واژینیت کاندیدیایی یک مشکل ژنیکولوژی مهم در پزشکی می باشد تقریباً 75% از زنان در طول زندگی خود حدالاقل یک بار مبتلا به کاندیدیازیس واژینال می شوند. در 95-85% موارد، عامل اصلی کاندیدیازیس واژینال کاندیدا آلبیکنس می باشد.از ژن های مهم که در بیماری زایی کاندیدا نقش دارند می توان به agglutinin like sequence genesاشاره نمود که پروتئین های موثر در چسبندگی و اتصال کاندیدا آلبیکنس را کد میکنند. mlst یک تکنیک مفید با قدرت افتراق پذیری بالا جهت مطالعه و بررسی اپیدمیولوژی و بررسی ارتباط ژنتیکی در بین پاتوژن های قارچی از طریق تعیین توالی در کل ژنوم میباشد. در این تکنیک به طور معمول شش تا هشت ژن کروموزومی غیر وابسته تعیین توالی میشود و اطلاعاتی راجع به شباهتها و اختلافات بین ایزوله در اختیار ما قرار میدهد.در این مطالعه سویه های کاندیدا آلبیکنس از نمونه های واژنیت کاندیدیایی زنان مراجعه کننده به کلینیک زنان جدا سازی شد، پس از کشت روی محیط سابورو دکستروزآگار و شناسایی قطعی با pcr-rflp، به منظور ارزیابی مقاومت ایزوله ها به فلوکونازول، تست دیسک دیفوژن مطابق استاندارد clsi برای آنها انجام شد.سپس بیان نیمه کمی ژن های als1,3 کاندیدا و میزان تنوع ژنیتیکی سویه ها به ترتیب با تکنیک rt-pcr و mlstمورد ارزیابی قرار گرفت. در این مطالعه 53 ایزوله بالینی کاندیدا آلبیکنس از میان 150 سویه، باروش pcr-rflp شناسایی شد و 50 ایزوله مقاوم و 3 ایزوله حساس جدا سازی شد.نتایج حاصل از بررسی بیان ژن نشان داد که 39 ایزوله (5/73%) هر دوژن als1 وals3 را بیان نمودندو 3 ایزوله یکی از ژن های als را بیان نموده در حالیکه 11 ایزوله (5/20%)هیچ کدام از ژن ها را بیان نکردند و ارتباطی مستقیم بین بیان این ژن ها در ایزوله ها و مقاومت به فلوکونازول وجود داشت.. نتایج حاصل از تعیین توالی dna در سویه های مورد مطالعه نشان داد که شماره آللیک جدیدی در بین ایزوله ها پیدا نشد ولی 15 استرین تایپ جدید شناسایی شد. همچنین بیشترین تعداد تغییرات نوکلئوتیدی(جایگاه پلی مورفیسم) و بیشترین تعداد اسید های آمینه پلی مورفیک مربوط به لوکوس های vps13 و adp1 بوده است. ایزوله هایی حساس به فلوکونازول که فاقد بیان ژن های als1,3 بودند و همچنین ایزوله هایی بیمارانی که دارای بیماری زمینه ای بوده یا هورمون تراپی داشتند ارتباط ژنتیکی نزدیکی با هم داشتند. با توجه به نتایج به دست آمده، ایزوله های مورد بررسی در جمعیت زنان مبتلا به واژینال کاندیدیازیس دارای تنوع ژنتیکی بوده و ارتباط ژنتیکی نزدیکی به هم داشتند که نشان دهنده این است که کلونال کلاسترهای های جدیدی توسط کاندیدا آلبیکنس های عامل واژینیت در ایران در حال شکل گیری است که میتواند در بین بیماران قابل انتقال باشدودر ایجاد واژینیت مزمن و عودکننده مقاوم به فلوکونازول نقش مهمی داشته باشدشیوع بالای عفونت های واژینال کاندیدیایی و در پی آن عودهای مکرر آن و مقاومت های بالای دارویی ضرورت استفاده از روشهای شناسایی ژن های ویرولانس دخیل در آن و تعیین الگویی ژنوتایپی و همچنین تنوع ژنتیکی سویه های کاندیدا آلبیکنس را بیشتر آشکار میسازد.

