مطالعات اخیر نشان داده که چند شکلی های ژنی در برخی از ژن ها می تواند از دلایل سقط مکرر باشد. از طرف دیگر، نیتریک اکساید که به عنوان یک مولکول مهم در مسیر پیام رسانی سلول مطرح است ،در مراحل اولیه حاملگی شامل لانه گزینی بلاستوسیت، تمایز تروفوبلاست، تهاجم تروفوبلاستی دخیل است و سبب جریان خون مادر به جفت می شود. بنابراین در لانه گزینی و حفظ حاملگی نقش دارد.نیتریک اکساید به وسیله آنزیم نیتریک اکساید سنتاز اندوتلیالی در جفت بیان می شود، از آنجائیکه این آنزیم و محصول آن در مراحل اولیه حاملگی نقش کلیدی ایفا می کند ارتباط چندشکلی این ژن و یکی از مشکلات حاملگی مثل سقط مکرر را در این مطالعه مورد بررسی قرار دادیم. در این مطالعه از 100 زن دچار سقط مکرر که دلیل خاصی برای سقط آنها وجود نداشت و حداقل سه سقط مکرر داشتند به عنوان گروه بیمار استفاده شد. به منظور پی بردن دلایل سقط مکرر در این بیماران ، آزمایشات تشخیصی شامل کاریوتایپینگ زوجین ، بررسی ناهنجاری های آناتومی رحم ، آزمایشات میکروبی، شناسایی آنتی بادی های آنتی فسفولیپیدی و بررسی مشکلات ترومبوفیلی انجام شده بود. گروه کنترل نیز شامل 100 زن با سابقه حاملگی نرمال بود. هردو گروه به منظور تشخیص چندشکلی vntr در اینترون چهارم از ژن نیتریک اکساید سنتاز اندوتلیالی با استفاده از تکنیک pcr بررسی شدند و همچنین برای تشخیص چندشکلی glu298asp در اگزون هفتم این ژن از روش pcr-rflp و تعیین توالی استفاده شد. بررسی ها نشان داد که فراوانی ژنوتیپی چند شکلی vntr ، در گروه بیمار به این صورت است : 63% (bb)، 33%(ab)، 4%(aa) و در گروه کنترل نیز ، 79%(bb)، 18%(ab)، 3%(aa) می باشد. همچنین فراوانی ژنوتیپی مربوط به چندشکلی glu298asp به قرار زیر است: 71 %(gg)،25%(gt)،4%(tt) در گروه بیمار و 68%(gg)،29%(gt)، 3%(tt) در گروه کنترل بررسی آماری این نتایج نشان می دهد که فراوانی آلل a و فراوانی ژنوتیپ ab بین دو گروه به طرز معنی داری متفاوت است ولی بقیه فراوانی ها تفاوت معنی داری را نشان نمی دهد. از آنجائیکه نیتریک اکساید در لانه گزینی و حفظ حاملگی نقش دارد و به دلیل ارتباط بین چند شکلی ژن نیتریک اکساید سنتاز اندوتلیالی در اینترون چهارم و برخی از بیماری ها مانند فشار خون بالا و انفارکتوس و همچنین با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه می توان گفت که آلل a از چندشکلی اینترون چهارم ممکن است فاکتور خطرناکی برای ابتلا به سقط مکرر باشد.

مقدمه : اگرچه سلول های بنیادی جنینی خودنوزا بوده و توان تمایز به انوع سلول های موجود در بدن را دارند ولی تمایز جهت دار آنها به یک نوع سلول خاص، با یک شیوه خاص، بعنوان چالشی است که هنوز باقی مانده است. از طرفی، چنین تمایزی در موجود زنده در یک محیط سه بعدی روی می دهد، لذا استفاده از داربست هایی که بتواند چنین وضعیتی را برای تمایز سلول ها فراهم آورد ضروری به نظر می رسد. روش ها: ما پس از کشت سلول های بنیادی جنین انسان بر بستر های با و بدون "فیبر نانو"، کلونی های حاصله را به سمت "اکتودرم عصبی" القاء نموده و پس از ایجاد ساختار های "شبه لوله عصبی" ،آنها را بر سطوح "نانو" و بدون "نانو" مجددا کشت نمودیم و با انجام آزمایش های rt-pcr، ایمونوسیتوشیمی و فلوسایتومتری بیان مارکر های عصبی را بررسی کردیم و به منظور بررسی مورفولوژی سلول ها در حضور و عدم حضور فیبر نانو، اقدام به تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی کردیم. انجام patch clamp نیز به منظور بررسی وجود پتانسیل عمل و جریانهای عصبی در سلول های عصبی بالغ، صورت گرفت. یافته ها: رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی و نتایج فلوسایتومتری آشکار کرد که میزان بیان مارکرهای پیش ساز عصبی در گروه نانو با اختلاف معنی دار نسبت به گروه فاقد نانوصورت می گیرد. در مرحله بلوغ این سلول ها، تولید موتور نورون با رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی برای مارکرهای hb9,islet و chat در سطح پروتئین و در سطح rna با استفاده از rt-pcr تایید شد. تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی، افزایش تعداد زواید اکسونی بر بستر نانوفایبر را نشان می داد، و نتایج patch clamp حاکی از وجود جریان های یونی قویتر و همچنین وجود پالس هایی شبیه به پتانسیل عمل در گروه دارای داربست نانو بود. در نهایت می توان گفت داربست نانوفایبری توانسته است شرایط بهتری را برای رشد و تمایز سلول ها فراهم سازد.

