نایسریا مننژیتیدیس دیپلوکوک گرم منفی کپسولدار و عامل مننژیت و سپتی سمی باکتریایی می-باشد. در حالیکه واکسن های کونژوگه پلی ساکاریدی علیه عفونت های ایجاد شده توسط سروگروه های a, c, y, w135 در دسترس می باشد؛ واکسنی جهت پیشگیری از بیماری ایجاد شده توسط سروگروه b وجود ندارد، چرا که واکنش متقاطع کپسول سروگروه b با گلیکوپروتئین های سطح سلول های جنینی انسان، تلاش ها جهت طراحی واکسن مناسب علیه این سروگروه را با مشکل مواجه کرده است. هدف از مطالعه حاضر تهیه پروتئین های نوترکیب پورین کلاس یک (pora) و قطعه ای از c ترمینال سکرتین pilq (pilq406-770) و استخراج وزیکول غشاء خارجی (omv) نایسریا مننژیتیدیس سروگروه b و نیز بررسی پاسخ های ایمنی آنها به عنوان کاندیدایی مناسب جهت ادامه تحقیقات در مسیر تهیه واکسن علیه سروگروه b می باشد. ژن های کد کننده پروتئین-های مذکور از ژنوم نایسریا مننژیتیدیس atcc13090 به روش pcr جدا شده و با هضم آنزیمی به داخل وکتورهای pet28a و pet32a وارد شدند. سپس به داخل میزبان های کلونینگ و بیانی ترانسفورم و بیان شدند. پس از خالص سازی پروتئین های نوترکیب به روش کروماتوگرافی تمایلی توسط رزین نیکل، واکنش پذیری ایمنی آنها نیز توسط وسترن بلات بررسی گردید. با روش های هضم آنزیمی، pcr و تعیین توالی مشخص شد که ژن های مورد بررسی به درستی درون وکتورها کلون شده اند. نتایج sds-page نیز صحت بیان پروتئین ها را تائید نمود. در مرحله بعد پاسخ های ایمنی تولید شده نسبت به مخلوط این پروتئین های نوترکیب و همچنین هر یک از پروتئین ها بطور جداگانه همراه با omv یا ادجوانت فروند در موش های balb/c بررسی شد. تلقیح زیر جلدی پروتئین ها موجب تحریک قابل توجه آنتی بادی های igg، igg1 و igg2a سرمی ضد پروتئین های نوترکیب گردید. آنتی سرم های تولید شده علیه پروتئین های نوترکیب، با سروگروه های a و b مننگوکوک میانکنش سطحی داشته و همچنین علیه این سروگروه ها فعالیت باکتریسیدال و اپسونیک نشان دادند. این اثرات در حالت مخلوط دو پروتئین به همراه omv بیشتر از هر یک از پروتئین ها به تنهایی بود (p<0.001). در واقع نتایج این تحقیق نشان داد که مخلوط پروتئین های pilq406-770-pora به همراه omv بطور موثری قادر به تحریک آنتی بادی های باکتریسیدال علیه سروگروه b مننگوکوک می باشد.

کارباپنم ها به منظور درمان عفونت های جدی ناشی از باکتری های گرم منفی دارای مقاومت های چندگانه، به ویژه انتروباکتریاسه ها و سودوموناس آئروژینوزاهای مولد سفالوسپورین ها یا esbl ها کاربرد دارند. هدف از انجام این تحقیق بررسی میزان شیوع ایزوله های دارای مقاومت به ایمیپنم همراه با تعیین ژن های کارباپنماز، kpcو ges، توسط pcr می باشد. الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی 259 ایزوله ی (80 اشریشیا کلی، 79 کلبسیلا پنومونیه و 100 سودوموناس آئروژینوزا) تعیین گردید. ایزوله ها ی دارای قطر هاله ی عدم رشد معادل ?20 میلی متر نسبت به ایمیپنم انتخاب و به صورت فنوتیپی و با استفاده از 3 مهار کننده ی برونیک اسید، edta و کلاوولانیک اسید از نظر دارا بودن کارباپنمازهای کلاس a بررسی شدند. سپس سویه ها ی دارای قطر هاله ی عدم رشد معادل 5? میلی متر در ترکیب با مهار کننده ی برونیک اسید با استفاده از روش دیسک ترکیبی با مهار کننده ی کلوگزاسیلین مورد بررسی قرار گرفتند. در نهایت ایزوله های دارای قطر هاله ی عدم رشد معادل 5? میلی متر در ترکیب با مهار کننده ی برونیک اسید از لحاظ حضور ژن های kpc و ges، با استفاده از آزمون pcr مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج آزمون انتشار دیسک برای اشریشیا کلی به این شکل بود: ایمیپنم 25/1%، سفتازیدیم 44%، سفوتاکسیم 70%،سیپروفلوکساسین و جنتامایسین 41%، آمیکاسین 5/37%، آزترونام 45% و آموکسی سیلین 5/67%. نتایج این آزمون برای کلبسیلا پنومونیه به صورت ایمیپنم 53/2%، سفتازیدیم 44%، سفوتاکسیم 30%، سیپروفلوکساسین و جنتامایسین 35%، آمیکاسین 57%، آزترونام 40% و آموکسی سیلین 71% و برای سویه