گیاهان خانواده papaveraceae به واسطه تولید آلکالوئیدهای با ارزش و پرمصرف از جمله مورفین، کدئین، تبائین، نوسکاپین، پاپاورین و سنگوئینارین دارای اهمیت تجاری خاصی در صنایع دارویی می باشند. ژن l – تیروزین دکربوکسیلاز (tydc)، نقطه شروع مسیر سنتز آلکالوئیدهای گروه مورفین در خشخاش می باشد و واکنشی را کاتالیز می کند که منجر به تولید تیرامین از تیروزین می شود و بعد از حداقل 17 مرحله آنزیمی دیگر، حلقه بنزنی با تغییرات بعدی به کدئین و مورفین تبدیل می شود. هدف از این تحقیق، بررسی اثر تشدید بیان ژن tydc در تجمع آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولین و در پی آن، افزایش سنتز آلکالوئیدهای گروه مورفین می باشد. برای رسیدن به این هدف سازه نوترکیبpbi121-tk با کلون سازی ژن تیروزین دکربوکسیلاز حاوی توالی کوزاک در محل ژن gusدر پلاسمید pbi121 تحت پیشبر camv35s و پایان بر nos ساخته شد و نتایج کلونینگ این ژن با استفاده از روشهای مختلف مولکولی، هضم آنزیمی، pcr و آزمون هیستوشیمیایی gus تایید گردید. نتایج hplc گیاهان ترنسژنیک به روش اگرواینفیلتراسیون نشان داد که مقدار آلکالوئیدهای موجود در این گیاهان به مراتب بیشتر از گیاهان غیر ترنسژنیک بود.

تنش شوری تأثیر مخرب روی محصولات کشاورزی دارد. یکی از مکانیس های ممکن در تحمل به تنش شوری،ذخیره سدیم در واکویل می باشد. تجمع یون در واکویل دو فایده دارد:1)غلظت سمی سدیم در واکویل کاهش می یابد و 2)پتانسیل اسمزی واکویل افزایش می یابد و باعث افزایش فشار اسمزی و در نتیجه حفظ جذب آب توسط سلولهای گیاهی و نتیجتاً حفظ تورگر بافت می شود. در مطالعه حاضر دو زنوتیپ سیب زمینی، jubily zhokovo و skroplodny، توسط زن آنتی پورتر hvnhx2 از گیاه جو تحت پروموتور camv35s با واسطه گری اگروباکتریوم تراریخت شدند. 30 گیاه مستقل تراریخت بدست آمد. واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) و ساترن بلاتینگ حضور زن hvnhx2 و الحاق آن به زنوم گیاهان تراریخت را تأیید نمودند. نتایج real-time rt-pcr نشان داد که سطح بیان زن در گیاهان تراریخت متفاوت بود. بیان زن hvnhx2 در گیاهان تراریخت باعث افزایش معنی داری در تحمل به نمک nacl در یک زنوتیپ گردید. تحت تنش شوری گیاهان متحمل ریشه های بلندتر،محتوای ماده خشک بیشتر و توسعه سلولی کمتری در مقایسه با گیاهان غیرتراریخت داشتند. جالب است که تحمل به شوری در گیاهان رشد کرده در شرایط in vitro همراه با افزایش غلظت سدیم نبود. در عوض غلظت پتاسیم در ریشه گیاهان تراریخت بیشتر بود. بنابراین به نظر می رسد که تجمع پتاسیم و افزایش انتقال آن در تحمل به شوری گیاهان ضروری است.

