت لیپاز را کاهش می دهند.

لیپازهای قلیاحرارت مقاوم در صنایع گوناگون کاربردهایی بسیاری دارند. در این مطالعه لیپاز قلیاحرات-مقاوم یک باکتری بومی enterobacter sp.bn12)) که از خاک پوششی مزارع پرورش قارچ خوراکی در اطراف تهران جداسازی شده، مورد بررسی قرار گرفت. ژن لیپاز (elbn12) از طریق کتابخانه ژنومی شناسایی گردید. بررسی قطعه بدست آمده از کتابخانه ژنومی، توالی کدکننده لیپازی را با وزن مولکولی پیش بینی شده kda 31 نشان داد. توالی پروتئینی لیپاز بدست آمده با لیپاز enterobacter sp.ag1 96% یکسانی داشت. لیپاز elbn12 به زیرخانواده i.1 لیپازهای باکتریایی تعلق دارد و جایگاه فعال آن از ser82، asp237 و his259 تشکیل شده است. لیپاز elbn12 در میزبان escherichia coli bl21 (de3) plyss تولید و سپس خالص سازی گردید. حداکثر فعالیت این لیپاز در?c 60 و درph 0/8 در حضور سوبسترای تری کاپریلین (c8) مشاهده شد و فعالیت ویژه آن در این شرایط u/mg 97/775±5106 بود ولی این لیپاز تنها 54% از فعالیت اولیه خود را پس از یک ساعت گرماگذاری در ?c 60 حفظ می کرد. به منظور افزایش پایداری حرارتی لیپاز elbn12، پنج جهش یافته از آن با جهش زایی در جایگاه های مشخص تهیه گردید. مطالعات بیوانفورماتیک و به دنبال آن بررسی های آزمایشگاهی برای بررسی اثر جهش ها انجام شد. تمامی این جهش یافته ها نیز در میزبان e. coli bl21 (de3) plyss تولید و سپس تخلیص شدند. دو جهش یافته k173a وq177a که از نظر موقعیت در سطح پروتئین قرار دارند، با افزایش پایداری حراراتی و همچنین فعالیت ویژه آنزیم همراه بودند. با این حال اعمال همزمان این دو جایگزینی در یک جهش یافته، اثر منفی در پایداری حرارتی داشت. جایگزینی اسیدهای آمینه هیدروفوب: ala و ile در جایگاه n106 که در فضای اتصال سوبسترا قرار دارد، با افزایش پایداری حرارتی همراه بود ولی فعالیت ویژه آنزیم را کاهش داد. بنابراین به نظر می رسد که آسپاراژین 106 برای ساختار یا عملکرد آنزیم ضروری است. لیپاز elbn12 و اکثر جهش یافته های آن در شرایط قلیایی پایدار بودند. این آنزیم ها پایداری خوبی را در حضور 50% (v/v) حلالهای آلی قطبی و غیرقطبی و همچنین در محلول 1% (w/v) دترجنت های غیریونی از خود نشان دادند. بعلاوه پایداری آنزیم های مورد بررسی در غلظت mm 10 یونهای فلزی به استثناء یونهای فلزات سنگین (zn2+ و fe3+) قابل توجه بود. edta هم در غلظت mm 10 تاثیر مهاری روی فعالیت هیچ یک از لیپازها نداشت. با نتایج بدست آمده می توان این طور نتیجه گیری کرد که جهش یافته های k173a و q177a از قابلیت های بیشتری برای استفاده در صنایع مختلف برخوردار هستند.