مقدمه: بهبود بافت ها و ارگان ها بعد از پرتودرمانی وابسته به توانایی جمعیت زایی سلول های بنیادی باقی مانده در آن بافت است. سلول های بنیادی خون ساز و سلول های بنیادی مزانشیمی دو جمعیت سلولی بنیادی در مغز استخوان می باشند. تعامل بین این دو در حفظ و ترمیم سیستم خون سازی نقش مهمّی دارد. مواد و روش ها: به منظور بررسی اثرات حفاظتی سلول های بنیادی مزانشیمی از سلول های cd133+ پرتودیده با دوز 4 گری پرتوهای گاما از سلول های بنیادی مزانشیمی ورید بند ناف استفاده شد. سلول های cd133+ مورد مطالعه نیز از خون بندناف جدا گردید. مطالعه در شرایط هم کشتی با سلول بنیادی مزانشیمی و غیر هم کشتی با آن برای گروه های پرتودیده و پرتوندیده در محیط بدون سرم و حضور سایتوکین هایی چون scf,tpo و flt-3 انجام شد. ویژگی های تمایزی فنوتیپی، مولکول چسبنده و شکست های dna با فلوسیتومتری و تکثیر سلولی و توانایی عملکردی با شمارش کلونی انجام شد. نتایج: بررسی ها نشان می دهد که سلول های بنیادی مزانشیمی توانستند از تکثیر سلول های پرتو دیده (106× (31/0± 0575/1)، عملکرد سلول های cd133+ پرتودیده (02/2 ± 66/6) ترمیم شکست های dna 81/14% حمایت کنند. روند تمایزی سلول های پرتودیده در حضور سلول های بنیادی مزانشیمی با بررسی شاخص cd33 (12 ±7/19) % بود. بیان شاخص cd133 ، cd34 و cd133/34 هفت روز بعد از پرتودهی در حضور سلول های بنیادی مزانشیمی به ترتیب (57/1 ± 36/5)% ، (75/0± 5/2)% و (5/0 ± 5/1) بود. اما این سلول ها نتوانستند بر بیان مولکول چسبنده cxcr4 تأثیر بگذارند. بحث: به نظر می رسد سلول های بنیادی مزانشیمی از طریق ارتباط مستقیم سلول با سلول و یا فاکتورهای مترشحه محلول یا نامحلول باعث افزایش تکثیر، حفظ عملکرد، و فنوتیپ سلول های cd133+ پرتودیده می شوند. افزایش ترمیم dna را می توان به شناسایی سریعتر مناطق شکستگی، فراخوانی عوامل ترمیم، حذف رادیکال های آزاد ایجاد شده توسط پرتوهای یون ساز به وسیله جاروب کننده هایی چون mnsod مربوط دانست. پرتوهای یون ساز با فعال کردن مسیر notch باعث تغییر در روند تمایزی سلول های پرتودیده به سمت رده های میلواریتروئیدی می شوند که در حضور سلول های بنیادی مزانشیمی تقویت می شوند.

مقدمه: امروزه تولید انواع واکنش پذیر اکسیژن(ros) در سیستم تولید مثلی مردان، به یک موضوع قابل توجه تبدیل شده است. این امر به علت اثراتی است که می تواند بر روی کیفیت و عملکرد اسپرم و در نتیجه آن بر روی نرخ ivf و تکوین جنین ها گذارد. از طرف دیگر نظریه رادیکال های آزاد در تکوین بیان می دارد که ros می تواند سبب تغییر در الگوهای متیلاسیون شود. از این رو در این مطالعه اثر ros برروی حرکت و تعداد اسپرم ها مورد بررسی قرارگرفته و ارتباط آن با نرخ ivf و تکوین جنین ها در محیط in vitro نیز بررسی شده است. همچنین سطح متیلاسیون اسپرم در لوکوس های ژنی h19، igf2 و mest و متیلاسیون کلی ژنوم اسپرمی نیز مورد بررسی قرار گرفته است. روش ها: رت ها در دو گروه کنترل(متشکل از 11 نمونه) و آزمون(متشکل از 16 نمونه) دسته بندی شدند. پس از تعیین دوزکشنده 50 درصد(ld50)، جهت القاء ros مقادیر مناسبی از tbhp به مدت 14 روز به رت های نر آزمون، به صورت درون صفاقی تزریق شد. سپس ros القاء شده در اسپرم به کمک فلوسایتومتر اندازه گیری شد. پس از شمارش و تعیین وضعیت حرکت در اسپرم ها، از آن ها برای انجام ivf و بررسی های مولکولی استفاده شد. وضعیت پیش روی جنین های حاصل از ivf نیز تا مرحله هشت سلولی مورد بررسی قرارگرفت. بررسی های مولکولی شامل: بررسی وضعیت بیانی و تعیین الگوهای متیلاسیون نواحی cpg مربوط به ژن های h19، igf2 و mest در اسپرم و همچنین وضعیت متیلاسیون کلی ژنوم بود. برای بررسی وضعیت متیلاسیون و بیان کمی این ژن ها به ترتیب، روش تعیین توالی بی سولفیت و real-time rt-pcr مورد استفاده قرارگرفت. وضعیت متیلاسیون کلی ژنوم نیز براساس واکنش آنتی ژن-آنتی بادی و با کمک فلوسایتومتر اندازه گیری شد. یافته ها: پس از تزریق مقادیر مناسبی از tbhp، میزان ros در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل افزایش معناداری را نشان می داد. تعداد و تحرک اسپرم ها، نرخ لقاح و وضعیت پیش روی جنین ها در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل به طور معناداری کاهش یافته بود و بین افزایش ros و کاهش یافتن تعداد و تحرک اسپرم ها و نرخ لقاح در گروه آزمون، ارتباط معناداری وجود داشت. بررسی الگوهای متیلاسیون نیز نشان می داد که سطح متیلاسیون cpgها در ناحیه تنظیمی ژن mest و سطح متیلاسیون کلی ژنوم در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل به طور معنادار افزایش یافته است. همچنین بین افزایش ros و هایپرمتیله شدن کلی ژنوم و ژن mest نیز در گروه آزمون ارتباط معنادار وجود دارد. نتیجه گیری: این مطالعه نشان می دهد که القاء ros در اسپرم رت ها برروی تحرک و تعداد اسپرم ها اثر منفی می گذارد. همچنین نرخ لقاح را کاهش داده و بر روی وضعیت پیش روی جنین های حاصل از ivf نیز اثر منفی دارد. به علاوه به نظر می رسد که سبب هایپرمتیله شدن ناحیه تنظیمی ژن mest و افزایش سطح متیلاسیون کلی ژنومی نیز می شود.