دیابت بیماری است که بدن نمی تواند انسولین تولید کند یا به درستی از آن استفاده کند. اگرچه انسولین عموماً در باکتری یا مخمر برای استفاده تجاری تولید می شود اما در حال حاضر تحقیقات بر روی روش های دیگر تولید از جمله تولید پروتئین انسولین در گیاهان متمرکز شده است. گیاه کاهو (lactuca sativa l.) یک گیاه مناسب برای تولید پروتئین های نوترکیب و بویژه واکسن های خوراکی می باشد. این گیاه یکی از عمده ترین سبزی های برگی بوده و متعلق به خانواده asteraceae می باشد. در این مطالعه با استفاده از آغازگرهای مخصوص و روش pcr، ژن پروانسولین انسانی تکثیر شد. ژن تکثیر شده از روی ژل جداسازی و با آنزیم های خاص برش داده شد و در ناقل pcambia1304 همسانه سازی گردید. ناقل ساخته شده با روش های مختلف تأیید گردید. مهندسی ژنتیک کاهو به یک روش موثر و قابل اتکا کشت بافت نیاز دارد. برای این منظور، عوامل مختلف موثر بر باززایی کوتیلدون های کاهو از قبیل ژنوتیپ، سن ریزنمونه و غلظت های مختلف تنظیم کننده های رشد بررسی شدند. بالاترین میزان کالوس زایی در غلظت 7/2 میکرو مولار naa و 4/4 میکرو مولار ba بدست آمد. بالاترین میزان نوساقه زایی در غلظت های کم ba اتفاق افتاد. شرایط بهینه ای برای تراریخته سازی از هم کشتی نمونه های کوتیلدونی با اگروباکتریوم در محیط ms بدون هیچ گونه هورمون رشدی به مدت 48 ساعت بدست آمد. بعد از مرحله هم کشتی، نمونه های کوتیلدونی روی محیط کشت انتخابگر حاوی هیگرومایسین و سفوتاکسیم کشت شدند. بعد از انتقال کوتیلدون ها به محیط انتخابگر و پس از چند بار واکشتی ریزنمونه ها، گیاهان کاهوی تراریخت بدست آمدند. با استفاده از آنالیز pcr و southern blotting، حضور قطعه t-dna حاوی ژن پروانسولین انسانی در ژنوم کاهو اثبات گردید و همچنین انجام rt-pcr نسخه برداری از روی این ژن را تأیید نمود. آنالیز گیاهان تراریخته در سطح پروتئین با بهره گیری از آزمون های elisa و ایمونوبلاتینگ وجود پروتئین در گیاهان تراریخت را تأیید کردند. در ادامه این پروژه انتقال ژن پروانسولین به هسته گیاه توتون و کلروپلاست آن انجام شده است که مراحل آنالیز گیاهان توتون تراریخت شده هسته ای و کلروپلاستی در حال انجام است.

کشاورزی مولکولی یکی از دستاوردهای ارزشمند مهندسی ژنتیک در تولید پروتئین های نوترکیب بویژه واکسن ها، آنتی بادی ها ، هورمون ها و ... در گیاهان است. ویژگی های خاص گیاهان به عنوان بیوراکتور آنها را از سایر سیستم های تولیدی متمایز می نماید. پروتئین داروئی tpa tissue plasminogen activator) (به طور اختصاصی و نسبتا قوی به لخته های خونی متصل شده و ترجیحا پلاسمینوژن به دام افتاده در داخل لخته ها را فعال و لخته خونی را از بین می برد. در این تحقیق با استفاده از پپتیدها ی راهنما و الحاقی سعی در افزایش کیفیت و نگهداری پروتیئن نوترکیب شده است. بدین منظور از پپتید های راهنمای kdel extensin, sp-zera, zera, و همچنین پپتیدهای الحاقی ltb cpp, trombin site, his-tag, استفاده شد. این پپتیدهای راهنما و الحاقی بر حسب وظیفه به انتهایc - ترمینال یا n – ترمینال اضافه شد و همچنین یک توالی افزایش دهنده ی بیانی (kozak) به ابتدای ژن اضافه شد. ناقل اصلی برای تمام سازهها pbi121 بود که به عنوان یک ناقل دوگانه در انتقال ژن به گیاهان استفاده می شود. سازه های تهیه شده pkt, pext,) (pspt, pzt ابتدا به اگروباکتریوم سویه lba4404 معرفی گردیدند و به صورت انتقال پایدار و دائمی به توتون منتقل شد. گیاهان تراریخت روی محیط انتخابگر (حاوی کانامایسین mg.l-1 100 ) انتخاب شدند سپس جوانه های تراریخت ریشه دار شده ابتدا به پرلیت و سپس به خاک منتقل شدند. ارزیابی گیاهان تراریخت با استفاده از روش های مختلف مانند واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr)، سادرن بلاتrt-pcr، sds-page، الایزا و زیموگرافی انجام شد. این آزمون ها برای تعیین حضور، تعیین تعداد نسخه، انجام رونویسی، بررسی احتمالی حضور ژن، بیان و مقدار پروتیئن تولیدی و فعالیت پروتئین انجام شد.