دانش تنوع زیستی با بررسی گوناگونی جمعیت های میکروبی، شناسایی آن ها و ارائه ی ذخیره ی ژنومی جدید امکانات مناسبی برای زیست فناوری فراهم می کند. علی رغم تعداد زیاد میکروارگانیسم ها دانش بشری تنها نسبت به بخش بسیار کمی از آن ها آگاهی دارد. چرا که شناسایی اکثریت آن ها به دلیل محدودیت های روش کلاسیک از جمله کندی و غیر قابل کشت بودن بسیاری از باکتری ها امکان پذیر نیست. معادن فلزی از جمله محیط های دارای شرایط سخت برای زندگی میکروارگانیسم ها می باشند و به همین دلیل منابع جذابی برای بررسی تنوع میکروبی موجود هستند. امروزه تاکسونومیک بر اساس تحلیل توالی های dna ژنومی وهمچنین توالی ژن 16s rrnaسریعتر و ارزانتربوده و تصویر نسبتاً کامل تری از اجتماعات میکروبی فراهم آورده و رابطه ی فیلوژنی بین آن ها را مشخص می سازد. از این رو در این پژوهش با استفاده از روش متاژنومیکس تنوع میکروبی محیط معدن کرومیت فرومد بررسی شد. پس از نمونه برداری از مناطق مختلف معدن و استخراج dna ، ژن 16s rrna با پرایمرهای مخصوص تکثیر و پس از کلونینگ محصول pcr در حامل پلاسمیدی، کتابخانه ی ژنی 16s rrna ساخته شد. کلون های حاوی dna خارجی بوسیله pcr غربال شدند. سپس 107 کلون (43?) بصورت تصادفی انتخاب و تعیین توالی شدند. از نظر فیلوژنتیک توالی های باکتری در جنس های thermosynechococcus , adhaeribacter ,cedecae ,rheinheimera ,phycisphaera polaromonas, curvibacter, aguabacterium, ralstonia, limnobacter, acidovorax bradyhizobium, runella, algoriphagus, sporocytophaga, rubrimanas, oscillatoria blastocatella , erythromicrobiom, pseudoxanthomonas, silanimonas, anaerobacillus, pseudomonas, georgfuchsia, opitutus, flavobacterium , sphaerobacter ,koribacter, delftia hydrogenophaga, arthrobacter, bosea, gemmatimonas, desulfotomaculum, و توالی های آرکی در جنس nitrososphaera قرار گرفتند. جنس های rheinheimera و cedecae غالب بودند. 27 سویه شباهت بالاتر از 98.7 درصد و 59 سویه شباهت کمتر از 98.7 درصد با سویه ی استاندارد ثبت شده داشتند که این 59 سویه می تواند معرف تاکسون های جدید باشند. بر اساس نتایج بدست آمده از این پژوهش باوجود فراوانی کم سویه های شناسایی شده محیط معدن کرومیت فرومد از تنوع میکروبی بالایی برخوردار می باشد.

برخی از میکروارگانیسم ها که به عنوان افراطی دوست از آن ها یاد می شود قادر به زندگی در مناطقی هستند که برای اکثر میکروارگانیسم های دیگر مرگ آور است. دریاچه های نمک با شوری در حد اشباع یکی از این محیط ها هستند. توانمندی های زیست فن آوری میکروارگانیسم های محیط های پرشور باعث اهمیت بررسی آن ها شده است. دریاچه ارومیه بزرگترین سطح آبی کشور و یکی از دریاچه های فوق شور در جهان، در شمال غربی ایران است که شبیه دریای پر شورgreat در آمریکاست. در این پژوهش تنوع زیستی پروکاریوت های نمک دوست دریاچه نمک ارومیه با استفاده از روش های کشت، هیبریداسیون فلورسانس در محل، الکتروفورز با گرادیان ماده دناتوره کننده قطعات تکثیر شده 16s rdna و کتابخانه ژنی 16s rdna بررسی شده است. فراوانی سلول ها در دریاچه بوسیله رنگ آمیزی مستقیم با dapi مشخص گردید که این میزان (108×4-106×2/1) سلول در هر میلی لیتر بوده است. فراوانی آرکی و باکتری در این دریاچه به ترتیب 55%–1/36 و 5/55%-5/48 بوده که با استفاده از روش هیبریداسیون فلورسانس در محل با پروب های مخصوص هر قلمرو مشخص گردیده است. تعداد سلول های زنده بدست آمده در