ناباروری عمده ترین مشکل تولیدمثلی است که حدود 15درصد زوج های جوان را درگیر می کند. این عارضه دلایل مختلفی دارد که فاکتورهای مردانه مسوول 50 درصد این دلایل می باشند. در بررسی دلایل ناباروری مردان، شواهد مستندی موجود است مبنی بر این که آسیب های وارده به اسپرماتوزوآ توسط گونه های فعال اکسیژن (ros) در این میان نقش اساسی ایفا می کنند. microrna ها (mirna) تنظیم کنندگان بیان ژن هستند که در فرآیندهای مهم سلولی چون تکثیر، تمایز و آپوپتوز دخیل می باشند. این مولکول ها در پاسخ به استرس های سلولی و در دفاع سلول علیه این استرس ها نیز نقش دارند. هدف این مطالعه بررسی تاثیر استرس اکسیداتیو روی بیضه، پارامترهای اسپرم و بیان دو mirna ی کاندید در بیضه بود. در این طرح پس از یافتن ld50، مقدار (1:10) دوز ld50، از ماده ترت بوتیل هیدروپراکساید (tbhp) به مدت 14 روز به موش های نر بالغ balb/c به صورت داخل صفاقی تزریق شد. سپس میزان ros در بیضه و اسپرم اندازه گیری شد. همچنین تعداد سلول های زنده در بیضه، آسیب شناسی بافت بیضه، پارامترهای مختلف اسپرم و بیان دو mirna مورد ارزیابی قرار گرفت. بررسی های انجام گرفته نشان داد که تعداد و تحرک اسپرم ها، تعداد لوله های منی ساز و تعداد سلول های زنده بیضه در گروه آزمون نسبت به کنترل کاهش می یابد. همچنین با استفاده از فلوسایتومتری، افزایش رادیکال های o2.- و h2o2 در گروه آزمون در مقایسه با کنترل مشاهده گردید. بیان mmu-mir-34a و mmu-mir-181b نیز در گروه آزمون کاهش نشان داد. یکی از دلایل افزایش سطح o2.- و h2o2 را می توان به کاهش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی چون گلوتاتیون پراکسیداز (gpx) و سوپراکسید دیسموتاز (sod) و نیز ذخیره گلوتاتیون احیا شده (gsh) نسبت داد. کاهش بیان mirna های مربوطه را نیز می توان مبین افزایش بیان ژن های هدف آنها دانست.

هورمون محرک فولیکول گاوی (fsh) به خانواده هورمون های گلیکوپروتئینی تعلق دارد که از غده هیپوفیز یا جفت ترشح می شوند. این هورمون یک هترو دایمر می باشد که از زیر واحد آلفا (مشترک در همه هورمون های گلیکوپروتئینی) و زیر واحد بتا (اختصاصی هر هورمون) تشکیل شده است. fsh گاوی در تکنولوژی تولید مثل، مانند سوپراوولاسیون حیوانات مزرعه ای و درمان سندرم پلی سیستیک تخمدان استفاده می شود. همچنین این هورمون برای اهدف بالینی، دامپزشکی و درمان ناباروری کاربرد دارد. تکنولوژی dna نوترکیب ابزار مفیدی جهت تولید fsh عاری از آلودگی های هورمونی، پریونی و ویروسی فراهم می کند. تولید پروتئین نوترکیب در سیستم های بیان یوکاریوتیک مثل pichia pastoris یک روش مطمئن برای تولید fsh گاوی با اهداف درمانی است. همچنین شناسایی پروتئین تولید شده به صورت نوترکیب، توسط آنتی بادی ویژه، صحیح بودن ساختار تغییرات پس از ترجمه پروتئین را تایید می کند. هدف این تحقیق تولید هورمون fsh گاوی در سیستم بیانی pichia pastoris بود. برای این منظور orf کد کننده دو زنجیره آلفا و بتای ژن fsh گاوی به طور جداگانه در وکتور ptz57r/t کلون شد سپس در وکتور بیانی ppic9 ساب کلون گردید و در نهایت توسط واکنش pcr و تعیین توالی تایید شد. دو پلاسمید نوترکیب حاوی زنجیره آلفا و بتا به ترتیب با آنزیم های محدود کننده sali و saci که ایجاد فنوتیپ his+ mut+ gs115 می کنند، خطی شدند. محصول ایجاد شده داخل سلول مستعد مخمر با الکتروپوریشن کوترانسفکت شد و حضور آن در سلول توسط pcr تایید گردید. در ادامه چند کلون جهت بررسی بیان انتخاب شد. سپس، رسوب سلولی کلون های انتخابی در محیط bmmy سوسپانسیون شد و به مدت 4 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد قرار گرفت. در طول دوره انکوباسیون، متانول به عنوان القاگر با حجم نهایی 5/0 درصد هر 24 ساعت اضافه شد و هر 6 ساعت نمونه برداری انجام گردید. بیان هورمون fsh گاوی بصورت نوترکیب در محلول رویی و رسوب سلولی مخمر، با تکنیک pcr و وسترن بلات تایید شد.