های سودوموناس آئروزینوزا به صورت ایمیپنم 34%، سفتازیدیم 70%، سفوتاکسیم 80%، سیپروفلوکساسین و آمیکاسین و پیپراسیلین 40%، جنتامایسین 60%، آزترونام و تیکارسیلین 50% و توبرامایسین 45% مشخص گردید. از میان 259 ایزوله ی مورد مطالعه، 62 ایزوله دارای قطر هاله ی عدم رشد معادل ?20 میلی متر نسبت به ایمیپنم مشخص گردید. نتیجه ی بررسی فنوتیپی بر روی 62 ایزوله ی مذکور به منظور تعیین حضور بتالاکتامازهای کلاس a در اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه به صورت منفی تشخیص داده شد. اگرچه در این بررسی تعداد 20 ایزوله ی سودوموناس آئروژینوزا از لحاظ فنوتیپی نشان دهنده ی حضور احتمالی بتالاکتامازهای کلاس a بود. هیچ یک از ایزوله های اشریشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه و سودوموناس آئروژینوزا در آزمون pcr واجد ژن های kpc و ges شناخته نشدند. بنابراین حضور سایر آنزیم های دخیل در ایجاد مقاومت یا کاهش حساسیت نسبت به کارباپنم ها از قبیل سایر کارباپنمازهای کلاس a (شاملnmc-a، imi و sme)، سایر آنزیم ها و یا سایر مکانیسم ها در سویه های مورد مطالعه محتمل می باشد. با توجه به یافته-های به دست آمده در این پژوهش خوشبختانه هنوز مقاومت های کارباپنمازهای kpc و ges، در ایزوله های اشریشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه و سودوموناس آئروژینوزا در ایران وجود ندارد.

هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b، نوعی باکتری گرم منفی کپسولدار است و یکی از شایع ترین عوامل مولد مننژیت حاد بشمار می آید. کپسول پلی ساکاریدی این باکتری ؛پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (prp )و پروتئین غشاء خارجی p6 به عنوان ایمونوژن در تولید واکسن علیه هموفیلوس آنفلوانزا نقش دارند .هدف از انجام این مطالعه ، کونژوگه نمودن پروتئین نوترکیب p6(rp6 ) با prp و ارزیابی ایمونولوژیک آن به عنوان کاندیدای جدید واکسیناسیون در مدل موشی است. به این منظور، prp پس از کشت انبوه سویه استاندارد هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b(atcc 10211 ) در فرمانتور 50 لیتری ، تولید و تخلیص گردید. ژن p6 نیز در سیستم pet28a(+) ، کلون و در میزبان e.coli bl21 بیان شد و پروتئین نوترکیب p6پس از تخلیص ، با prp بصورت کونژوگه در آمد. گروههای موشی balb/cبطور جداگانه بصورت داخل صفاقی با کونژوگه prp-rp6 ، prp، rp6و مخلوط prp+rp6 ایمن گردیدند . عیار igm و igg اختصاصی علیه آنتی ژنهای مذکور در نمونه های سرم جمع آوری شده در روزهای 14 و 28 اندازه گیری شد. سطوح اینترلوکین 4 و اینترفرون گاما نیز در کشت لنفوسیتهای موشهای ایمن شده مورد سنجش قرارگرفت. اثرات حفاظتی هریک از آنتی ژنها هم پس از چالش موشهای ایمن با سویه بیماریزای هموفیلوس آنفلوانزا بررسی گردید . در نتیجه کشت انبوه هموفیلوس آنفلوانزا در فرمانتور 50 لیتری ، prp با غلظت تقریبی 790 میلی گرم بر لیتر جداسازی شد. ژن p6 نیز با موفقیت در وکتور pet28a(+) کلون و در e.coli bl21 بیان گردید که در نتیجه آن ، rp6 با بازدهی بالا و بمیزان تقریبی 50 میلی گرم از هر لیتر محیط کشت تخلیص شد. rp6 و prpبترتیب با راندمان 52 و 38 درصد بایکدیگر کونژوگه گردید.عیار igm و igg تام علیه کونژوگه prp-rp6 در روز 28 افزایش معنی داری داشت (05/0p<) . مقادیر igg1 و il-4 نیز در موشهای ایمن شده با کونژوگه فوق ، بترتیب افزایش معنی داری نسبت به igg2a و ifn-? داشت(05/0p<) . پس از چالش ، بقای موشهای ایمن شده با کونژوگه prp-rp6 نیز در مقایسه با سایر گروههای موشی ، افزایش معنی داری نشان داد(05/0p<) . نتایج این مطالعه نشان می دهد که کونژوگه prp-rp6 می تواند پاسخهای مناسب ایمنی اختصاصی علیه هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b را القاء نماید و بیانگر آن است که پاسخهای ایمنی هومورال ، نقش عمده ای در محافظت موشها دربرابر عفونتهای سیستمیک ناشی از هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b ایفاء می نماید.