کشت (106×6/6-102×4/1) در هر میلی لیتر بود. در مرحله اول نمونه برداری در مهرماه 1389، 323 جدایه از سواحل شرقی دریاچه جداسازی شد که 53 سویه برای مطالعات بیشتر انتخاب شدند که متعلق به 18 جنس و 39 گونه بودند که در سه راسته firmicutes (6/78%)، proteobacteri (4/21%) وactinobacteria (8/1%) قرار گرفتند. در مرحله دوم نمونه برداری در تیرماه 1391 نیز از سواحل شرق و غرب دریاچه نمونه برداری شد که از بین 228 جدایه حاصل، توالی 16s rdna برای 36 سویه منتخب، تکثیر و ترادف یابی شد که از نظر فیلوژنتیک سویه های آرکی در 8 گونه و سه جنس halorubrum (44%)، haloarcula (8/38%) و haloterrigena (1/11%) قرار گرفتند. باکتری های جدا شده هم به دو جنس salicola و pseudomonas تعلق داشتند. در روش غیر وابسته به کشت کلونینگ- تعیین توالی، کتابخانه ژنی آرکی ها متعلق به 5 جنس halonotius، halolamina،haloquadratum ،halomicroarcula و halorhabdus بودند. کتابخانه کلون های باکتریایی نیز در 4 راسته bacteroidetes، cyanobacteria، actinobacteria و firmicutes قرار داشتند. کلون های کتابخانه قطعه ای از ژن bop (به عنوان یک مارکر ملکولی) متعلق به 4 جنس halorubrum، natrialba، haloquadratum و natrinema بودند. برای بررسی بیشتر تنوع زیستی هالوآرکی ها به موزات بررسی 16s rdna، تنوع زیستی ژن bop نیز مطالعه شد. این پژوهش نشان داد که فیلوژنی bop با فیلوژنی16s rdna رابطه تنگاتنگی دارد. در روش الکتروفورز با شیب غلظت 33 باند از ژل(18 باکتری و 15 آرکی) انتخاب، تکثیر و ترادف یابی شده که از نظر فیلوژنتیک سویه های باکتری در 4 جنس salinibacter، mangroviflexus، pseudomonas، cesiribacter و دو راسته proteobacteria و bacteroidetes قرار دارند. سویه های آرکی شامل سه جنس halonotius و haloquadratum ، halorubrum و در راسته euryarchaeota قرار می گیرند. در این پژوهش هم پوشانی در بین نتایج حاصل از روشهای وابسته به کشت و غیر وابسته به کشت کم بود که این امر را می توان به تعداد بسیار کم جدایه های تعیین توالی شده و تفاوت در سه تکنیک به کار رفته نسبت داد.

اپیتلیوم رنگدانه¬دار شبکیه چشم(rpe) یک تک لایه شامل سلول¬هایی است که نورون¬های شبکیه را محافظت می¬کنند. در طول تکوین، rpe و نورون¬های شبکیه از یک پیش¬ساز مشترک به¬نام حباب بینایی منشا می-گیرند. sox2 یک فاکتور رونویسی است که حاوی جعبه hmg است و از ژن¬های مهم در تکوین چشم می¬باشد که دیده شده در شرایط مناسب، تمایززدایی سلول¬های rpe را القا می¬کند. هدف از این مطالعه سنجش توانایی sox2 انتقال¬یافته توسط ویروس وابسته به¬آدنو(aav) در ایجاد تغییرات تمایزی سلول¬های rpe انسان بالغ می¬باشد. مواد و روش¬ها: توالی کدکننده ژن sox2 در وکتور paav-mcs همسانه¬سازی و توسط روش¬های colony pcr، هضم آنزیمی و تعیین توالی، تایید شد. جهت رهگیری بیان ژن در سلول¬های جانوری، قطعه ires-egfp نیز در وکتور بیانی همسانه¬سازی شد. محصول واکنش اتصال به باکتری e.coli منتقل و باکتری¬های تراریخت توسط آزمون استخراج quick check مشخص و با روش¬های هضم آنزیمی، واکنش زنجیره¬ای پلیمراز و تعیین توالی وکتور بیانی نهایی تایید شد. با استفاده از وکتور گزارشگر paav-lacz ترنسفکشن سلول¬های hek293t به روش کلسیم فسفات بهینه شد و این سلول¬ها توسط وکتور نوترکیب حاوی sox2-ires-egfp، paav-rc و phelper ترنسفکت همزمان شدند. ویروس¬های نوترکیب پس از 72 ساعت جمع¬آوری شدند. از سه روش رنگ¬آمیزی x-gal، فلوسایتومتری و absolute