مقدمه: داروهای قارچی موجود دارای اثرات جانبی متعددی هستند و یا طیف اثر محدودی دارند. مشکلات مذکور بر نیاز به بررسی و یافتن داروهای جدید و موثر ضد قارچی تاکید دارد. ترکیبات طبیعی و غیر شیمیایی از نمونه های جذاب برای این منظور هستند که دارای طیف گسترده ای از فعالیت های بیولوژیکی باشند. کورکومین (curcumin) دارای خواص مختلف داروئی از جمله ضدسرطانی، ضدعفونی و آنتی اکسیدانی می باشد و از طرفی کورکومین دارای منشا گیاهی است و فاقد اثر جانبی مضر حتی در دوزهای بالا برای سلول و بافت های نرمال می باشد. با این حال، این ترکیب ارزشمند داروئی بدلیل حلالیت ضعیف در محیط های آبی، زیست ماندگاری بسیار پایینی را در محیط کشت و بخصوص محیط in vivo نشان می دهد. در سال های اخیر، تلاش های زیادی جهت افزایش حلالیت و ماندگاری زیستی مواد هیدروفوب مثل کورکومین صورت گرفته است. به طور مثال می توان به استفاده ازنانوذرات دندروزومی اشاره کرد هدف از تحقیق حاضر، بررسی اثرات ضد قارچی و آپوپتوتیک نانوکورکومین دندروزومی علیه گونه های کاندیدا در محیط in vitro می باشد. مواد و روش کار: حساسیت گونه های مختلف کاندیدا ( آلبیکنس، تروپیکالیس، کروزئی، پاراپسیلوزیس) به غلظت های مختلف کورکومین و نانوکورکومین به روش براث میکرودیلوشن مورد بررسی قرار گرفت. در ادامه کار غلظتی که بر روی گونه های کاندیدا اثر ممانعت از رشد 50% دارد با غلظت ثابتی از قارچ بمنظور بررسی بیان ژنهای hsp90 و camca1 در محیط تماس داده شدند و با روش rt-pcr مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج: در نانوکورکومین حداقل غلظت مهاری برای تمامی گونه ها mg/ml 0.5 بود به جز کاندیدا کروزئی که این مقدار mg/ml 1 بدست آمد. در کورکومین حداقل غلظت مهاری برای کاندیدا آلبیکنس و کروزئی mg/ml 2 و برای دو گونه دیگر mg/ml 1 بدست آمد. نتایج حاصل از rt-pcr در گونه های کاندیدا آلبیکنس، تروپیکالیس و پاراپسیلوزیس افزایش چشمگیر بیان ژن camca1 را نشان داد، در حالی که در کاندیدا کروزئی تغییر در بیان این ژن مشاهده نشد. بیان ژن hsp90 در دو گونه کاندیدا آلبیکنس وتروپیکالیس کاهش نسبی یافت و در دو گونه دیگر بدون تغییر بود. بحث و نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان دهنده ی اثرات بهتر نانوکورکومین در مهار رشد قارچ های گونه کاندیدا در مقایسه با کورکومین می باشد. این اثر ضد قارچی از طریق القای آپوپتوز در قارچ می باشد و مشاهده بیان ژن های آپوپتوز این مکانیسم را تایید می کند. هر چند که احتمال می رود بیان دیگر ژن های مسئول آپوپتوز در ایجاد خواص ضد قارچی نانوکورکومین دخیل باشند ولی در این مطالعه مشاهده شد که این اثر از طریق افزایش بیان ژن camca1 می باشد. کاهش و عدم تغییر بیان ژن hsp90 بیان گر این می باشد که نانوکورکومین از طریق این ژن اثرات ضد قارچی را اعمال نمی کند. جهت آشکار شدن دیگر مکانیسم های احتمالی ضد قارچی، پیشنهاد می شود ژن های بیشتری مورد بررسی قرار گیرند.

اکثر عفونتهای قارچی در انسان توسط گونه های کاندیدا ایجاد می شود و کاندیدا آلبیکنس شایع ترین گونه ایجاد کننده بیماری می باشد. تایپینگ استرین ها و تعیین گونه برای درک زیست شناسی، همه گیر شناسی و تعیین ساختار جمعیتی آنها ضروری است. طیف گسترده ای از تکنیک های مولکولی برای تایپینگ مولکولی استفاده شده است، از جمله روش های غیر مبتنی برdna و روشهای مبتنی برdna که به نام روش های تایپینگ دقیق خوانده می شوند، زیرا روش های مبتنی بر dna ایجاد داده های واضح و به شدت تکرار پذیر می کنند. از جمله این روش ها می توان به روش تعیین توالی در چند ناحیه ژنیmlst)) اشاره نمود. این تحقیق مطالعه ای مقایسه ای بر روی پروفایل ژنتیکی نمونه های کاندیدا آلبیکنس جدا شده از کاندیدیازیس در انسان و سگ با استفاده از روش تعیین توالی در چند ناحیه ژنیmlst)) است.