ابتدا ژن های کد کننده پروتئین های ace و zot از ویبریو کلره سم زا به روش pcr جدا شده و با هضم آنزیمی به وکتور pet-28(a) وارد شدند، سپس به میزبان های کلونینگ و بیانی ترانسفورم شده و سپس بیان شدند. وکتورهای نوترکیب با pcr، هضم دو آنزیمی و تعیین توالی، تائید شدند خالص سازی به روش کروماتوگرافی تمایلی با استفاده از رزین نیکل صورت گرفت و ایمونو ژنیسیته آن با وسترن بلاتینگ و فعالیت بیولوژیک آنها با تست لوپ ایلئال خرگوش مورد تایید قرار گرفت. برای بررسی ایمنی ، پروتئین های نوترکیب به صورت خوراکی به موش های balb/c داده شد. از واکسن دوکورال به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. آخرین رقت igg سرمی و آخرین رقت iga مدفوعی که با پروتئین های نوترکیب تولید شده واکنش مثبت داشتند، برای هر موش تعیین شد. اختلاف سطح igg سرمی و iga مدفوعی ضد zot و ace در گروههای دریافت کننده پروتئین های نوترکیب در ترکیب با هم در مقایسه با گروههای دریافت کننده همان پروتئین ها به تنهایی به طور معنی داری بالاتر بود (p<0.05) . موش های ایمن شده با سویه توکسین زای ویبریو کلره به صورت خوراکی دچار چالش شدند. بررسی درصد کلیرانس گروههای مختلف نشان داد که گروهی که مخلوط دو پروتئین را دریافت کرده بودند نسبت به سایر گروهها به جزء گروه واکسن درصد کلیرانس بالاتری داشتند (41%). نتایج این تحقیق نشان داد که پروتئین ace نوترکیب ، ایمونوژن موثر تری می باشد و پروتئین zot سبب افزایش پاسخ های ایمنی علیه پروتئینی که با آن استفاده می شود می گردد.

هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b (hib) یکی از علل اصلی مننژیت و پنومونی در نوزادان و کودکان در کشورهای در حال توسعه است و هرساله حداقل 3 میلیون مورد بیماری ناشی از hib در سراسر جهان ایجاد می شود. کپسول پلی ساکاریدی hib، پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (prp) فاکتور اصلی بیماریزایی می باشد. کپسول پلی ساکارید کونژوگه شده به پروتئین حامل در پیشگیری از عفونت ها موثر است. میزان شیوع عفونت های ناشی از hib در ایران هنوز ناشناخته است و واکسیناسیون علیه hib تاکنون در برنامه واکسیناسیون معمول کشور قرار نگرفته است. هدف از این مطالعه، دستیابی به یک روش کارآمد و موثر جهت تولید واکسن کونژوگه علیه مننژیت ناشی از هموفیلوس آنفلوانزا است. در این تحقیق، مشتق پلی ساکارید hib (prp) در حضور 1-اتیل-3-(3-دی متیل آمینو پروپیل) کربو دی ایمید (edac) با وزیکول غشاء خارجی (omv) نیسریا مننژیتیدیس گروه b کونژوگه شد. دو روش با واسطه آدیپیک اسید دی هیدرازید (adh) به عنوان فاصله گذار به کاربرده شد. پلی ساکارید به صورت جداگانه با سیانوژن بروماید (cnbr) و edac فعال شد. در روش اول، adh به prp فعال شده با cnbr متصل و مشتق prpcnbr ah تشکیل شد. در روش دوم، adh به prp فعال شده توسط edac متصل و prpedac ah تشکیل شد. دو مشتق ایجاد شده توسطedac به omv کونژوگه شدند و prpcnbr ah-omv، prpedac ah-omv تشکیل شدند. نتایج این تحقیق نشان داد که بازده کونژوگه prpcnbr ah-omv بر حسب پروتئین متصل شده به پلی ساکارید 3/63% و برای prpedac ah-omv 47% و متوسط بازده کونژوگاسیون توسط سیانوژن بروماید فعال کننده بیشتر از فعال کننده دیگری است. با این حال به مطالعه بیشتر در مورد روش های دیگر و مقایسه آنها با یکدیگر برای دستیابی به یک واکسن کونژوگه بسیار موثر، نیاز است. کلید واژه ها: هموفیلوس آنفلوانزا، واکسن، پلی ساکارید، کونژوگه