تولید گیاهچه تراریخته گندم triticum aestivum)) با استفاده از روش های انتقال ژن به واسطه اگروباکتریوم و تفنگ ژنی و نیز پلاسمید pbi121 نوترکیب حاوی ژن نشانگر انتخابی نئومایسین فسفوترانسفراز تحت کنترل پیشبر nos و همچنین کیتیناز و گلوکاناز به عنوان ژن های هدف که هر کدام به طور جداگانه تحت کنترل پیشبرcamv35s قرار دارند، بررسی شد. در تراریزش با تفنگ ژنی، ریز نمونه های جنین نارس ارقام ( لاین a، مغان، آرتا، سایسون و گاسکوژن ) پس از جداسازی، بر روی محیط کالوس دهی تولید کالوس جنین زا نمودند. سپس کالوس های جنین زا، با ذرات طلای اندود شده با پلاسمید نوترکیب بمباران شده و به محیط کالوس دهی انتخابی حاوی 50 میلی گرم بر لیترکانامایسین منتقل شدند. پس از آن جهت تولید شاخه و ریشه به محیط باززایی انتخابی حاوی ?? میلی گرم بر لیترکانامایسین منتقل شدند. بیشترین درصد تراریزش با تفنگ ژنی 8/4 درصد مربوط به رقم لاین a و بعد از آن 3/0 درصد مربوط به رقم مغان بود. در سایر ارقام هیچ گیاه تراریخته ای حاصل نشد و درصد تراریزش آن ها صفر درصد بود. تراریزش به واسطه اگروباکتریوم با استفاده از سویه های, lba4404, c58 eha101, agl1 حاوی پلاسمید pbi121 نوترکیب فوق بررسی شد. ریز نمونه های جنین نارس پس از جداسازی، با سوسپانسیون باکتری دارای پلاسمید نوترکیب هم کشت شده، سپس در محیط کالوس دهی انتخابی حاوی ?? میلی گرم بر لیتر کانامایسین قرار گرفتند. پس از آن کالوس های جنین زا انتخاب و به محیط باززایی حاوی ?? میلی گرم بر لیتر کانامایسین جهت تولید شاخه و ریشه منتقل شدند. بیشترین درصد تراریزش با اگروباکتریوم 31/0 درصد مربوط به رقم آرتا تلقیح شده با سویه c58 و پس از آن رقم آرتا تلقیح شده با سویه lba4404 با درصد تراریزش 14/0 درصد بود. در سایر ارقام و سویه ها هیچ گیاه تراریخته ای حاصل نشد و درصد تراریزش آن ها صفر درصد بود. در این تحقیق 18 گیاه تراریخته شامل 3 گیاه حاصل از روش اگروباکتریوم و 15 گیاه حاصل از روش تفنگ ژنی بدست آمد. واکنش زنجیره ای پلیمراز و آنالیز لکه گذاری dna نشان دادند که گیاهان فرضی تراریخته در مقایسه با شاهد حداقل یک نسخه از ژن های کیتیناز و گلوکاناز و نیز نئومایسین فسفوترانسفراز را در ژنوم خود دارا هستند.