هورمون محرک فولیکول، پروتئینی دوبخشی است که از زیر واحد آلفا و بتا تشکیل شده است. این دو زیر واحد با پیوند غیر کووالانسی به هم مرتبط هستند. هورمون fsh نقش مهمی در تنظیم بلوغ تخمک بازی می کند و یک عنصر کلیدی برای رشد فولیکول در تخمدان میش می باشد. هدف این مطالعه کلون و بیان زیر واحدهای هورمون محرک فولیکول گوسفندی در مخمر pastoris pichia است. برای این منظور ژن های دو زنجیره آلفا و بتا fsh گوسفندی از طریق استخراج rna از سلول های هیپوفیز قدامی گوسفندی جداسازی و cdna آنها ساخته شد. با کمک پرایمرهای اختصاصی ژن، ناحیه orf هر دو زنجیره تکثیر و در وکتور ptz57r/t کلون شدند. سپس ژن نوترکیب در وکتور بیانی pic9 ساب کلون و توالی یابی شد. پس از کشت سلول های مخمر، وکتور نوترکیب حاوی زنجیره آلفا و وکتور نوترکیب حاوی زنجیره بتا به روش الکتروپوریشن به درون سلول مخمر p. pastoris کوترانسفکت شدند. بیان پروتئین نوترکیب با القا متانول 5/0 درصد حجم کل در هر 24 ساعت صورت گرفت. صحت قرار گیری ژن fsh در ژنوم مخمر توسط pcr با پرایمرهای aoxi و پرایمرهای اختصاصی ژن بررسی شد. در نهایت، حضور ژن fsh گوسفندی توسط sds-page و وسترن بلاتینگ مورد بررسی قرار گرفت. در نتیجه بیان هورمون نوترکیب fsh گوسفندی با پپتید نشانه آلفا فاکتور- پپیتید نشانه طبیعی ژن در میزبان مخمر متیلوتروفیک پیکیا پاستوریس امکان پذیر است. بنابراین این سیستم یک میزبان قابل اعتماد برای تولید fsh گوسفند است.

اسپرماتوژنز فرآیندی است که هزاران ژن به صورت زنجیره ای و موازی در آن دخالت دارند. جهش در ژن های دخیل در روند اسپرماتوژنز یکی از دلایل ناباروری در مردان است. ژنmoloney leukemia virus 10-like 1 (mov10l1) یکی از ژن هایی است که به طور اختصاصی در سلول های زایا بیان می شود. تخریب ژنتیکی این ژن در موش باعث توقف روند اسپرماتوژنز و در نتیجه آزواسپرمیا شده است. در این مطالعه، تغییرات ژنتیکی ناحیه عملکردی ژن mov10l1 در جمعیتی از 30 بیمار آزواسپرم با عارضه توقف کامل روند اسپرماتوژنز به عنوان گروه بیمار و 70 مرد بارور دارای حداقل یک فرزند به عنوان گروه شاهد بررسی شد. در این پروژه بعد از استخراج dna از نمونه خون محیطی بیماران انتخاب شده، از روش pcr-sscp برای دسته بندی افراد از نظر تنوع پلی مورفیسم های موجود و در نهایت از sequencing برای تایید تغییرات ژنتیکی استفاده شد. پس از بررسی نتایج هشت نوع پلی مورفیسم شناسایی شد که پنج موردrs2272836, rs11704548) (rs2272838, rs2272837, rs138271 در نواحی اگزونی و سه موردrs12170772, rs2272840) (rs17248147, در نواحی اینترونی قرار داشتند. از پلی مورفیسم های شناسایی شده در نواحی اگزونی، rs2272837 یک پلی مورفیسم از نوع غیرمترادف است و باعث تغییر اسید آمینه گلوتامین به آرژنین در سطح پروتئین می شود و بقیه موارد به عنوان پلی مورفیسم های مترادف در ncbi-snp database گزارش شده اند. بررسی آماری پلی مورفیسم های مشاهده شده در دو گروه بیمار و شاهد نشان داد که بجز پلی مورفیسم rs2272838، یک تفاوت معنادار آماری در میزان وقوع بقیه پلی مورفیسم ها بین دو گروه وجود دارد. بر اساس نتایج بدست آمده پیش بینی می شود که پلی مورفیسم های مشاهده شده در ژن mov10l1 می تواند به عنوان یک عامل ژنتیکی در بروز ناباروری مردان معرفی شوند.

