اکورین فوتوپروتئینی است که اولین بار از نوعی عروس دریایی بنام aequoera victoria کشف شد، که قادر است از خود نور آبی رنگ ساطع نماید. بدلیل حساسیت بالای اکورین به غلظت کلسیم و با توجه به اینکه در این پروتئین، درصد سیگنال نسبت به نویز پس زمینه، بسیار بالا است ، از این فوتوپروتئین در حوزه های مختلف زیست فناوری استفاده های زیادی می شود. در این پژوهش طی سه مرحله بر روی این پروتئین تحقیقات صورت گرفت: 1- فوتوپروتئین نوترکیب، در سیستم بیانی pet 21a(+) کلون و بیان گردید. پس از خالص سازی ، اکورین نوترکیب مورد آنالیز ساختاری ، سینتیکی ، پایداری حرارتی، خاموش کنندگی و پروتئازی در حضور چند پایدارکننده قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر افزایش پایداری و فعالیت اکورین تولیدی در حضور سوربیتول با کمترین تاثیر در هضم پروتئازی و خاموش کنندگی با آکریل آمید می باشد. 2- جهش های شیفت نوری و تغییر زمان تضعیف نشر نور در سه جهش y82f، w86f و d153g بصورت تک و دوتایی صورت گرفت. براین اساس شش پروتئین جهش یافته با نامهای aeq-82 ، aeq-86 ، aeq-153 ، aeq-82/86 ، aeq-82/153 و aeq-86/153 بدست آمد. در ادامه جهش های حاصله از نظر شیفت نوری، مدت زمان تضعیف نشر نور و پایداری حرارتی مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج بدست آمده نشان داد بیشترین طول موج نشر نوری از 457 نانومتر(aeq.) به 400 (aeq-82/86) و 478 (aeq-82 و aeq-82/153)نانومترتغییر یافته است. از سوی دیگر t1/2 یعنی مدت زمانی که فعالیت فوتوپروتئین، به 50 درصد اولیه می رسد، از 0.7 ثانیه(aeq.) به 3.7 (aeq-82)ثانیه افزایش یافته است. همچنین بنظر می رسد دو جهش aeq-86 و aeq-82/153 ، سبب افزایش پایداری حرارتی پروتئین در استرس دمایی 65 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه، شده است. 3- در بخش سوم از تحقیقات، از اکورین بعنوان آنزیم گزارشگر جهت شناسایی ترکیبات آروماتیک نظیر تولوئن و بنزن در قالب یک حسگر زیستی باکتریای استفاده شد. در این پژوهش از اجزاء اپرون xyl موجود در باکتری سودوموناس پوتیدا mt-2 استفاده گردید. به این صورت کهcdna فاکتور فعال کننده نسخه برداری یعنی xylr که در حضور ترکیبات آروماتیک فعال می شود و در دانشگاه مالک اشتر در داخل پلاسمید pgl2 کلون و با نام pgl2-px ثبت گردیده بود، مورد استفاده قرار گرفت. از سوی دیگر، بعد از پروموتور pu (که بوسیله پروتئین xylr فعال می شود) فوتوپروتئین اکورین همراه یا بدون حضور توالی شاین دالگارنو (sd) یا توالی ختم رونویسی rrnb)) در منطقه بالادستی آن کلون گردید. سپس پلاسمید طراحی شده در درون باکتری jm109 ،ترانسفورم گردید. به این ترتیب نوعی حسگر زیستی بر مبنای باکتری jm109 طراحی و بدست آمد. حسگر باکتریایی تولیدی در ادامه مورد آنالیز فعالیت براساس غلظت های متفاوت تولوئن و ترکیبات مشابه قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر مناسب بودن این حسگر باکتریایی جهت جایگزینی آن به جای روش های مرسوم شیمیایی نظیر کروماتوگرافی فشار بالا (hplc) می باشد.

