در بخش اول این پژوهش، از سویه پیکیا پاستوریس فنوتیپ mut+ تولید کننده درون سلولی آنزیم بتا-گالاکتوزیداز برای مطالعه راهبردهای متداول خوراک دهی متانول و توسعه راهبرد جدیدی استفاده شد. سه راهبرد متداول خوراک دهی، شامل µ-stat، do-stat و غلظت متانول ثابت مطالعه شدند و از نظر فعالیت آنزیم های الکل اکسیداز، فرمات دهیدروژناز و بتا-گالاکتوزیداز، وزن خشک سلولی، غلظت فرمالدهید و غلظت متانول با یکدیگر مقایسه شدند. در روش خوراک دهی متانول با µ-stat h-1 025/0 بالاترین فعالیت بتا-گالاکتوزیداز به دست آمد. یک راهبرد جدید خوراک دهی بر پایه داده های حاصل از مطالعه راهبردهای متداول خوراک دهی توسعه یافت که در آن خوراک دهی متانول به مدت 5 ساعت با µ-stat h-1 025/0 شروع شد، پس از آن با خوراک دهی متانول µ-stat h-1 030/0 تا قبل از شرایط محدودیت اکسیژن ادامه یافت و در نهایت با مشکل شدن کنترل اکسیژن محلول در 20% اشباع هوا به do-stat تغییر یافت. کاربرد این خوراک دهی جدید منتج به وزن خشک سلولی g/l 2/107، فعالیت ویژه الکل اکسیداز u/mgcdw 1890/0 و فعالیت بتا-گالاکتوزیداز ku/ml 5/173 پس از 29 ساعت از تخمیر شد، که به ترتیب افزایشی 6/5، 1/29 و 7/15 درصدی نسبت به خوراک دهی µ-stat h-1 025/0 نشان می دهد. در بخش دیگری از پژوهش حاضر، با استفاده از سویه پیکیا پاستوریس فنوتیپ muts و تولید کننده برون سلولی سرم آلبومین انسانی، کشت غیرمداوم با خوراک دهی جدیدی در شرایط نیتروژن محدود ارائه شده است. در این روش خوراک دهی، منبع نیتروژن لازم برای رشد سلولی و تولید پروتئین نوترکیب با انتخاب هیدروکسید آمونیوم به عنوان باز در کنترل ph تأمین می شود؛ با تغییر پیش فرض های ton و toff کنترل کننده ph سرعت تیتراسیون یا به عبارتی سرعت افزودن باز برای تنظیم ph تغییر می کند و از این طریق سرعت رشد سلولی کنترل می شود. تنظیم نسبت ton/toff در 5/0 بر 10 و 5/0 بر 15 برای فراهم کردن خوراک دهی نیتروژن محدود منتج به رشدی خطی شد و سرعت رشد سلولی را به ترتیب تا g/lh 64/2 و 85/1 کاهش داد. پس از اتمام گلیسرول اولیه موجود در محیط کشت و افزودن مقدار اضافه تر از گلیسرول، رشد سلولی در شرایط خوراک دهی نیتروژن محدود ادامه یافت. فاز القا با افزودن مخلوطی از متانول و سوربیتول به عنوان گوهرمایه مخلوط و انتخاب مقادیر 5/0 بر 10 و 5/0 بر 20 برای ton/toff در دو کشت مختلف انجام شد. نسبت ton/toff کم تر باعث سرعت رشد و تولید پروتئین نوترکیب پایین تری شد. این یافته امکان کنترل سرعت رشد و تولید پروتئین نوترکیب را در تراکم سلولی بالا با استفاده از راهبرد جدید کنترل نیتروژن محدود تأیید می کند.

در بخش اول این پژوهش، از سویه پیکیا پاستوریس فنوتیپ mut+ تولید کننده درون سلولی آنزیم بتا-گالاکتوزیداز برای مطالعه راهبردهای متداول خوراک دهی متانول و توسعه راهبرد جدیدی استفاده شد. سه راهبرد متداول خوراک دهی، شامل µ-stat، do-stat و غلظت متانول ثابت مطالعه شدند و از نظر فعالیت آنزیم های الکل اکسیداز، فرمات دهیدروژناز و بتا-گالاکتوزیداز، وزن خشک سلولی، غلظت فرمالدهید و غلظت متانول با یکدیگر مقایسه شدند. در روش خوراک دهی متانول با µ-stat h-1 025/0 بالاترین فعالیت بتا-گالاکتوزیداز به دست آمد. یک راهبرد جدید خوراک دهی بر پایه داده های حاصل از مطالعه راهبردهای متداول خوراک دهی توسعه یافت که در آن خوراک دهی متانول به مدت 5 ساعت با µ-stat h-1 025/0 شروع شد، پس از آن با خوراک دهی متانول µ-stat h-1 030/0 تا قبل از شرایط محدودیت اکسیژن ادامه یافت و در نهایت با مشکل شدن کنترل اکسیژن محلول در 20% اشباع هوا به do-stat تغییر یافت. کاربرد این خوراک دهی جدید منتج به وزن خشک سلولی g/l 2/107، فعالیت ویژه الکل اکسیداز u/mgcdw 1890/0 و فعالیت بتا-گالاکتوزیداز ku/ml 5/173 پس از 29 ساعت از تخمیر شد، که به ترتیب افزایشی 