مهندسی ژنتیک کلروپلاست چندین مزیت منحصر به فرد نسبت به انتقال ژن به هسته ارائه می دهد. بیان بسیار بالای پروتئین های نوترکیب، درون سیستم های مهندسی شده پلاستیدی، روشی موثر و ارزشمند را برای استفاده از گیاه به عنوان بیورآکتور مطرح می کند. در این تحقیق با طراحی و ساخت ناقل های مناسب عمومی و اختصاصی برای انتقال ژن به کلروپلاست گیاهان، تلاش شد تا گام موثری به عنوان گزینه ای جایگزین برای تراریزش هسته ای برداشته شود. لذا با استفاده از آنالیزهای بیوانفورماتیکی ژنوم های پلاستیدی موجود در بانک های اطلاعاتی، قسمتی از توالی پلاستوم به عنوان توالی هدف گیری کننده ژن خارجی به ژنوم کلروپلاستی انتخاب گردید که دارای طول مناسب برای ایجاد نوترکیبی همولوگ و الحاق در پلاستوم، ناحیه آغاز همانندسازی اختصاصی پلاستوم، هدف گیری ژن در ناحیه تکرار معکوس پلاستیدی و جایگاه های آنزیمی منحصر به فرد در مرکز توالی برای الحاق ژن خارجی باشد. توالی های مجاور یا هدف گیری کننده با طراحی یک جفت پرایمر از نواحی حفاظت شده مورد نظر از پلاستوم های توتون و 7 گیاه دیگر، جداسازی و کلون سازی شد. سپس با افزودن نواحی تنظیمی مختلف شامل پیشبرها و پایانبرهای دائمی کلروپلاستی و القایی، نواحی بدون ترجمه یا utrهای مناسب، نواحی اتصال ریبوزوم پلاستیدی، جایگاه های آنزیمی مناسب ورود ژن برای بیان انفرادی و یا پلی سیسترونی، ژن گزارش گر، ژن های نشانگر انتخابی آنتی بیوتیکی و غیرآنتی بیوتیکی و توالی هایی برای حذف ژن نشانگر پس از انتقال ژن، تلاش شد تا انواع مختلفی از حامل های کلروپلاستی ساخته شوند تا بتوان بیان هر ژن خارجی را به طور دلخواه در ژنوم های پلاستیدی گیاهان مختلف به صورت کارا امکان پذیر نمود. صحت ساخت ناقل های کلروپلاستی توسط آنالیزهای ملکولی مختلف تایید گردید. از سویی دیگر جداسازی و ساخت کاست بیانی برای گروه ژنی (اُپران) پلی هیدروکسی بوتیرات (phb) و کلون سازی آن در ناقل بیانی و ناقل های کلروپلاستی به منظور انتقال آن به ژنوم پلاستیدی برای دستیابی به تولید ارزان پلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات به عنوان پلاستیک زیست تخریب پذیر که دارای بسیاری از ویژگی های پلاستیک های نفتی بوده و دارای کاربردهای صنعتی مهمی نیز نظیر ساخت کپسول های قابل تجزیه زیستی برای رهاسازی دارو در دراز مدت، نخ بخیه، بیوپلیمر جایگزین استخوان و غیره، می باشد، انجام گرفت. صحت جداسازی و کلون سازی و بیان هر سه ژن اُپران phb توسط آنالیزهای مختلف pcr، هضم آنزیمی و کروماتوگرافی گازی تایید گردید و در نهایت پلیمر مذکور توسط باکتری های نوترکیب ساخته شده در این تحقیق تولید و استخراج گردید. از سویی دیگر سیستمی با قرار دادن پیشبر شوک حرارتی e. coli (groe) در ناقل پلاستیدی و ساخت سیگما فاکتور هیبرید گیاه- باکتری تحت یک پیشبر مختص بافت طراحی گردید تا بتوان بر مشکل کاهش رشد و یا باروری گیاه در انتقال ژن به پلاستید که اغلب به دلیل اثرات تولید دائمی محصول تراژن ایجاد می گردد نیز غلبه نمود. به طوری که با ترکیب موتیف های قسمت n-ترمینال شبه سیگما فاکتور توتون که علاوه بر توالی نشانه برای ورود به کلروپلاست دارای موتیف برهمکنش با پلیمراز کلروپلاستی می باشد با موتیف های قسمت c-ترمینال فاکتور سیگما 32ی e. coli که قدرت تشخیص و اتصال به پروموتر groe را دارد، یک فاکتور سیگمای هیبرید گیاه e. coli طراحی گردید. این موتیف ها با طراحی پرایمر از توالی نوکلئوتیدی فاکتور