پس از آنکه mrna از غده هیپوفیز اسب نژاد توربرد ایرانی استخراج شد، برای سنتز cdna استفاده گردید. هر یک از زیرواحد های پروتئین fsh ، با استفاده از دو جفت آغازگر اختصاصی تکثیر یافتند و سپس بطور جداگانه در حامل ptz57r.t کلون شدند. حامل های نوترکیب به درون سلول باکتری ? dh5منتقل شدند. کلون سازی زیرواحد ها با استفاده از آزمون های تاییدی نظیر واکنش هضم آنزیمی و تعیین توالی، تایید شد. در ادامه توالی های نوکلئوتیدی? و ? از حامل باکتریایی خارج و سپس درون حامل بیانی ppic-9 کلون شدند. دو سازه نوترکیب مجددا در میزبان باکتریایی ? dh5تکثیر یافتند و سپس استخراج گردیدند. سازه نوترکیب ppic-9/fsh? با استفاده از آنزیم برشی sali و سازه نوترکیب ppic-9/fsh? با استفاده از آنزیم برشی saci خطی شدند و بطور همزمان طی فرآیند الکتروپوریشن به درون ژنوم سلول مخمر پیکیاپاستوریس درج گردیدند. سلول های ناقل هر دو زیرواحد با کمک واکنش pcr بر روی ژنوم سلول مخمری تایید و مشخص گردیدند؛ و در محیط کشت بیانی bmmy حاوی متانول کشت داده شدند. نتایج خوانش توالی نوکلئوتیدی زیرواحد fsh? نشان داده است که در ناحیهutr َ 3هورمون مورد مطالعه نسبت به گزارشاتی که تاکنون ثبت شده است، چند تفاوت نوکلئوتیدی مشاهده می شود؛ این تفاوت ها شامل اضافه شدن سه نوکلئوتید در موقعیت 418-413 جفت باز و تغییر یک نوکلئوتید در موقعیت 443 جفت باز می باشد. در این مطالعه، بیان پروتئین نوترکیب fsh اسبی در سیستم ترشحی مخمر پیکیاپاستوریس با استفاده از آزمون های sds-page، وسترن بلاتینگ و رسوب دهی ایمنی تایید شد. این تحقیق نشان داده است که پیکیاپاستوریس سیستم مناسبی برای تولید پروتئین fsh اسبی می باشد و شناسایی پروتئین موردنظر با آنتی بادی اختصاصی نشان دهنده ی انجام اصلاحات پس ترجمه ای صحیح این پروتئین در این سیستم بیانی می باشد

هورمون های گنادوتروپینی از جمله هورمون لوتئینه کننده ( lh) به خانواده ی هورمون های گلیکو پروتئینی تعلق دارند، این هورمون های گلیکوپروتئینی مولکول های هترودایمری هستند که از دو زیرواحد متفاوت به نام زیرواحد عمومی ? و زیر واحد اختصاصی ? تشکیل شده اند و به طور غیر کووالانت و با پیوندهای هیدروژنی و واندروالسی به هم متصل اند. بخش کربوهیدراتی هورمون های گلیکوپروتئینی مهم ترین نقش را در پتانسیل زیستی هورمون بازی می کند. این هورمون در رشد و بلوغ اندام های جنسی و صفات ثانویه جنسی موثر است و عملکرد آن برای بیوسنتز استروئید در تخمدان، تخمک گذاری، ایجاد جسم زرد در زنان و همچنین در محصولات آندروژنی حاصل از سلول های لیدیگ بیضه ای که موجب ساخت و ترشح تستوسترون در مردان می شود، با اهمیت است. ترشح این هورمون از هیپوفیز و در مواردی از جفت می باشد. با توجه به نقش lh در باروری و ایجاد صفات ثانویه ی جنسی، تزریق خارجی این هورمون می تواند اختلالات ناشی از بیماری های هیپوگنادیسم را کاهش دهد. lh در حال حاضراز دو راه ادراری و نوترکیب فرآوری می شود. سیستم بیانی در سلول تخمدان همسترچینی (chinese hamster ovary cell) علاوه بر دارا بودن مزایای سیستم ecoli، نظیر سطح بالای بیان، مزایای سیستم یوکاریوتی نظیر اصلاحات پس از ترجمه و گلیکولیزاسیون مناسب را دارا می باشد، که این ویژگی ها سیستم را برای تولید بالای پروتئین نوترکیب یوکاریوتی منحصر به فرد کرده است. در این تحقیق ابتدا ژن lh انسانی در میزبان باکتریایی کلون سازی و سپس ژن برش خورده و درون ناقل بیانی متناسب با سلول میزبان (cho ) کلون گردید. پس از انتقال به ژنوم سلول و تأیید نوترکیب بودن سلول های ترانسفورم شده، بیان هورمون نوترکیب با استفاده از روش های sds-page و وسترن بلاتینگ تأیید شد.

