در این تحقیق به منظور دستیابی به برنج تراریخته حاوی ژن کولین اکسیداز و فاقد ژن نشانگر انتخابی، پلاسمیدهای بیانی حاوی ژن "کولین اکسیداز" pabrii-chl (حاوی پپتید راهنما برای تظاهر در کلروپلاست) و pabrii-cyt (بدون پپتید راهنما برای تظاهر در سیتوپلاست) ساخته شد و سپس با استفاده از روش تراریزش توأم، به همراه پلاسمید ptra132 حامل ژن مقاومت به هیگرومایسین (hph)، به کالوس های جنین زایی که از ناحیه اسکوتلوم بذور رسیده رقم هاشمی منشا گرفته و دارای توان تقسیم سلولی و باززای بالایی بودند، به روش ریزپرتابه منتقل شدند. سلول های تراریخته احتمالی از بافت های بمباران شده پس از سه دوره گزینش در محیط کالوس زایn6 که غلظت هیگرومایسین ب مصرفی در آن از واکشت اول تا آخر به تدریج افزایش یافته و از 60 به 80 میلی‎گرم در لیتر می رسید، گزینش شدند. نهایتاً کالوس های مقاوم به هیگرومایسین، در محیط باززایی ms غلظت هیگرومایسین مصرفی از واکشت اول تا آخر به تدریج از 80 به 60 کاهش می یافت، باززا شدند. بیست و هشت گیاه برنج تراریخته که حامل هر دو ژن coda و ژن نشانگر بودند بدست آمد و ادغام هر دو ژن در این گیاهان برنج به روش آنالیز زنجیره ای پلیمراز تائید شد. سپس آنالیز لکه گذلری نقطه ای و لکه گذلری سادرن برای ده گیاه تراریخته احتمالی مورد استفاده قرار گرفت. نتایج آزمایشات ثابت کرد که در گیاهان تراریخته احتمالی حداقل یک نسخه از ژن کولین‎اکسیداز در ژنوم گیاه ادغام شده است. فراوانی قابل قبول گیاهان تراریخته حاوی هر دو ژن انتقال داده شده به روش تراریزش همزمان در این تحقیق نشان داد که روش مورد استفاده یک روش تکرار پذیر و نسبتاً کارا برای انتقال پایدار ژن های مفید و تولید گیاهان تراریخته عاری از ژن انتخابگر در مقیاس وسیع می باشد.

به منظور دستیابی به برنج تراریخته مقاوم به آفات که فاقد ژن نشانگر انتخابی باشد، پلاسمید pubc حامل ژن cry1a(c) و فاقد ژن مارکر انتخابی به همراه پلاسمید ptra132 دارای ژن مقاومت به هیگرومایسین به عنوان نشانگر انتخابی به منظور بهره گیری از روش تراریزش توأم ( co-transformation) در گیاه استفاده شدند. پلاسمیدها به کالوس های جنین زایی که از بذور رسیده منشا گرفته و دارای توان تقسیم سلولی و باززایی بالایی بودند، به روش ریزپرتابه وارد شدند. سلول های تراریخته احتمالی از بافت های بمباران شده پس از 3 دوره گزینش در محیط کالوس زاییn6 حاوی 50 میلی گرم در لیتر هیگرومایسین b شناسایی شدند. نهایتاً کالوس های مقاوم به هیگرومایسین در محیط باززایی ms حاوی50 میلی گرم در لیتر هیگرومایسین b باززا شدند. در نهایت گیاهان تراریخته احتمالی حاصل با آنالیز pcr مورد بررسی قرار گرفتند. این آنالیز نشان داد که سه گیاه تراریخته احتمالی حامل هردو ژن cry1a(c) و ژن مارکر( (hphبودند. آنالیزهای مولکولی سادرن و rt-pcr برای اثبات قطعی تراریزش و تشخیص تعداد محل های ادخال لازم است.