ایمونوتوکسین ها عوامل فارماکولوژیکی با سموم پروتئینی متصل به یک لیگاند هدف مناسب هستند و به دو صورت شیمیایی و نوترکیب ساخته می شوند. در تحقیق حاضر زنجیره a از سم پروتئینی و گیاهی ریسین که ریبوزوم های یوکاریوتی را غیرفعال می کند توسط دو کراس لینکر مناسب برای تهیه ایمونوتوکسین ها یعنی spdp و smpt به سایتوکین g-csf متصل شده است تا یک ایمونوتوکسین به عنوان دارویی برضد سرطان خون تولید شود. بدین منظور زنجیره a ریسین به صورت نوترکیب در میزبان اشرشیاکلی سویه bl21(de3) بیان شده و توسط کروماتوگرافی تمایلی تخلیص شده است. سایتوکین موردنظر که بصورت تجاری تهیه گردیده، در معرض کراس لینکر 2-it قرار گرفته تا دارای گروه های سولفیدریل اضافی شود و بازده کانژوگاسیون از این طریق افزایش یابد. تمام مراحل کانژوگاسیون در بافر pbs-edta در ph حدود 5/7 انجام شد. نتایج بر روی ژل sds-page مشاهده و با رنگ آمیزی نیترات نقره تشکیل کانژوگه مورد نظر تایید شد. سپس برای تخلیص ایمونوتوکسین ساخته شده از روش خارج کردن باند پروتئینی از ژل و رنگ آمیزی منفی ایمیدازول ـ روی استفاده شد. با توجه به نتایج به دست آمده به نظر می رسد، پیوند دی سولفیدی برگشت پذیر ایجاد شده توسط کراس لینکر smpt دارای پایداری بیشتری نسبت به پیوند دی سولفیدی ایجاد شده توسط کراس لینکر spdp است.

فوتوپروتئین اکورین جدا شده از ژله فیش اکوریا ویکتوریا، فوتوپروتئین حساس به کلسیم است که از اپوپروتئین اپواکورین و گروه پروستاتیک کوالنترازین تشکیل شده که دراثر اتصال با کلسیم نور نشر می کند. این پروتئین مونومری شامل 4 موتیف ef hand است که 3 دومین آن می تواند به کلسیم متصل شود. اکورین به طور گسترده ای به عنوان شناساگر داخل سلولی کلسیم عمل می کند علاوه براین، فوتوپروتئین ملکول گزارشگر ارزشمند است چراکه در حضور کلسیم قدرت شناسایی درسطح اتومول را دارد. از طرف دیگر نقش مهمی در آبشار انتقال پیام عصبی از جمله رهاسازی نوروترانسمیتر، فعال سازی آنزیم دارد. دراین جا، ما 2 موتاسیون نقطه ای k30t)و (n28d و دو موتاسیون ترکیبی [nnk (n26d, n28d, k30t)] و nhn (n26d, h27g, n28d)] را در ناحیه ef hand ? طراحی کردیم. موتاسیون ها در این ناحیه از طریق روش موتاسیون هدایت شده کوایک چنج انجام شد و جهت بررسی حساسیت به کلسیم، اپواکورین با دنباله هیستیدین در e.coli بیان شد و نتایج نشان داد دو تک موتاسیون k30t,n28d برخلاف دو موتاسیون ترکیبی n26e , h27g , n28e (nhn) و n26d , n28d k30t (nnk)حساسیت بالاتری به کلسیم دارد.