اکثر عفونتهای قارچی درانسان توسط گونه های کاندیدا ایجاد میشود. در حیوانات نیز گونه های کاندیدا از مهمترین عوامل ایجاد بیماری های مخاطی و جلدی و در پاره موارد عفونتهای سیستمیک هستند. همچنین کاندیدا آلبیکنس در بین گونه های کاندیدا شایعترین گونه شناخته شده است. تایپینگ استرین ها وتعیین گونه برای درک زیست شناسی، همه گیرشناسی و تعیین ساختار جمعیتی، پیشگیری و درمان آنها ضروری است. در این بین توالی های های نوکلئوتیدی در رونوشت های داخلی توالی های تکراری (rps)، در کاندیدا آلبیکنس altsنامیده می شود. این توالی ها مبنایی برای تعیین تنوع ژنتیکی در کاندیدا آلبیکنس می باشند و بر این اساس کاندیدا آلبیکنس را گروه بندی می کنند. 27 نمونه کاندیدای جدا شده از حیوانات، شامل نمونه های جدا شده از مخاط دهان، پوست و واژن سگ، گربه و اسب، گاو و پرندگان جمع آوری گردید. در ابتدا پس از تشخیص اولیه با روشهای فنوتیپی، به منظور تایید استرین ها و شناسایی قطعی سویه های بالینی مورد مطالعه و جداسازی گونه های کاندیدا آلبیکنس، از یک واکنش pcr-rflp استفاده گردید. پس از استخراج dna، واکنش pcr با استفاده از جفت آغازگرits4-its1 انجام گرفت. سپس تعیین الگوی هضم آنزیمی محصولات pcr با استفاده از آنزیم msp1 انجام شد و محصولات واکنش هضم آنزیمی الکتروفورز شدند و بر اساس الگوی باند تشکیل شده مورد شناسایی قرار گرفتند. در مرحله بعدی واکنش pcr بمنظور تعیین نوع 25s rdna و تکثیر نواحی rpsبا پرایمر های asdcfوpcscr انجام گرفت. پس از انجام واکنش برای بدست آوردن الگوی قطعات تکثیر یافته مورد نظر، محصول pcr بر روی ژل آگارز بررسی گردید. بر اساس تایپینگ 25srdnaچهار ژنوتایپ کاندیدا آلبیکنس بدست آمد که عبارتند از a, b, c, e. در نمونه های مورد مطالعه بیشترین شیوع متعلق به ژنوتایپ a(40.7%) و پس از آن ژنوتایپ e در جایگاه دوم و در نهایت ژنوتیپ های b و c با درصد مشابه در جایگاه سوم قرار داشتند. بر طبق نتایج تایپینگ بر اساس ترکیب روش abc تایپینگ و تکثیر نواحیrps/alt،13 ژنوتایپ کاندیدا آلبیکنس در 27 جدایه مورد مطالعه بدست آمد. در نمونه های مورد مطالعه ژنوتیپ a3(14%) و پس از آن ژنوتایپ های a3/4، b3، c3 و e3/4شایع تر بوده است. بحث و نتیجه گیری برخی ژنوتایپ های جدا شده از حیوان مشخص گردید. نتایج نشان می دهند که جمعیت کاندیدا آلبیکنس جدا شده از حیوانات، جمعیتی هتروژن با تنوع نسبی است و همچنین سیستم ترکیبی25s rdna/rps در تایپینگ مولکولی کاندیدا آلبیکنس کارایی دارد. هیچ ارتباط مشخصی بین ژنوتایپ ها ومیزبان حیوانی بدست نیامد و ژنوتایپ ها متفاوت از آنچه در مطالعات انسانی بدست آمده، نبودند.

