تاثیر بایو بر کشت کندروژنیک سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان موش ومطالعه بیان ژن های مسیر wnt چکیده سلولهای بنیادی مزانشیمی، سلولهای پرتوانی هستند که پتانسیل تمایز به چندین رده را دارند. یکی از ظرفیت های تمایزی این سلول ها، تمایز به غضروف است. محققین امیدوارند که در آینده ای نزدیک با بهره گیری از این سلول ها بتوانند ضایعات وسیع غضروفی را بازسازی نمایند. به منظور بازسازی بافت غضروفی یک استراتژی این است که ابتدا سلول بنیادی مزانشیمی به غضروف تمایز داده شود سپس به ناحیه تخریب غضروف پیوند شود. به همین دلیل ، مطالعه تمایز کندروژنیک سلول در محیط کشت با هدف بهینه سازی تمایز و مطالعه مکانیسم های مولکولی آن از اهمیت به سزایی بر خوردار است. مطالعه حاضر در این راستا طراحی و اجراء شده است. هدف مطالعه حاضر بررسی تاثیر bio بر کشت کندروژنیک سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان موش است. در تحقیق حاضر سلول های بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان موش nmri جدا سازی و با انجام سه پاساژ متوالی تکثیر شد. ماهیت بنیادی مزانشیمی سلول ها با روش فلوسایتومتری و ارزیابی پتانسیل تمایزی بررسی شد. سپس تاثیر بایو بر کشت تکثیری سلول های بنیادی مزانشیمی تعیین گردید. سلول های بنیادی مزانشیمی پاساژ 3 به صورت میکرومس کشت گردید و با غلظت های مختلف بایو تیمار شد و میزان تمایز به غضروف آنها با روش real time pcrبرای ژن های آگریکان و کلاژن 2 وsox9 بررسی شد. با توجه به اینکه تیمار با بایو سبب تقویت تمایز به غضروف شده بود، در مرحله بعدی برای بررسی مکانیسم این تاثیرات، بیان برخی ژن های مسیر سیگنالدهی wnt شامل بتا کتنین، tcf در کشت کندروژنیک تیمار شده با غلظت های بایو با روشreal time pcr بررسی شد. در مطالعه حاضر برای درک بهتر تمایز کندروژنیک، بیان ژنی در زمان های مختلف دوره کشت شامل روز های 5، 14 و 21 بررسی شد. مطابق با نتایج بدست آمده سلول های بنیادی مزانشیمی در تمام دوره کشت به صورت شبه فیبروبلاستی ظاهر شدند. این سلول ها قادر بودند به سه رده استخوانی، غضروفی و چربی تمایز یابند و در صد بسیار کمی از آنها، مارکر های اندوتلیالی و خونسازی بیان کردند و مارکر های مزانشیمی در اکثریت آنها بیان شد. سلول های مورد مطالعه در غلظت1/0 بایو بیشترین تکثیر را ازخود نشان دادند. بر اساس یافته های تمایز به غضروف، کشت کندروژنیک سلول های بنیادی مزانشیمی در گروه های تیمار شده با غلظتهای 01/0و05/0بیش از گروه کنترل ( تیمار نشده) بود زیرا در این گروه ها ژن های کلاژن 2 و آگریکان و فاکتور نسخه برداری sox9 بطور معنی داری بیش از گروه کنترل بیان شده بود. نتایج آنالیز مسیر wnt حاکی از این بود که تیمار با بایو سبب بیش بیانی ژن های بتا کتنین و tcf در مراحل اولیه کندروژنزیس این مسیر شده است. نکته قابل توجه این بود که peak بیان ژن های اختصاصی غضروف مورد بررسی در روز 14 کشت بود و در روز 5 و 21 بیان ژنی پایین تر بود در حالیکه در گروه کنترل peak بیان ژنی در روز آخر کشت ( روز 21) قرار داشت. این نتایج نشان دهنده این است که تیمار با بایو سبب سرعت بخشیدن به تمایز شده بود. روی هم رفته می توان گفت که افزودن بایو به محیط کندروژنیک سبب بهبود تمایز به غضروف سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان موش می شود. این اثر به صورت تمایز زود هنگام تظاهر می کند. به نظر می رسد تاثیرات کندروژنیک بایو از طریق مسیر سیگنالدهی wnt انجام می شود.