quantification real-time pcr جهت تعیین تیتر ویروس¬های مختلف تولیدشده استفاده شد. کره¬های چشم انسان بالغ از بانک چشم جمهوری اسلامی ایران فراهم و سلول¬های rpe جداسازی و کشت داده¬شدند. این سلول¬ها توسط ویروس-های نوترکیب به روش¬های مختلفی آلوده¬شدند. جهت بررسی تغییرات بیان sox2 و پیامدهای حاصل از آن، آزمون¬های real-time pcr و ایمنوسیتوشیمی استفاده شدند. نتایج: داده¬های حاصل از تعیین تیتر ویروس نشان داد استوک اولیه ویروس¬های aav-sox2 جمع¬آوری شده دارای106×8/1 ویروس با توانایی آلوده¬سازی بود. روش آلوده¬سازی سلول¬های شناور به عنوان بهترین روش آلوده¬سازی سلول¬های rpe انتخاب شد. تجزیه تحلیل داده¬های حاصل از real-time pcr نشان داد پس از مهار تکثیر سلولی، به¬دنبال افزایش بیان sox2، نستین به عنوان نشانگر سلول¬های پیش¬ساز عصبی، در سلول¬های آلوده¬شده با ویروس نوترکیب حاوی sox2 افزایش بیان پیدا می¬کند. همچنین ژن pax6 نیز تغییرات بیان معنادار باسطح اطمینان 99% نشان داد. در آزمون ایمنوسیتوشیمی بروز سلول¬های مثبت برای نشانگرهای تمایزی مانند thy1 که نشانگر سلول¬های گانگلیونی است مشاهده شد. همچنین برای اولین بار نتایج ایمنوسیتوشیمی این تحقیق تغییرات rpe به سمت سلول گیرنده نور استوانه¬ای را تحت تاثیر sox2 نشان داد. در نهایت نتایج این تحقیق نشان داد که افزایش بیان sox2 سبب القا تغییرات تمایزی سلول¬های rpe انسان بالغ می¬شود.

وجود فلزات سنگین در منابع آبی یک مسئله¬ی بسیار مهم می¬باشد که توجه بسیاری از زیست-شناسان را به خود معطوف داشته است. اهمیت مسئله از آنجا مشخص¬ می¬شود که پژوهشگران سال هاست به دنبال راه کار برای حذف این آلودگی¬ها می¬باشند. در بین روش¬های ارائه شده توسط محققین فرآیند جذب به دلیل سادگی، هزینه کم، انعطاف پذیری و کارایی بالا، عمومیت بیشتری دارد. دراین تحقیق، ژن زیرواحد پیلی هیبرید csth::cbm جاذب فلزات سنگین در حامل بیانی pet-26b(+) همسانه¬سازی شد. بعد از همسانه سازی و تاییدهای آن، پروتئین مدنظر در باکتری بیانی e. coli bl21 بیان شد. بیان پروتئین به صورت اینکلوژن بادی در این سامانه با آنالیز وسترن بلات تایید شد. سپس چند عامل تاثیر گذار در جداسازی اینکلوژن بادی مورد بررسی قرار گرفت. با نتایج بدست آمده، پروتئین مدنظر تا 86% جداسازی شد. با توجه به نتایج مطالعات قبلی روی جذب فلزات سنگین توسط این پروتئین در سطح سلول امکان استفاده از آن در طراحی و توسعه سیستم های حذف فلزات سنگین از آب¬های آلوده وجود دارد. به منظور بهبود ویژگی¬های جذب فلز سنگین پروتئین csth38::cbm، این پروتئین بر روی نانوذرات¬ مغناطیسی با پوشش سیلیکا تثبیت شد. نانوذرات مغناطیسی با پوشش سیلیکا، نانوذرات مغناطیسی با پوشش سیلیکای آمینه شده و نانوذرات مغناطیسی با پوشش سیلیکای حاوی پروتئین از نظر میزان جذب فلز سنگین مورد آزمایش قرار گرفتند. نانوذرات مغناطیسی با پوشش سیلیکا ظرفیت جذب فلز کادمیوم را نداشتند ولی بررسی ایزوترم جذب فلز کادمیوم توسط دو نوع نانوذره¬ی دیگر مشخص کرد که هر دو برای جذب کادمیوم با ایزوترم جذب لانگمویر، تطابق بیشتری دارند. حداکثر میزان جذب فلز کادمیوم برای نانوذرات مغناطیسی با پوشش سیلیکای آمینه و نانوذرات حاوی پروتئین به ترتیبmg/g 50/204 و mg/g 42/305 محاسبه شد. قابلیت استفاده¬ی مجدد نانوذرات به عنوان یک ویژگی اقتصادی نیز برای این جاذب¬ها مورد بررسی قرار گرفت. حفظ بیش از 70% از فعالیت اولیه نانوسیستم طراحی شده بعد از چهار بار استفاده ، مزیت دیگر این جاذب بود.