در حیوانات گونه های کاندیدا از عوامل ایجاد بیماری های مخاطی و جلدی و در پاره ای موارد عفونت های سیستمیک هستند. همچنین کاندیدا آلبیکنس در بین گونه های کاندیدا شایع ترین گونه شناخته شده است. تاکنون از دیدگاه اپیدمیولوژی مولکولی مطالعات محدودی بر روی استرین های حیوانی انجام شده است و این در حالی است که تایپینگ مولکولی برای تعیین ساختار جمعیتی و اخذ تصمیمات صحیح در پیشگیری و درمان عفونت ها ضروری است. تعیین نوع 25s rdna از روش های مفید در تایپینگ و نیز تشخیص استرین های کاندیدا آلبیکنس بوده است. از طرفی توالی های نوکلئوتیدی تکراری (rps) مبنایی برای تعیین تنوع ژنتیکی در کاندیدا آلبیکنس می باشند و بر این اساس کاندیدا آلبیکنس را گروه بندی می کنند. همچنین برخی از پرایمرهای مورداستفاده قادر به تفکیک بین گونه کاندیدا آلبیکنس از سایر گونه های ازنظر ژنتیکی نزدیک به کاندیدا آلبیکنس نیز می باشد. تکثیر ژن 25s rdna به طور رایجی برای تایپینگ کاندیدا آلبیکنس مورداستفاده است و بر این اساس به 5 گروه اصلی تقسیم می شود. مواد و روش ها در این مطالعه از 27 نمونه کاندیدای جداشده از حیوانات سگ، گربه و اسب، گاو و پرندگان استفاده گردید. استرین های موردبررسی پس از تشخیص فنوتیپی اولیه با یک روش pcr-rflp مورد تائید قرار گرفتند. استخراج dna به روش فیزیکی –شیمیایی انجام گردید و سپس به منظور بررسی کیفیت استخراج، الکتروفورز شدند. در ابتدا قطعه its از rdna قارچ با واکنش pcr و با استفاده از جفت آغازگر its4-its1 تکثیر داده شد. الگوی هضم آنزیمی محصولات pcr با استفاده از آنزیم msp1 موردبررسی قرار گرفت. در مرحله بعد روش های تایپینگ مولکولی مورداستفاده قرار گرفت؛ و بر این اساس تکثیر ناحیه 25s rdna یا abc تایپینگ با پرایمرهای مشخص ca-int استفاده شد که درواقع قسمت قابل تغییر و جابجا شدنی از ناحیه اینترون rdna 25s را اندازه می گیرد. نتایج در مطالعه حاضر ژنوتایپ a با 40.7% رایج ترین ژنوتایپ به دست آمده بود و پس ازآن ژنوتایپ های e 22.5% و سپس b و c هرکدام 18.5% شیوع داشتند. از نکات مهم در نتایج تحقیق حاضر جداسازی تیپ e است. این ژنوتایپ یک گروه جدید در گروه بندی کاندیدا آلبیکنس با استفاده از تعیین تایپ 25s rdna است. از سوی دیگر با استفاده از روش rep-pcr با پرایمر as-i که قسمت های داخلی از نواحی alt مورد هدف قرار می گیرد، از 27 استرین موردبررسی 17 الگوی منحصربه فرد یا 17 ژنوتایپ به دست آمد. این الگوها بر اساس باندهای تشکیل شده در الکتروفورز محصول pcr مشخص گردید. ژنوتایپ های as1 و as2 از سایر ژنوتایپ ها رایج تر بودند. سایر ژنوتایپ ها از فراوانی مشابهی برخوردار بوده اند. بحث و نتیجه گیری نتایج حاصل از abc تایپینگ با نتایج به دست آمده از روش rep-pcr تطبیق داده شد و هم تراز گردید تا به یک الگوی ژنوتایپی با جزئیات بیشتر برسد. نهایتاً از 27 استرین موردبررسی 22 ژنوتایپ حاصل گردید که نشان می دهد این روش دارای قدرت تفکیک قابل توجهی برای بررسی اختلافات درون گونه ای است که از جنبه های مختلف حائز اهمیت است. جداسازی 22 ژنوتایپ مختلف از این نظر جالب توجه است که در حیوانات کمتر چنین نتایجی به دست آمده است. نتایج تحقیق حاضر، تنوع ژنتیکی در جمعیت کاندیدای جداشده از حیوانات را نشان می دهد و همانند مطالعات صورت گرفته در انسان، جمعیت هتروژن در کاندیدای جداشده از حیوانات نیز وجود دارد.