6/5، 1/29 و 7/15 درصدی نسبت به خوراک دهی µ-stat h-1 025/0 نشان می دهد. در بخش دیگری از پژوهش حاضر، با استفاده از سویه پیکیا پاستوریس فنوتیپ muts و تولید کننده برون سلولی سرم آلبومین انسانی، کشت غیرمداوم با خوراک دهی جدیدی در شرایط نیتروژن محدود ارائه شده است. در این روش خوراک دهی، منبع نیتروژن لازم برای رشد سلولی و تولید پروتئین نوترکیب با انتخاب هیدروکسید آمونیوم به عنوان باز در کنترل ph تأمین می شود؛ با تغییر پیش فرض های ton و toff کنترل کننده ph سرعت تیتراسیون یا به عبارتی سرعت افزودن باز برای تنظیم ph تغییر می کند و از این طریق سرعت رشد سلولی کنترل می شود. تنظیم نسبت ton/toff در 5/0 بر 10 و 5/0 بر 15 برای فراهم کردن خوراک دهی نیتروژن محدود منتج به رشدی خطی شد و سرعت رشد سلولی را به ترتیب تا g/lh 64/2 و 85/1 کاهش داد. پس از اتمام گلیسرول اولیه موجود در محیط کشت و افزودن مقدار اضافه تر از گلیسرول، رشد سلولی در شرایط خوراک دهی نیتروژن محدود ادامه یافت. فاز القا با افزودن مخلوطی از متانول و سوربیتول به عنوان گوهرمایه مخلوط و انتخاب مقادیر 5/0 بر 10 و 5/0 بر 20 برای ton/toff در دو کشت مختلف انجام شد. نسبت ton/toff کم تر باعث سرعت رشد و تولید پروتئین نوترکیب پایین تری شد. این یافته امکان کنترل سرعت رشد و تولید پروتئین نوترکیب را در تراکم سلولی بالا با استفاده از راهبرد جدید کنترل نیتروژن محدود تأیید می کند.

در این مطالعه، کشت سلولی با تراکم سلولی بالای باکتری e. coli نوترکیب تولید کننده آنزیم پروکیموزین به منظور افزایش تولید آنزیم پروکیموزین بررسی شد. برای افزایش تراکم سلولی از روش کشت غیرمداوم خوراک دهی شده با خوراک دهی نمایی استفاده شد. در ابتدا بهینه سازی محیط کشت در فلاسک انجام شد و چهار محیط کشت که به ترتیب میزان توده سلولی در آن ها 765/0، 614/0، 875/0و 908/0 گرم بر لیتر بود، انتخاب و در مرحله کشت غیرمداوم مورد استفاده قرار گرفتد. محیط کشت شماره 20 با میزان توده سلولی 75/3 گرم بر لیتر به عنوان بهترین محیط کشت انتخاب شد. روش سطح پاسخ جهت بهینه سازی استفاده شد. سرعت های رشد ویژه بین 2/0 و 3/0 بر ساعت و زمان های القاء نیز بین 6 و 10 ساعت پس از شروع خوراک دهی به عنوان ورودی های نرم افزار تنظیم شدند و 11 آزمایش توسط نرم افزار design expert جهت بهینه کردن حداکثر تولید توده سلولی، پروتئین کل و پروکیموزین طراحی شدند. سرعت های رشد ویژه 25/0 و 20/0 بر ساعت و زمان های القای 10 و 8 ساعت به ترتیب دارای بیشترین و کمترین میزان توده سلولی بود. همچنین با افزایش زمان القاء از 7 تا 9 ساعت و 24 دقیقه، توده سلولی افزایش و هرچه مدت زمان شروع القاء به شروع فرایند خوراک دهی نزدیک تر بود، میزان توده سلولی نهایی بیشتر کاهش یافت. افزایش سرعت رشد ویژه تا حدود 26/0 موجب افزایش توده سلولی و افزایش بیشتر از این مقدار باعث کاهش توده سلولی شد. سرعت های رشد ویژه 25/0 و 2/0 بر ساعت با زمان القای 8 ساعت به ترتیب بیشترین و کمترین میزان پروتئین کل را دارا بودند. افزایش سرعت رشد ویژه تا حدود 25/0 بر ساعت باعث افزایش پروتئین کل و افزایش بیشتر آن یک روند کاهشی در میزان پروتئین کل ایجاد می کند. سرعت رشد ویژه 25/0 بر ساعت با زمان های القای 6 و 10 ساعت به ترتیب بیشترین و کمترین میزان پروتئین پروکیموزین را دارا بودند. با افزایش زمان القاء از 6 ساعت و 35 دقیقه تا 9 ساعت و 24 دقیقه، میزان پروتئین پروکیموزین به طور معنی داری کاهش و با افزایش سرعت رشد ویژه از 21/0 تا حدود 25/0 بر ساعت، پروکیموزین به طور معنی داری افزایش یافت. سرعت رشد و زمان القاء بهینه پیش بینی شده توسط نرم افزار جهت تولید حداکثر مقدار پروتئین پروکیموزین به ترتیب 25/0 بر ساعت و 6 ساعت و 35 دقیقه بود که در این حالت میزان بیان پروتئین پروکیموزین برابر 503/0 گرم بر لیتر بود.