امروزه توسعه صنعت پتروشیمی و کاربرد گسترده آن به عنوان منبع انرژی منجر به ورورد غلظت بالایی از ترکیبات آروماتیکی مثل بنزن، تولوئن، اتیل بنزن و گزیلن (btex) به سفره آب های زیرزمینی شده است. ازآنجا که این ترکیبات در برابرتجزیه زیستی مقاوم هستند پایداری بسیار بالایی را در طبیعت از خود نشان می دهند. این ترکیبات همچنین اثرات مضری برعملکرد سیستم عصبی انسان دارند به همین دلیل امروزه توسعه روش های شناسایی آنها در آب آشامیدنی،مواد غذایی،لوازم بهداشتی و ...بیش از پیش مورد توجه محققین قرار دارد. اگرچه برخی روش های آنالیز شیمیایی نظیر کروماتوگرافی فشار بالا (hplc) و گاز-کروماتوگرافی (gc) می توانند آلودگی های آروماتیک را در محیط شناسایی نمایند ولی این روشهای شیمیایی قدرت تمیز و تشخیص بین بخش های زنده و غیرزنده ترکیبات آروماتیک در سیستم های بیولوژیک را ندارند از سوی دیگر تجهیزات مربوطه اغلب حجیم بوده و وابسته به محیط آزمایشگاهی می باشند . براین اساس بسیاری از دانشمندان در راستای طراحی روشهای ساده و کم هزینه جهت شناسایی ترکیبات آروماتیک، از میکروارگانیسم های تجزیه کننده این ترکیبات استفاده کردند. در این پژوهش از اجزاء اپران xyl موجود در باکتری سودوموناس پوتیدا mt-2 جهت شناسایی ترکیب تولوئن در قالب یک حسگر زیستی باکتریایی استفاده شده است. پس از ساخت کانستراکت حاوی پروتئین تنظیمیxylr ، پروموتور pu و آنزیم گزارشگر لوسیفراز توسط تیم تحقیقاتی دکتر بهزادیان، به منظور بهینه سازی این کانستراکت، ما در پایین دست پروموتورpu، یک پروتئین فلورسنت دست ورزی شده که دارای توالی های شاین دالگارنو (sd) و توالی تقویت کننده رونویسی (enhancer) می باشد به عنوان گزارشگر جایگزین آنزیم لوسیفراز نمودیم.سپس پلاسمید طراحی شده در درون باکتری jm109، ترانسفورم شد. به این ترتیب نوعی حسگر زیستی بر مبنای اپران xyl طراحی و بدست آمد. حسگر باکتریایی تولید شده در ادامه مورد آنالیز وسنجش شدت فلورسانس بر اساس غلظت های متفاوت تولوئن و ترکیبات مشابه قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر مناسب بودن این حسگر باکتریایی جهت جایگزینی آن با روش های مرسوم شیمیایی می باشد. پس از بهینه سازی ساختار مولکولی زیست حسگر با کلون کردن ژن گزارشگر gfp، به منظور انجام بهینه سازی بیشتر و بالا بردن کارایی زیست حسگر با تغییر شرایط جانبی نظیر ترکیبات محیط کشت، دما، ph ، اضافه کردن ترکیبات کمکی به محیط کشت پایه، از نرم افزار بهینه سازی rsmبرای طراحی آزمایش استفاده شد.

هدف از این مطالعه، داخل کردن کاست بیانی آنتی سنس درون کروموزوم باکتریایی جهت کاهش بیان طولانی مدت ژن هدف، و استفاده از کاست بیانی آنتی سنس (ابزار اصلی ناک داون ژنی) برای انجام حذف ژنی (ناک اوت) در سیستم باکتریایی، بود. لذا این روش برای حذف همزمان ژن کدکننده آنزیم پروزامین سنتتاز (per) و کاهش بیانی ژن virb1 در باکتری بروسلا ملی تنسیس سویه rev1 برای دستیابی به سویه جهش یافته ضعیف شده ای از آن بکار برده شد. در این مطالعه، کاست حذف متشکل از کاست بیانی آنتی سنس virb1 و کاست بیانی ژن مقاومت کانامایسین (kanr)، با انجام نوترکیبی هم ساخت بوسیله وکتور خودکشی جایگزین ژن per شد. حذف ژن per با انجام واکنشهای pcr و تعیین توالی قطعه تکثیر یافته، و حذف عملکرد ژن per با انجام واکنش rt-pcr، مورد تأیید قرار گرفت. عملکرد کاست بیانی آنتی سنس virb1 با انجام واکنش rt-pcr تأیید شد و ارزیابی بیان ژن هدف virb1 نسبت به ژن مرجع groel در سویه والد و جهش یافته بوسیله real-time rt-qpcr با استفاده از پرایمرهای اختصاصی صورت گرفت. میانگین بیان mrna ژن virb1 در سویه جهش یافته نسبت به سویه والد به طور متوسط 10 برابر کمتر بود. در نهایت، میزان ماندگاری سویه جهش یافته با تعیین cfu باکتری در رده سلولی j774 و در مدل موشی balb/c، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل، کاهش معنی داری را در توانایی ورود، تکثیر و ماندگاری سویه جهش یافته در درون سلول های میزبان نشان داد. همچنین مقایسه و مشاهده اختلاف معنی دار در میزان ماندگاری سویه جهش یافته فوق نسبت به سویه جهش یافته کنترل (حذف ژن per تنها با کاست بیانی kanr) در سلول های طحال موشی، بیانگر کاهش عملکرد اپرون virb از طریق اثر مهاری کاست بیانی آنتی سنس virb1، بود. بدین ترتیب نتایج ما نشان داد که سویه حاصل یک سویه جهش یافته دارای نقص در ساختار lps و کاهش در عملکرد سیستم ترشحی خود بوده و در نتیجه علاوه بر کاهش خطا در تمایز ما بین حیوان واکسینه شده و حیوان آلوده در تست های تشخیصی، می تواند با انجام تست های ایمنولوژیکی بعنوان یک سویه کاندید واکسن مورد بررسی قرار بگیرد.