پرتوانی به عنوان ظرفیت سلول ها در تمایز به همه ی لایه های جنینی تعریف شده و سلول های بنیادی جنینی، سلول های پرتوانی هستند که از توده سلولِ درونیِ (icm) بلاستوسیست تولید می شوند. سلول های بنیادی جنینی موشی بطور متعارف روی فیبروبلاست های جنین موشی (mef) و در حضور سرمِ گاوی (fbs) کِشت می شدند. مطالعات نشان داده که با مهار دو مسیر پیام رسانیِ mapk و gsk3 ، سلول های بنیادی جنینی از نژادهای مختلف موشی تولید شدندکه این محیط کشت را“2i” نامیدند. با هدف کشف مسیرهای جایگزین و بهینه کردن محیط کشت سلول های بنیادی، تاثیر تعداد زیادی از ریز مولکول ها مطالعه شده است. به تازگی پژوهشگران پژوهشگاه رویان محیط کشت “r2i” را معرفی کرده اند که با بکارگیری دو کوچک مولکول sb431542 و pd0325901 (مهارکننده های مسیر tgfβ و mapk) نه تنها قادر به تولید سلول های بنیادی جنینی با کارایی حدود 100% هستند، بلکه در مقایسه با محیط کشت شناخته شده ی “2i” ، قدرت حفظ پایداری ژنومی بیشتری دارد. در مطالعه پیش رو، بررسی مکانیسم عملکردی تولید و حفظ پرتوانی سلول ها در حضور r2i انجام شده است. بدین منظور در فاز اول، پروفایل بیان ژن در دو رده سلول بنیادی جنینیِ کشت شده در محیط r2i و 2i بررسی شد که ضرورت فعال بودن مسیر پیام رسانی bmp4 در محیط کشت r2i نتیجه گیری شد. ضرورت نقش مسیر آبشاری bmp4 در حفظ وضعیت پایه پرتوانی در محیط کشت r2i با مهار گیرنده bmp4 اثبات شد که باعث تمایز و مرگ سلولی می شود کارایی بالای محیط r2i در تولید رده سلول بنیادی جنینی، این امکان را فراهم می کند که به بررسی مکانیسم این فرایند پرداخته شود. بنابراین در فاز دوم، پروفایل بیان ژنی و متیلاسیون dna در نمونه های جنینِ کشت شده در روند تولید سلول های بنیادی بررسی شد. ما الگوی بیان متفاوتی را در شبکه تنظیمی ژن های مرتبط به پرتوانی، متابولیسم انرژی، و تنظیم کننده های مورفولوژی سلولی از قبیل آبشار اتصالات اپی تلیالی مشاهده کردیم. نتایج متیلاسیون dna ، وضعیت هیپرمتیلاسیون را در سلول های icm به نسبت سلول های es نشان می دهد. در این آزمایش متیلاسیون dna بخصوص در نواحی line1، msat و iap بررسی شده است. این مطاله درک بهتری از مکانیسم مولکولی و مدار تنظیمی تولید سلول های پرتوان جنینی ارائه می دهد. مطالعات مراحل اولیه ی جنینی نشان می دهد که سلول های icm اپی تلیالی شکل بوده و در روند تکوین و تمایز، به سلول های مزانشیمی تبدیل می شوند. بیشتر بافت ها و ارگان ها از تبدیل سلول های اپی تلیالی به مزانشیمی بوجود می آیند. این فرایند تکوینی را emt و تبدیل سلول مزانشیمی به اپی تلیالی را met می نامند. در طرح حاضر، فرضیه ای مطرح شد که انسداد فرایند emt را برای تولید سلول بنیادی جنینی موشی لازم می دانست. به منظور اثبات این فرضیه، بیان ژن های cdh1، snail، و klf4 در روند تولید سلول های es مورد ارزیابی قرار گرفتند. همچنین با القاء emt با tgf-β1 و activin در دو محیط کشت 2i و r2i این فرضیه ارزیابی شد که در نهایت منجر به تایید فرضیه "لزوم انسداد فرایند emt" در روند تولید سلول های بنیادی جنینی موشی شد.استفاده از سلول های بنیادی به دلیل توانایی نامحدود در تمایز به سلول های جدید، از مهمترین چشم اندازهای طب ترمیمی تلقی می شود. بنابراین بالا بردن کارایی تولید و کشف مکانیسم های مولکولی درگیر در سلول های بنیادی جنینی موشی، راه کاری برای افزایش دانش تولید و نگهداری سلول های بنیادی انسانی (hescs) نیز خواهد بود.

چکیده هورمون محرک فولیکولی گوسفندی (ofsh) یک هورمون گلیکوپروتئینی است که از غده هیپوفیز قدامی ترشح می¬شود و نقشی اساسی در عملکرد سیستم تولید مثلی مهره¬داران ایفا می¬کند. این هورمون یک هورمون هترودایمریک شامل دو زیر واحد آلفا با 92 اسید آمینه و بتا با 111 اسید آمینه است که به¬صورت غیر کوالانسی بهم متصل¬اند. مخمر متیلوتروپ پیکیاپاستوریس یک میزبان ایده¬آل برای تولید پروتئین خارجی است. این مخمر به¬عنوان اقتصادی¬ترین سیستم بیانی یوکاریوتی برای ترشح پروتئین خارجی به داخل محیط کشت شناخته شده است. هدف از این طرح بهینه¬سازی بیان ژن fsh گوسفندی در مخمر پیکیاپاستوریس بود که توسط تنظیم و تغییر شرایط کشت مانند دما، درصد القای متانول، اسیدیته و ظرف کشت میسر می¬شود. برای انجام این تحقیق ابتدا فرایند بیان در یک دوره انکوباسیون 5 روزه در دماهای مختلف (15-18-21-24-27-30-32)، درصد¬های مختلف القای متانول (5/%0-%1-%2-%3)، اسیدیته (4-5-6-7-8) و ظروف کشت متفاوت (زاویه¬دار و بدون زاویه) با سه تکرار انجام شد. پس از پایان فرایند بیان پروتئین نوترکیب ترشح شده در محیط کشت توسط روش tca تغلیظ شد و سپس سطوح بیان در شرایط مختلف محیط کشت با استفاده از تکنیک¬های sds-pade و وسترن بلاتینگ مورد ارزیابی قرار گرفت. نهایتا دما، القای متانول، اسیدیته و ظرف کشت مناسب در طول فرایند بیان ژن، انتخاب شد. نتایج حاصل از sds-page و وسترن بلاتینگ باند پروتئینی تقریبا 18 کیلو دالتون را در محدوده مورد نظر نشان داد. این نتایج نشان داد که تاثیر پارامترهای محیطی روی بیان پروتئین قابل مشاهده است. همچنین این بررسی نشان داد که بهینه¬ترین شرایط کشت، دمای30 درجه سانتیگراد، القای متانول 5/0 درصد، اسیدیته 6 و ظرف کشت زاویه دار (بافل فلاسک) بود.