به منظور بررسی وضعیت تنش شوری در چهار رقم برنج ایرانی به نامهای زاینده رود طارم مولایی نعمت و چرام 2 و انتخاب رقم برای انتقال ژن به گونه ای که دارای تحمل تنش شوری مناسبی باشند بدون آنکه از تنظیم اسمزی با مواد اسمولیت آلی استفاده نمایند، پژوهشی در پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی و دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی اصفهان انجام شد. در این پژوهش ابتدا با آزمایش های متعدد وضعیت تحمل شوری ارقام مورد مطالعه در محیط درون شیشه ای مورد بررسی قرار گرفت. در این آزمایشها که با کشت بذر ارقام مورد مطالعه در محیط کشت ms محتوی مقادیر مختلفی از nac1 شامل صفر 80604020 و 100 میلی مول انجام شد واکنش کالوسزایی و باززایی ارقام مورد مطالعه و نیز محتوای یونهای سدیم پتاسیم کلسیم قندها پرولین و پروتئین در کل سلولها و نیز در شیره سلولی حاصل از کالوس مورد اندازه گیری و تجزیه و تحلیل قرار گرفت. در مجموع این مطالعات نشان دادند که ارقام زاینده رود و طارم مولایی دارایی بهترین تحمل شوری در محیط دورن شیشه ای هستند و در عین حال کمتر از دو رقم دیگر از اسمولیتهای آلی برای تنظیم اسمزی استفاده می نمایند و علاوه بر این کالوس زایی و باززایی خوبی نیز دارند. این نتایج بخ این معنی بودند که این دو رقم کاندیداهای مناسبی برای انتقال ژن به شمار می روند.

در این پژوهش به منظور دستیابی به برنج تراریخته فاقد ژن نشانگر انتخابی ، ساخت پلاسمید بیانیpabrii-mtld حامل ژن مانیتول-1-فسفات دهیدروژناز (mtld) و فاقد ژن مارکر انتخابی در گیاه با پلاسمیدهایpcabmldii و ptra132 برای بهره گیری از آن در روش تراریزش توام( ( co-transformation با پلاسمید دارای ژن مقاومت به هیگرومایسین به عنوان نشانگر انتخابی در گیاه انجام شد. در روش تراریزش توام ژن مورد نظر و ژن نشانگر بر روی ناقل های پلاسمیدی متفاوتی واقع شده و به عنوان قطعات ناپیوسته به ژنوم معرفی می شوند. ژن مورد نظر و ژن نشانگر در طی تفکیک و نوترکیبی که در طول تولید مثل جنسی رخ می دهد از هم جدا می شوند .برش آنزیمی پلاسمید pcabmtldii با آنزیم های برشی ecori و bamhiمنجر به ایجاد قطعه 8/1 کیلوبازی گردید که شامل تمام ناحیه کدکننده ژن ساختاری mtld و توالی ترمیناتوری نوپالین سنتتاز و بدون توالی پیشبر بود. در ادامه، این قطعه 8/1کیلو بازی در جایگاه ecori وbamhi پلاسمید تغییریافته ptra132 وارد شد که در آن ناحیه کدکننده هیگرومایسین فسفوترانسفراز و توالی ترمیناتوری نوپالین سنتتاز حذف شده بود. در پلاسمید نوترکیب حاصل موسوم به pabrii-mtld، ژن mtld که با ساخت و تجمع مانیتول در سیتوپلاسم سلول باعث افزایش تحمل تنش های شوری و خشکی می گردد، توسط پیشبر 35s ویروس موزائیک کلم موجود در پلاسمید ptra132 هدایت می شود . صحت ساخت ناقل های پلاسمیدی نوترکیب حاوی ژن مانیتول- 1- فسفات دهیدروژناژ با استفاده از آنالیز هضم dna و با استفاد از آنزیم های برشی bamhi ، ecori ،hindiii وpsti ونیز آنالیز واکنش زنجیره ای پلیمراز مورد تأیید قرار گرفت. درادامه، پلاسمیدهای pabrimtld و ptra132 (حامل ژن hph) به کالوس های جنین زایی که از بذور رسیده منشا گرفته ودارای توان تقسیم سلولی وباززای بالایی بودند ، به روش ریزپرتابه معرفی شدند. سلول های تراریخته احتمالی از بافت های بمباران شده پس از 3 دوره گزینش(به فاصله 21-14 روز) در محیط کالوس زای n6 حاوی 50 میلی گرم در لیتر هیگرومایسین b شناسایی شدند. نهایتا کالوس های مقاوم به هیگرومایسین در محیط باززای ms حاوی50 میلی گرم در لیتر هیگرومایسین b باززا شدند. در این پژوهش چند گیاه برنج تراریخته که حامل هردو ژن mtld و ژن مارکر( (hphبودند به دست آمد و ادغام هردو ژن در این گیاهان برنج به روش آنالیز زنجیره ای پلیمراز تأیید شد.