هیدروکربن های آروماتیک چند حلقه ای (pahs) آلودگی های رایج زیست محیطی هستند که توسط فعالیت های بشری و منابع طبیعی ایجاد می گردند. با این وجود سازمان بهداشت جهانی (who) بزرگترین منشا pahها را فرایند های صنعتی و سایر فعالیت های انسانی می داند. این ترکیبات به دلیل توان بالای سمیت، جهش زایی و سرطان زایی موجب نگرانی های عمده ای شده و در فهرست آلاینده های درجه اول آژانس حفاظت محیط زیست آمریکا (us epa) و اتحادیه اروپا (eu) قرار گرفته اند. هدف این تحقیق زیست پالایی بیس فنلa به عنوان یک هیدروکربن آروماتیک چند حلقه ای در نظر گرفته شد. ابتدا از 5 منطقه صنعتی ( آلوده به ترکیبات آروماتیک ) و شور، تحت شرایط استاندارد نمونه برداری شد. غربالگری طی 2 مرحله انجام شد. طی غربالگری اولیه از مناطق نمونه برداری شده، 8 جدایه حاصل گردید. جدایه های حاصل از غربالگری اولیه و همچنین جدایه هایی با سابقه تجزیه ترکیبات آروماتیک و نمک دوست تحت غربالگری ثانویه قرار گرفتند. طی غربالگری ثانویه یک جدایه (جدایه نمونه پساب پتروشیمی ماهشهر) به عنوان جدایه برتر انتخاب شد. این جدایه قادر به رشد در محیط معدنی نمکی حاوی mg/l 300 بیس فنلa (به عنوان تنها منبع کربن و انرژی) در حضور g/l nacl 40 می باشد. نتایج توالی یابی قطعه 16s rrna نشان داد که جدایه برتر بیشترین شباهت (99%) را با سودموناس چنگدونسیس سویه mbr دارد، از این رو جدایه برتر سودوموناس سویه ykj نام گذاری شد. سویه ykj قادر به رشد در تمام دماهای مورد مطالعه (25 تا 40 درجه سانتی گراد) بوده و طیف ph قابل تحمل این جدایه، 9-6 است و شرایط مناسب رشد ?c 30t= و 7 ph= تعیین گردید. مقدار cod محیط کشت از مقدار اولیه o2/l mg 2/655 بعد از گذشت 36 ساعت در حضور سویه ykj به o2/l mg 2/109 کاهش یافت و پس از این مدت، مقدار cod تا 48 ساعت تقریبا ثابت ماند. آنالیزهای انجام شده با دستگاه hplc نشان داد طی 48 ساعت علاوه بر مصرف کامل بیس فنلa، تمامی متابولیت های حاصل طی تجزیه زیستی بیس فنلa بوسیله سویه ykj، تجزیه شده و تنها یک متابولیت در محیط قابل رویت است. سویه ykj نسبت به آنتی بیوتیک کلرامفنیکل مقاوم می باشد، همچنین مقاومت نسبی به آمپی سیلین داشته، ولی نسبت به آنتی بیوتیک های ریفامپیسین، کانامایسین و تتراسایکلین حساس می باشد. با توجه به نتایج کسب شده با دستگاه های hplc و gc-ms که در مجموع منجر به شناسایی هفت متابولیت (طی تجزیه زیستی بیس فنلa) شد، مسیری به عنوان مسیر متابولیکی تجزیه بیس فنلa در سویه ykj پیشنهاد گردید که مطابق با مسیر متابولیکی گزارش شده در پایگاه اطلاعاتی kegg است.