هدف از این مطالعه بررسی تاثیر پارامتر های مختلـف مانند دما، درصد القای متانول، اسیدیته، اکسیـژن محـلول و ظـرف کشـت روی بیان پروتئین fsh گاوی نوترکیب در مخمر متیلوتروپیک پیکیا پاستوریس بود. در این پروژه پروتئین fsh گاوی نوترکیب در سیستم بیانی پیکیا پاستوریس با استفاده از محیط کشت در دماهای 15، 18، 21، 27، 30 و 32، phهای 4، 5، 6، 7 و 8، درصدهای مختلف القای متانول 5/0، 1، 2 و 3 درصد و میزان اکسیژن محلول در نرخ 35 درصد و یک دوره زمانی 5 روزه در ظروف کشت متفاوت (ارلن، بافل فلاسک) تولید شد. پروتئین های نوترکیب با روش tca تغلیظ شدند و سپس با استفاده از تکنیک sds-page و وسترن بلاتینگ ارزیابی شدند و باند در ناحیه 16 کیلو دالتون مشاهده شد. نتایج نشان داد که میزان بهینه تولید پروتئین نوترکیب در دمای 30 درجه، 6ph=، غلظت 1 درصد متانول و در ظروف کشت زاویه دار با نرخ اکسیژن محلول در 35 درصد است.

این مطالعه بر روی 30 مرد دارای اختلال کوتاهی دم اسپرم، 30 مرد دارای اختلال الیگواستنوتراتوزواسپرمی و 40 مرد دارای اسپرموگرام طبیعی به عنوان گروه کنترل انجام گرفت. برای مطالعه¬ی تغییرات ژنتیکی و ناحیه اتصالی به پروتئین کیناز a و پروتئین های دارای دمین r2d2 (دمین rii binding )، ناحیه پایین دست این دمین تا ناحیه اتصالی به پروتئین akap4 و ناحیه اتصالی پروتئین akap3 به akap4، پس از استخراج dna از خون،¬ تکنیک¬های pcr و sequencing انجام شد. داده¬های حاصل از خوانش توالی با استفاده از نرم افزارهای finch tv و spss آنالیز شدند. در مورد توالی نوکلئوتیدی کد¬کننده ناحیه اتصالی akap3 به پروتئین¬کیناز a(دمینrii binding) و ناحیه¬ی پایین دست این قسمت تا قبل از ناحیه¬ اتصالی به پروتئین akap4، ¬تمامی نمونه¬های گروه¬های مورد مطالعه دارای ژنوتایپ نرمال بودند و هیچ تغییر ژنتیکی در آنها مشاهده نشد.¬ در مورد ناحیه اتصالی akap3 به پروتئین akap4 چهار پلی¬¬مورفیسمt<c 1378، پلی¬مورفیسم c>g 1391،پلی¬مورفیسم t>c1437 و پلی¬مورفیسم g>a 1573به صورت هاپلوتایپ در تمامی نمونه¬های دو گروه بیمار و گروه کنترل مشاهده شدند.¬ یک پلی¬مورفیسم دیگر نیز t>c1982 در دو نمونه با اختلال کوتاهی دم اسپرم و یک نمونه با اختلال الیگواستنوتراتوزواسپرمی به صورت هتروزیگوت (t/c) مشاهده گردید¬که از لحاظ آماری ارتباط معنی¬داری بین بیماران و گروه کنترل یافت نشد. علاوه بر پلی¬مورفیسم¬های ذکر شده، در پنج نمونه با اختلال اسپرم¬های دم کوتاه و شش نمونه با اختلال الیگواستنوتراتوزواسپرمی یک پلی¬مورفیسم t>c 1499 به صورت هموزیگوت و هتروزیگوت مشاهده گردید که در هیچ یک از نمونه¬های گروه کنترل یافت نشد. این اختلاف بین دو گروه بیمار در مقایسه با گروه کنترل از نظر آماری معنادار بود. در اثر این تغییر، اسید آمینه¬ی 500 این پروتئین از ایزولوسین به ترئونین تبدیل می¬شود. این اسیدآمینه در ناحیه اتصالی پروتئین akap3 به پروتئین akap4 واقع شده است. در این تغییر اسیدآمینه¬ی کوچک و هیدروفوبیک (ایزولوسین) به اسیدآمینه¬ی قطبی با اندازه¬ی متوسط تبدیل می¬شود. بنابراین می¬توان گفت که احتمالا این تغییر تک نوکلئوتیدی missense بر روی برهم¬کنش پروتئینakap3 و akap4 در ساختار غلاف فیبری دم اسپرم تاثیر می¬گذارد و در نتیجه بر ساختار و فولدینگ پروتئین نیز اثرگذار است.