خلاصه بیماری اسکلرودرمی یک بیماری با واسطه سیستم ایمنی است که در آن تخریب ایجاد شده در دیواره عروق باعث مهاجرت سلول های ایمنی به موضع شده و متعاقب آن با ورود سلول های فیبروبلاستی و وجود عوامل فیبروزه، پوست در ناحیه درگیر فیبروزه شده و گرفتاری عروق در دراز مدت می تواند منجر به قطع عضو گردد و در صورت درگیری ریه حتی موجب مرگ بیمار شود. استفاده از داروهای سرکوب کننده سیستم ایمنی و یا روش های ایمنی درمانی مانند پیوند مغز استخوان هرچند می توانند تا اندازه زیادی جلوی پیشرفت بیماری را بگیرند اما برای ترمیم کامل در این بیماران نیاز است که سیستم عروقی به خصوص در سطح مویرگی نیز ترمیم گردد. استفاده از سلول هایی مانند سلول های مزانشیمی و یا سلول های پیش ساز عروقی خود بیمار چندان کارآمد به نظر نمی رسند و لازم است سلول های اندوتلیال با سلول هایی از منشا غیرخودی و یا سلول های مشتق از سلول های بنیادی جایگزین شود. با توجه به این که تمایز این سلول ها از سلول های پرتوان القایی می تواند ضمن مرتفع نمودن مشکلات اخلاقی، مشکل دفع پیوند را نیز نداشته باشد، لذا در این مطالعه ابتدا کارایی تمایز سلول های پرتوان القایی انسانی مورد ارزیابی قرار گرفت و سپس اثر این سلول ها در بهبود علایم بیماری در مدل حیوانی مورد ارزیابی قرار گرفت و در نهایت اثر این پیوند با مطالعه لانه گزینی سلول ها در پوست ارزیابی شد. نتایج تمایز سلول های پرتوان القایی نشان می هد که این سلول ها همانند سلول های بنیادی جنینی قادرند در یک پروتکل دو مرحله ای تمایز، به صورت موثری به سلول های اندوتلیالی تمایز یابند. آزمایشات انجام شده برای بررسی عملکرد سلول ها نشان می دهد که سلول های تمایز یافته در آزمایشگاه قادرند کلنی ایجاد کرده و جذب مناسبی را در تست dii-ac-ldl داشته باشند. برای ارزیابی اثر پیوند این سلول ها در مدل حیوانی از مدل ایجاد شده توسط داروی بلئومایسین استفاده شد. آزمون های انجام شده نشان می دهد این مدل به طور موثری باعث تخریب عروق و فیبروز در پوست محل تزریق می گردد. از آنجایی که برای تزریق سلول های اندوتلیال با منشا انسانی مجبور بودیم از داروی سرکوب کننده ایمنی استفاده نماییم، تفاوتی را از نظر علایم بیماری بین گروه دریافت کننده سلول به همراه داروی سرکوب کننده ایمنی و گروه دریافت کننده دارو به تنهایی مشاهده نکردیم. با این حال ارزیابی های مطالعه نشان می دهد که سلول های تزریق شده به طور موثری در موضع تزریق لانه گزینی کرده و به سلول های اندوتلیالی تمایز یافته اند و در پیگیری 1 ماه بعد از تزریق به خوبی قادر به تقسیم بودند. بنابراین به نظر می رسد این روش درمانی می تواند در تشکیل عروق در این بیماران موثر باشند هرچند که اثبات این موضوع نیاز به مدل هایی با منشا ژنتیکی داشته و باید توان سلول های پرتوان القایی به دست آمده از بیماران مبتلا به اسکلرودرمی نیز مورد ارزیابی قرار گیرد.