امروزه آلودگی آب یکی از بزرگترین مشکلات نوع بشر می باشد و از میان ترکیبات آلوده کننده آب ترکیبات btex (بنزن، تولوئن، اتیل بنزن و زایلن) ترکیباتی هستند که طیف گسترده ای از بیماری ها را به همراه دارند. زیست گزارشگرهای باکتریایی یکی از ابزاری هستند که توانایی سنجش کیفی و تا حدودی کمی آلودگی های زیست محیطی را دارا می باشند و این پتانسیل را دارند که جهت غربالگری نمونه های محیطی قبل از آنالیز دقیق آنها با روش های استاندارد مورد استفاده قرار گیرند. بعضی از باکتریها و قارچها دارای ژنهایی هستند که محصول روشن شدن آنها آنزیمهایی با توانایی باز کردن این ترکیبات حلقوی به شکل خطی و مصرف نهایی آنها به صورت واسطه های چرخه کربس و در نهایت زیست پالایی این مواد می باشد. یکی از این موجودات تجزیه کننده ترکیبات btex باکتری ralstonia pickettii pko1 می باشد. اپرون tbua1ubva2c اولین آنزیم مسیر تجزیه ترکیبات btex را در این باکتری کد می کند و tbua1 بخش پروموتری این اپرون می باشد که آنزیم rna پلیمراز دارای زیر واحد 54 ? رونویسی از آن را انجام می دهد اما این آنزیم دارای تمایل بسیارکمی برای شروع رونویسی از tbua1می باشد. پروتئین فعال کننده رونویسی tbut مسئول کنترل مثبت این اپرون می باشد و این توانایی را دارد تا در حضور ترکیبات btex به توالی uas از این اپرون متصل شود و این کمپلکس حاصل با میان کنش با rna پلیمراز دارای زیر واحد 54 ? رونویسی از tbua1 را تقویت می کند. در این تحقیق یک توالی سنتزی ساخته شد که توانایی تولید پیوسطه tbut را داراست. ژن گزارشگر gfp در این توالی تحت کنترل پروموتر tbua1 بیان می شود و این استراتژی سبب می شود که در حضور ترکیبات btex باکتریهایی که این توالی سنتزی به صورت الحاق شده در ناقل pgem-7zf(+) به درون آن ها وارد شده است از خود پیام فلورسنس تولید کنند. در این تحقیق اثر عواملی مانند نوع محیط کشت، نوع میزبان، دمای کشت، مرحله رشد بر این زیست گزارشگر و پارامترهای اختصاصی بون، حساسیت و lod آن سنجیده شد و با سایر گزارشات مشابه مقایسه شده است. نتایج نشان می دهد نوع محیط کشت و مرحله رشد بر پاسخ زیست گزارشگر موثر است و دمای 37 درجه سانتیگراد بهترین دمای بررسی زیست گزارشگر می باشد. میزان lod تولوئن و زمان پاسخ بعد از القا به ترتیب 5 میکرومولار و 48 ساعت می باشد. پاسخ زیست گزارشگر به ترکیبات btex اختصاصی است و دارای بیشتری انتخاب پذیری به تولوئن می باشد. همچنین نتایج نشان داد پاسخ زیست گزارشگر به مخلوط ترکیبات btex جمع پذیر می باشد.