عرضه سطحی باکتریایی با کمک متدهای dna نوترکیب روش توانمندی برای ارائه پروتئین ها و پپتیدهای همولوگ در سطح باکتری هاست که کاربردهای وسیعی در تهیه و تولید واکسن های باکتریایی، غربالگری کتابخانه های پپتیدی، تولید آنتی بادیها، تولید بیوکاتالیست های نوترکیب، توسعه بیوسنسورها و ایجاد جاذب-های بیولوژیکی دارد. لذا بنظر می رسد با بیان سطحی پروتئین ها یا پپتیدهای قابل اتصال به فلزات سنگین مانند گلوتاتیون ها، متالوتیونین های غنی از سیستئین، فیتوکلاتین های سنتزی و پپتیدهای موثر در نقل و انتقالات فلزات درباکتری ها، بتوان فلزات سنگین را در حداقل زمان از محیط های آلوده حذف نمود. در این مطالعه، ابتدا با کمک ابزارها و روش های بیوانفورماتیکی، توالی پپتیدهای قابل اتصال به فلز کادمیوم استخراج گردید و نواحی مجاز دریافت پپتیدهای بیگانه در سطح پیلی cs3 باکتری اشریشیاکلی پیش گویی شد. سپس با فنون مهندسی ژنتیک و soeing pcr، موتیف های قابل اتصال به فلز کادمیوم در این مناطق وارد شده و بیان آنها در سطح باکتری اشریشیاکلی با روشهای متعدد از جمله روشهای لکه گذاری و میکروسکوپ فلوروسانس ارزیابی شد. در نهایت قابلیت و ظرفیت جذب فلز کادمیوم بوسیله باکتریهای نوترکیب، با روش جذباتمی اندازگیری گردید و نتایج نشانداد که بطور متوسط سطح جذب فلز در باکتری های بیان کننده پیلی نوترکیب واجد موتیف و یا موتیف به همراه زنجیره ? در مقایسه با سویه کنترل بیان کننده پیلی 8 الی 16 برابر شده است و علاوه بر این، سویه های نوترکیب از محلولی که شامل مخلوطی ازفلزات که شامل مس، نیکل، کادمیوم و کروم بود بطور ترجیحی و انتخابی کادمیوم را جذب می نمایند.

پژوهش حاضر با هدف شناسایی توالی ژن laea، که یکی از اجزای کمپلکس ولوت می باشد، در قارچ p. brevicompactum انجام می شود. ابتدا ژن پروتئین laea با استفاده از روش tail-pcr شناسایی شده، سپس بررسی های بیوانفورماتیکی با استفاده از نرم افزارهای موجود در داده پایگاه های مختلف بر روی توالی بدست آمده انجام می گردد.

ویروس تریستزای مرکبات( citrus tristeza virus ctv) مهمترین بیمارگر مرکبات می باشد و خسارت هنگفتی به صنعت تولید این محصول در دنیا وارد می کند. به دلیل گسترش و شیوع ctv در ایران، مدیریت کنترل آن اهمیت بسزایی یافته است. از این رو تشخیص به موقع، دقیق و ارزان بیماری نیاز به بکارگیری روشی مناسب دارد. امروزه روش( enzyme linked immunosorbant assay elisa) روشی معمول، معتبر و ارزان برای تشخیص ویروس در سطوح وسیع است. به منظور استفاده از این روش نیاز به تامین منبع آنتی ژن ویروسی برای استفاده در فرآیند تولید آنتی بادی پلی کلونال می باشد. در تحقیق حاضر ژن پروتئین پوششی ctv، (ctv-cp25) جدا شده از ایران که در ناقل ptz57r/t همسانه سازی شده بود با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر و در ناقل بیانی pet26b همسانه سازی گردید و pet-cp25 نامیده شد. دو سویه bl21 و rosetta gami (de3) باکتری escherichia coli، با pet-cp25 تراریخته شد و سویه تراریخته به مدت یک شب در محیط lb و دمای c°37 همراه با تکان رشد داده شد و پس از واکشت در روز بعد، بیان پروتئین پوششی با استفاده از iptg القاء گردید. سپس نمونه برداری در ساعات مختلف پس از القاء، انجام و پروتئین محلول تام استخراج و در sds-page تفکیک شد. پس از تایید بیان پروتئین نوترکیب، به منظور بررسی ماهیت آن، لکه گذاری وسترن با استفاده از آنتی بادی پلی کلونال اختصاصی پروتئین پوششی ویروس تریستزا (تهیه شده از شرکت dsmz آلمان) انجام گردید. نتایج این تحقیق نشان داد که پروتئین پوششی ctv در سلول باکتری بیان شده است