سیگمای باکتری و گیاه تکثیر شد و اتصال آنها به هم با استفاده از soeing pcr طوری انجام گرفت که چهارچوب باز خواندنی (orf) اصلی در فاکتور سیگمای هیبرید حاصل حفظ گردد. سپس این ژن هیبرید موسوم به hsig طی مراحلی به منظور اختصاصی کردن بیان ژن در پلاستیدهای گیاهی با افزودن نواحی تنظیمی در وکتور اگروباکتریومی پس از حذف ژن نشانگر انتخابی کلون سازی شد. از وکتور نوترکیب حاصل برای انتقال ژن به رقم ایرانی توتون استفاده گردید و ردیابی گیاهان تراریخته باززاشده روی محیط غیرانتخابی توسط آنالیز pcr انجام شد. الحاق ژن hsig و کپی شمار آن در ژنوم گیاه تراریخته به ترتیب توسط آنالیزهای سادرن بلات و real time pcr تعیین شد. بیان ژن hsig و هدف گیری آن به پلاستید توسط بیان ومشاهده پروتئین فلورسنت سبز (gfp) پس از انتقال کاست بیانی طراحی شده برای gfp تحت پیشبر groe در ناقل pfngi به کلروپلاست توتون توسط تفنگ ژنی اثبات شد. سپس سه ژن اُپران phb جایگزین gfp در ناقل کلروپلاستی گردید و توسط دو ناقل pfnpi و pfnp به پلاستید توتون منتقل شد. آنالیز pcr حضور اُپران را در گیاهان ترانسپلاستومی حاصل تایید نمود. سیستمی که برای بیان phb در ژنوم کلروپلاستی طراحی و ساخته شد این قابلیت را خواهد داشت که با جایگزینی هر ژن دلخواه دیگری به جای phb استفاده و به عنوان زمینهای کارا و سازگار با مسائل زیست محیطی و برای ایجاد صفات مطلوب زراعی و نیز تولید پروتئینهای درمانی، واکسنها و مواد زیستی، به کار رود.

تنش های غیر زیستی از جمله خشکی و شوری اولین عامل کاهش محصول در دنیا است. در این تحقیق ژن بتائین آلدهید دهیدروژناز(badh) هم به عنوان یک نشانگر غیر آنتی بیوتیکی و هم به عنوان یکی از ژن های کاندید در تحمل به تنش های غیر زیستی به همراه ژن فلاودکسین(fld) در ساخت وکتور کلروپلاستی برای گیاه برنج مورد استفاده قرار گرفت. سپس طراحی کاست ژنی برای ژن های fld وbadh تحت نواحی تنظیمی کلروپلاستی انجام شد، به طوری که ژن fld همراه با rbcl 5utr و ژن badh همراه با t7gene10 5utr به صورت پلی سیسترونی تحت پیشبر قوی کلروپلاستی prrn و پایانبر rbcl 3utr کلون سازی شدند. سرانجام کاست کامل دو ژنی fld/badh به همراه نواحی تنظیمی از وکتور نوترکیب حاصل موسوم به pbf جدا و در مرکز ناحیه هدف گیری کننده به کلروپلاست برنج در دو جهت کلون سازی گردید. در این تحقیق به منظور تولید گیاه برنج تراریخته متحمل به تنش های غیر زنده به روش اگروباکتریوم از سویه eha105 وحامل پلاسمیدی p6-ubi استفاده شد. این وکتور حاوی ژن نشانگر باکتریایی استروپتومایسین و نشانگر گیاهی هیگرومایسین و ژن فلاودکسین (fld) می باشد. بدین منظور از کالوس های جنین زای برنج رقم هاشمی به عنوان بافت هدف استفاده شد. پس از آلوده کردن کالوس ها با سوسپانسیون باکتری، کالوس ها به محیط هم کشتی انتقال داده شد. گیاهان باززا شده محلول یوشیدا منتقل شدند. آنالیزpcr باپرایمر های virg، عدم آلودگی به اگروباکتریوم، و با پرایمر های fld نشان داد، حداقل یک نسخه از ژن fld در ژنوم این گیاهان وجود دارد. در روش دوم به منظور دستیابی به برنج تراریخته فاقد ژن نشانگر آنتی بیوتیکی، از پلاسمید های کلروپلاستی (pfrfb(- و pfrfb(+) ساخته شده استفاده شد. این پلاسمید ها به روش ریزپرتابه منتقل شدند. پس از بمباران کالوس‎ها به محیط کشت باززایی ms انتقال یافتند.آنالیزpcr باپرایمر های fld نشان داد، حداقل یک نسخه از ژن در ژنوم این گیاهان وجود دارد.