هدف از این تحقیق بررسی امکان تولید سلولهای زایا (gcs) از سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان (bm-mscs) در محیط آزمایشگاه بوده است. در این مطالعه سعی شده است تا به کمک برخی مکمل ها bm-mscهای قوچ را به gcهای نر تمایز داد. مکمل ها بر اساس اطلاعات موجود در منابع دربار? نقش آنها در تمایز سلولهای زایا (gcs) در بدن پستانداران، انتخاب شدند. ابتدا bm-mscها از نمون? مغز استخوان قوچ جدا شده و پس از تائید بنیادی مزانشیمی بودن، در گروه های جداگانه به مدت 21 روز تحت تیمار با رتینوئیک اسید (ra در سه غلظت 1، 5 و 10 میکرومولار)، tgfb1 ( ng/ml 10)، bmp4 (ng/ml 100)، bmp8b (ng/ml 100) و سولفات روی (znso 4 14/0 میکرومولار) برای القای تمایز به gcها قرار گرفتند و در انتهای دور? تیمار از نظر بیان ویژگی های gcها مورد ارزیابی قرار گرفته و با گروه کنترل بدون تیمار مقایسه شدند. ارزیابی ها شامل بررسی های ریخت شناسی، ارزیابی بیان ژنهای vasa، itgb1، piwil2 ، oct4 و dazl به کمک rt-pcr و real-time rt-pcr ، ارزیابی بیان مارکر اختصاصی gcها، pgp 9.5 به کمک ایمونوسیتوشیمی و همچنین بررسی تغییرات فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز، بودند. بررسی نتایج بدست آمده نشان داد که هر سه غلظت ra قادر به القاء تمایز به gcها در bm-mscها هستند و غلظت 10 میکرومولار موثرتر از دو غلظت دیگر است. tgfb1پس از 21 روز تیمار، به خوبی می تواند سلولهایی (2/6%) با ویژگی های مشابه با gcها در محیط کشت به وجود بیاورد. bmp4 و bmp8b عملکرد تقریباً ضعیفی برای القاء تمایز در bm-mscها از خود نشان دادند و درصد سلولهای با ویژگی های مشابه gcها در پایان 21 روز تیمار به ترتیب 37/0% و 51/0% بود. در مورد گروه تیمار شده با znso 4 ، بررسی ها نشان داد که یون روی قادر به ایجاد تمایز در bm-mscها نیست اما یک اثر تنظیمی بر بیان برخی از ژنهای اختصاصی gcها دارد. در کل، از این نتایج می توان اینگونه استنتاج کرد که هرچند مطالعات بیشتری برای دستیابی به تولید gcها در آزمایشگاه ضروری است اما به نظر می رسد که این امر در آینده قابل دستیابی است.

مقدمه: سلول های بنیادی مزانشیمی(msc) به عنوان منبع خوبی از سلول های بنیادی برای ترمیم بافت های آسیب دیده در سلول درمانی هستند، زیرا ایمونوژنیک نیستند، دارای توانایی خودنوزایی بوده و پتانسیل تمایز به انواعی از رده های سلولی را دارند. سلول های بنیادی مزانشیمی جداشده از مغزاستخوان به عنوان کاندید اصلی در کارهای درمانی می باشند، اما فرآیند دردناک نمونه گیری و کاهش پتانسیل تکثیر و تمایز سلول ها با افزایش سن، استفاده از آن ها را در کارهای درمانی محدود می کند. اخیراً سلول های بنیادی مزانشیمی جداشده از بافت های جنینی از جمله کوریون به عنوان منبع مناسبی از سلول ها معرفی شده اند، زیرا نسبت به سلولهای بنیادی مزانشیمی جداشده از بافت های بالغ از جمله مغزاستخوان، می توانند به میزان بیشتری تکثیر شوند. در مطالعه ی حاضر به مقایسه دو منبع سلولی جداشده از کوریون و مغزاستخوان پرداختیم و در این راستا تغییرات هیستونی در سطح کلی و در ناحیه پروموتری ژن های مارکر stemnes شامل oct4, sox2، nanog و همچنین ژن nestin به عنوان مارکر سلول های پیش ساز عصبی، مورد بررسی قرار گرفت. روش کار: سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و کوریون انسانی جداسازی و کشت داده شد. سلول های