لیپازها (تری اسیل گلیسرول اسیل هیدرولازها) هیدرولیز و ساخت استرهای تشکیل شده از گلیسرول و اسیدهای چرب دارای زنجیره های بلند را کاتالیز می کنند و در صنایع مختلف از قبیل صنایع غذایی، لبنی، شوینده، کاغذ سازی، چرم سازی، دارویی، کشاورزی و صنایع روغنی کاربرد دارند. در این تحقیق، کلونینگ و بیان ژن btl2 با توالی نشانه تاژک cs3 اشریشیاکلی انجام و با بیان ژن با توالی نشانه طبیعی مقایسه گردید. ژن btl2 از ژنوم باسیلوس ترموکاتنولاتوس توسط pcr جداسازی، کلون و با روش های استاندارد مهندسی ژنتیک تأیید شد. سپس با استفاده از آنزیم های ndei ، hindiii وsaci ژن مذکور از وکتور کلونینگ (ptz57r/t) جدا و مجدداً در وکتورهای بیانی pet21-a(+) و pet26-b(+)کلون و به e. coli سویه bl21(plyss) منتقل شد. بررسی پروتئین های سلولی بر روی ژل پلی آکریلامید (sds-page)، بیان شدن لیپاز حدوداً 42 کیلو دالتونی را تأیید و آنالیز پروتئینی و بررسی فعالیت لیپاز نوترکیب در مایع پری پلاسمی توسط آزمون pnpp حاکی از این بود که هر دو توالی نشانه قدرت پایینی برای ترشح پروتئین به فضای پری پلاسمی e. coli دارند، که یکی از دلایل آن را می توان بیان پروتئین به صورت اینکلوژن بادی مطرح کرد، بدین منظور مراحل خالص سازی و refolding بر روی اینکلوژن بادی انجام و با روش ph-stat و برادفورد به ترتیب فعالیت آنزیمی و میزان لیپاز محلول اندازه گیری شد.

با توجه به کاربرد فراوان فلزات سنگین در صنایع و همچنین سموم و آلودگی کودهای کشاورزی و گسترش روز افزون استفاده از آنها در کشاورزی، رها­سازی این فلزات سمی نیز در اکوسیستم افزایش یافته است. اثرات فلزات بر عملکرد اکوسیستم به شکل­های گوناگونی بروز می­کند و از اهمیت اقتصادی و بهداشت عمومی بالایی برخوردار است. انباشت فلزات سمی و سنگین در خاک­های مرغوب کشاورزی تقریباً آنها را بدون استفاده می­کند و جذب زیستی آنها توسط گیاهان و بدنبال آن انباشت در ذخیره غذایی، اثرات نامطلوبی بر تمامی سطوح زنجیره­های غذایی و در نهایت انسان می­­گذارد. از این­رو به نظر می­رسد که با ادامه استخراج منابع معدنی و انباشت محیطی مواد خطرناک، باید روش­هایی با کارایی بالاتر در سم­زدایی و بازیابی چنین فلزاتی اندیشیده شود. حذف این مواد آلاینده از خاک و آب، بویژه زمانیکه میزان تراکم این فلزات کم می­باشد، بسیار پرهزینه و گران است. بهمین دلیل و بخاطر ارزان بودن و همچنین کارائی بسیار بالای استفاده از میکروارگانیسم­ها در بدام انداختن این فلزات، انجام تحقیقات نیز در این راستا هدایت گردیده است. یکی از این روش­ها، استفاده از پروتئین­هایی در سطح میکروارگانیسم­ها است که فلزات به آنها متصل می­شوند. در این میان فیمبریا کاندیدای بسیار مناسبی برای نمایش اپیتوپ­های جاذب فلزات سمی گزارش گردیده است. علاوه بر ایجاد و ساخت سیستم­های جذب کننده فلزات سنگین، بهبود عملکرد این سیستم­ها نیز از اهمیت و ضرورت بالایی برخوردار است. تظاهر اپران cs3 وابسته به محیط کشت cfa است که سبب ایجاد محدودیت در کارهای آزمایشگاهی و تحقیقاتی و در مرحله بعدی سبب عدم مقرون به صرفه بودن استفاده از آن در بخش صنعتی و فرمانتاسیون می­شود. هدف ما دستکاری ناحیه فرادست ژن، یعنی توالی­های تنظیمی اپران برای افزایش قابلیت تولید پیلی در محیط­های کشت ساده و یا سایر محیط­های رشدی می­باشد. در این تحقیق پروموتر اوپران cs3 با یک پروموتر قابل تنظیم دیگر نظیر placuv5 تعویض شده و در ناحیه اوپراتور اوپران نیز با استفاده از روش جهش­زایی با واکنش زنجیره­ای پلیمراز نامتعادل تغییراتی ایجاد گردید.