هورمون محرک فولیکولی انسانی، یکی از اعضای خانواده ی هورمونهای گنادوتروپینی است. این هورمون گلیکوپروتئینی مانند دیگر اعضای این خانواده، ماکرومولکولی هترودایمر است که از دو زیرواحد تشکیل شده است. زیرواحد عمومی مشترک در تمام اعضای این خانواده و زیر واحد دیگر نامیده می شود. این هورمون بطور طبیعی در باروری زنان و مردان نقش دارد و به عنوان دارو در درمان ناباروری بطور گسترده ای استفاده می گردد. تولید صنعتی این دارو امروزه به دو صورت نوترکیب و استخراجی از ادرار زنان یائسه صورت می گیرد. تولید این هورمون بصورت نوترکیب و با کمک مهندسی ژنتیک مزایایی نسبت به نوع استخراجی از ادرار دارد که از آن قسم می توان مواردی مانند عدم آلودگی باهورمون lh ، عدم آلودگی با عوامل بیماریزای ویروسی و پریونی و همچنین خالص سازی آسان تر را نام برد. در نتیجه تمایل به تولید این دارو بصورت نوترکیب روز به روز افزایش یافته است. تولید این دارو در مقیاس صنعتی هنگامی دارای توجیه است که با کمترین هزینه ممکن، و با بیشترین بازده انجام پذیرد. بدین منظور در این مطالعه سعی شده است که برای کاهش هزینه تولید، تاثیر کاهش میزان سرم جنین گاوی محیط کشت سلول های نوترکیب cho به عنوان یکی از گرانترین ترکیبات محیط کشت، بررسی گردد. علاوه بر این برای بالا بردن میزان بیان این هورمون شرایط محیط کشت مانند دما و ph مد نظر قرار گرفته است. در این مطالعه با تغییر دما در بازه (c°37-c°28) و ph در بازه (6/7-7/6)، دما و ph ای که در آن بیشترین بیان وجود دارد تعیین گردید و در انتها تاثیر این دو عامل بطور همزمان بر میزان بیان هورمون بررسی شد. و مشاهده گردید با تاثیر ph و دمای بهینه ی در این آزمایش که به ترتیب 7 و c°28 می-باشد و در محیط حاوی 3%fbs میزان بیان را تا 14 برابر افزایش داد.

هورمون محرک فولیکولی (fsh) یک هورمون گلیکوپروتئینی است که از غده ی هیپوفیز پیشین ترشح می شود. این هورمون با تحریک تخمک گذاری در زنان و کمک به روند اسپرماتوژنز در مردان نقش مهمی را در تولیدمثل و باروری ایفا می کند. امروزه به علت خلوص بالا و ایمن بودن پروتئین های نوترکیب، تنها از این نوع fsh برای مصارف درمانی استفاده می شود. با توجه به پایین بودن میزان بیان پروتئین ها در لاین های سلولی پستانداران و به منظور افزایش بیان آن ها، از روش های مختلفی استفاده می شود که یکی از آن ها تغییر کدون های ژن مزبور با کدون های رایج در سلول های میزبان است. در این مطالعه کدون های توالی زنجیره بتای هورمون fsh انسانی، با توجه به codon usage سلول های تخمدان همستر چینی (cho)، بهینه و به همراه زنجیره آلفای fsh به درون سلول هایcho ترنسفکت شد. سپس با استفاده از تکنیک هایsds-page و وسترن بلاتینگ بیان پروتیئن fsh در سلول ها تایید و درنهایت از طریق تکنیک الایزا میزان بیان آن سنجیده شد. نتایج این پروژه حاکی از آن است که تغییر کدون های ژن زیرواحد بتای fsh انسانی مطابق با کدون های رایج در سلول های cho، منجر به افزایش چشمگیری در تولید پروتئین نوترکیب fsh می گردد. بنابراین روش فوق روش مناسبی جهت بهینه سازی بیان ژن محسوب می شود.

هورمون fsh ماهی عضوی از خانواده گنادوتروپین ها است که از غده هیپوفیز ماهی ترشح می شود. ساختمان این هورمون از دو زیرواحد ? و ? تشکیل شده است که به صورت غیرکووالان به یکدیگر متصل شده اند. این هورمون در تنظیم فرآیندهای ضروری تولیدمثل مانند گامتوژنز و رشد فولیکولار در ماهی نقش دارد. از مزایای تولید نوترکیب هورمون fsh می توان به اطمینان از عدم وجود آلودگی با سایر هورمون های گلیکوپروتئینی هیپوفیز و همچنین خالص سازی آسانتر اشاره کرد. در این مطالعه از پیکیا پاستوریس به عنوان سیستم بیانی، برای تولید هورمون fsh ماهی استفاده شد. بدین منظور کدون های توالی زنجیره بتای هورمون fsh ماهی، با توجه به codon usage مخمر پیکیا پاستوریس، بهینه شد. از روی rna استخراج شده از غده هیپوفیز، سنتز cdna صورت گرفته و سپس از روی cdna توالی زنجیره آلفا به وسیله pcr تکثیر شد. هر کدام از زیرواحدهای آلفا و بتا به صورت جداگانه درون وکتور بیانی ppic9 کلون شدند. در ادامه زیرواحد بتا به همراه توالی پروموتر و ختم رونویسی وکتور ppic9، به وسیله پرایمرهای طراحی شده بدین منظور، تکثیر و به درون وکتور ppic9 حاوی زنجیره آلفا وارد شد. سپس وکتور حاوی هر دو زیرواحد، خطی و درون ژنوم مخمر درج شد. در نهایت بیان هورمون fsh ماهی توسط تکنیک های sds-page و وسترن بلات تایید شد.

چکیده ندارد.