هر دو بافت با انجام چندین پاساژ تکثیر شد و سلول های حاصل از پاساژ سوم، از لحاظ بیان برخی مارکر های سطحی و توان تمایز به رده های مزودرمی مورد بررسی قرار گرفتند. در ادامه، میزان استیلاسیون و متیلاسیون لیزین 9 هیستون3 (h3k9) به صورت کلی و با روش نوکلئوزوم الایزا در msc های جداشده از کوریون و مغزاستخوان مقایسه شد. سپس الگوی بیان ژن و سطح استیلاسیون و متیلاسیون h3k9 در ناحیه پروموتری ژن های مارکر و با روش chip real time pcr در دو منبع سلولی ارزیابی شد. نتایج: سلول های بنیادی مزانشیمی هر دو منبع سلولی ظاهر شبه فیبروبلاستی داشتند. آنالیزهای فلوسایتومتری نشان داد هر دو منبع سلولی مارکرهای رده ی مزانشیمی شامل cd73، cd90، cd44 و cd105 را بیان کردند ولی مارکرهای سلول های رده خونساز نظیرcd34, cd45 و cd11b را بیان نکردند. همچنین هر دو منبع سلولی توانستند به رده های استخوانی، غضروفی و چربی تمایز یابند. نتایج نشان داد، سطح استیلاسیون h3k9 به صورت کلی در سلول های بنیادی مزانشیمی جداشده از کوریون نسبت به مغزاستخوان بالاتر می باشد. همچنین، میزان بیان ژن های nanog, sox2 و nestin در mscهای جداشده از کوریون به صورت معناداری بالاتر از msc های جداشده از مغزاستخوان بود. به علاوه، یافته های حاصل از تکنیکreal time pcr chip در ناحیه پروموتری ژن های نام برده، میزان بیان بالاتر این ژن ها را تایید کرد. نتیجه گیری: با وجود اینکه msc های جداشده از دو منبع سلولی کوریون و مغزاستخوان از لحاظ مورفولوژی و بیان رسپتورهای سطحی دارای ویژگی های یکسانی می باشند، اما تفاوت چشمگیری در سطح بیان ژن و الگوی اپی ژنتیکی آن ها مشاهده شد. طبق نتایج به دست آمده، msc های جداشده از کوریون دارای قدرت تکثیر بالاتری نسبت به msc های جداشده از مغزاستخوان می باشند. همچنین پیش بینی می شود، پتانسیل تمایز به عصب در msc های جداشده از کوریون بالاتر از این میزان در msc های جداشده از مغز استخوان باشد. بنابراین می توان از msc های جداشده از کوریون به عنوان منبع مناسبی از سلول ها در کارهای درمانی استفاده کرد. واژه های کلیدی: سلول های بنیادی مزانشیمی، کوریون، مغزاستخوان، اپی ژنتیک

در این پژوهش، کارایی الیاف الکتروریسی شده‏ی پلی‏کاپرولاکتون همراه با ذرات کیتوسان بارگذاری‏شده با دگزامتازون برای انتقال دگزامتازون به جای تزریق مستقیم آن در محیط کشت تمایزی مطالعه شد. از میکروذرات کیتوسان تهیه شده به روش خشک کردن پاششی در ادامه پژوهش استفاده شد. میکروذرات کیتوسان پس از بارگذاری دارو همراه با پلیمر پلی‏کاپرولاکتون الکتروریسی شدند. مطالعه میزان آب دوستی داربست‏ها نشان داد که حضور کیتوسان درون الیاف، زاویه تماس را کاهش می‏دهد. مقایسه رهایش دارو از الیاف پلی‏کاپرولاکتون و الیاف پلی کاپرولاکتون حاوی ذرات کیتوسان در دو نسبت جرمی دارو در یک دوره‏‏ی 14 روزه انجام شد که حذف رهایش انفجاری دگزامتازون را در الیاف همراه با میکروذرات نشان داد. کشت سلول‏های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان روی پنج گروه داربست مورد بررسی، نشان‏دهنده افزایش فعالیت آلکالین فسفاتازی در روزهای 7 و 14 در الیاف همراه با میکروذرات حاوی دگزامتازون بود. در مجموع نتایج این پژوهش نشان می‏دهد که الیاف ترکیبی پلی‏کاپرولاکتون و ذرات کیتوسان حاوی دگزامتازون می‏تواند به عنوان یک داربست زیست‏فعال برای مهندسی بافت استخوان استفاده شود.

چکیده ندارد.