عامل تحریک کننده رده گرانولوسیت -ماکروفاژ ‏‎(gm-csf)‎‏یکی از عوامل رشد خونساز و تنظیم کننده خونسازی می باشد که تولید و فعال سازی گرانولوسیت ها و ماکروفاژها را از سلول های پیش ساز کنترل می نماید.‏‎gm_csf‎‏ کاربردهای دارویی متعددی دارد و به دلیل برخی محدودیت ها در بدست آوردن این پروتئین از منابع طبیعی ، تولید آن در سیستم های بیان ژنی هم ساخت ترجیح داده می شود.به منظور مطالعه بیان پری پلاسمی ‏‎gm_csf‎‏ انسانی در ‏‎‏‎e.coil‎‏ ، ‏‎dna‎‏ ی ‏‎hgm-csf‎‏ به داخل دو پلاسمید بیان کننده که دارای ترادف نشانه ‏‎pelb‎‏بوده و یکی مجهزبه پروموتر ‏‎t7‎‏و دیگری مجهز به پروموتر ‏‎lac‎‏بود وارد گردید.‏‎cdna‎‏ ی ‏‎hgm_csf‎‏ با روش ‏‎pcr‎‏و با استفاده از دو آغازگر اختصاصی که با یکی از جایگاهای برش ‏‎ncol‎‏ یا ‏‎bamhi‎‏در انتها ‏‎3‎‏ آنها طراحی شده بودند تکثیر شد.الگوی پروتئینی به دست آمده از کل سلول سیتوپلاسم و پری پلاسم ( تهیه شده با شوک اسمزی ) باکتریهای نوترکیب ، نشان داد که ‏‎rhgm_csf‎‏ در فضای پری پلاسمی تجمع می یابد که توسط ترادف نشانه ‏‎pelb‎‏ هدایت می شود.نتایج نشان دادند که سطح بیان ‏‎rhgm+csf‎‏تحت کنترل پروموتر ‏‎‏‎t7‎‏ می تواند به حدود 43 درصد کل پروتئین باکتریایی برسد که بسیار بالاتر از سطح بیان ‏‎hgm_csf‎‏ تحت کنترل پروموتر ‏‎lac‎‏ می باشد.

در این تحقیق باکتری های گرمادوست افراطی مورد استفاده در فرایند فروشویی زیستی جداسازی و ارزیابی شدند . برای این منظور نمونه هایی از چشمه آب گرم معدنی سمنان انتخاب و طی مراحل متوالی در محیط ‏‎9k‎‏ مورد جداسازی قرار گرفتند. این باکتریها انرژی مورد نیاز خود را از اکسیداسیون آهن در محیط کشت سینتیک ‏‎9k‎‏و در دمای 60 درجه سانتیگراد و ‏‎ph=1/7‎‏ بدست می آورند. مخلوطی از باکتریهای گرمادوست افراطی ، جدا و جهت ارزیابی میزان توانایی استخراج فلز مس به محیط کشت ‏‎0/9 k‎‏ حاوی ‏‎15g/l‎‏ از کالکوپیریت تغلیظ شده منتقل شد. جهت مقایسه عملکرد باکتریهای مزوفیل در مقایسه با این باکتریها ، نمونه دیگری از باکتریهای مزوفیل در دمای 30 درجه سانتیگراد تلقیح شده و نتایج ثبت شد. با آزمایشهای آزاد سازی مس توسط باکتریهای مزوفیل حدود 28 درصد موجود در نمونه طی 30 روز اتسخراج شد، در حالی که میزان استخراج برای باکتری های گرمادوست در طی 15 روز بیش از 80 در صد بدست آمد. این نتایج نشان می دهد که باکتری های گرمادوست نه تنها توانایی استخراج بالاتری دارند بلکه این کار را در زمان کمتری انجام می دهند.