چکیده تراریختی کلروپلاست دارای پتانسیل مطلوبی برای بیان سطوح بالا و مقرون به صرفه پروتئین های نوترکیب در سلو ل های گیاهی است. باکتری اشریشاکلی سویه o157:h7 یکی از پاتوژن های مهم جانوری است که در انسان باعث بیماری اسهال خونی و در برخی از موارد منجر به بیماری مرگبار سندروم خونریزی در ادرار می-شود. شیوع این بیماری در سال های اخیر باعث افزایش تلاش هایی برای تولیدآنتی ژن های ایمنی زا مقرون به صرفه جهت مقابله با این باکتری شده است. پروتئین های espa، intimin وtir از فاکتور های بیماری زایی مهمی هستند که توسط مکان ژنی lee اشریشاکلی سویه o157:h7 بیان می شوند. در این مطالعه، ما فرض کردیم بیان سطوح بالایی از این پروتئین ها به صورت ترکیبی در کلروپلاست گیاه و کاربرد گیاهان ترانس-پلاستوم به عنوان واکسن خوراکی، می تواند سیستم ایمنی را تحریک و از اتصال باکتری به سلول روده و بیماری زایی آن ممانعت نماید. بنابراین پروتئین کایمریک espa: intimin: tir (eit) که کدون های آن برای میزبان پروکاریوتیک بهینه شده بود، در کلروپلاست از طریق تراریختی کلروپلاست بیان شد. گیاهان ترانس-پلاستوم فرضی با استفاده از روش pcr و دورگه سازی سادرن آنالیز شده و الحاق سازه ژنی حاوی eit در کلروپلاست و هموپلاست بودن گیاهان ترانس پلاستوم تایید شد. همچنین آنالیز های elisa و دورگه سازی وسترن ثابت کرد که پروتئین کایمریک eit در کلروپلاست بیان می شود و میزان بیان آن 4/1% کل پروتئین محلول برگ می باشد. در آزمایش های بررسی ایمنی زایی، موش هایی که با روش خوراکی با گیاهان ترانس-پلاستوم ایمن شده بودند، سطوح بالایی از پاسخ ایمنی(آنتی بادی های igg و iga) در سرم و مدفوع نشان دادند که دلیل بر ایمنوژن بودن آنتی ژن eit بیان شده در کلروپلاست گیاه می باشد. بعد از ایمنی زایی، مواجهه موش های ایمن و غیر ایمن با باکتری اشریشاکلی سویه o157:h7، نشان داد که در موش های ایمن تعداد باکتری های دفع شده از روز دوم بعد از چالش به تدریج کاهش می یابد؛ به طوریکه بعد از یک هفته از چالش تقریبا به صفر رسید. در حالی که، در موش های غیر ایمن تعداد باکتری دفع شده کاهش نیافت. نهایتا نتایج این تحقیق نشان داد که پروتئین eit بیان شده در کلروپلاست ، کاملا ایمنوژنیک بوده و دارای پتانسیل مناسبی برای توسعه یک آنتی ژن ایمنوژنیک خوراکی بر علیه باکتری اشریشاکلی سویه o157:h7 را دارد. کلمات کلیدی: ایمنی زایی، باکتری اشریشاکلی هموراژیک، بیان کلروپلاستی، پروتئین ترکیبی سه تایی

گیاهان یک جایگزین مناسب برای سیستم های معمول بیان پروتئین های نوترکیب، نظیر حیوانات یا سیستم های میکروبی می باشند. در زراعت مولکولی علاوه بر بیان موقت ژن (های) هدف می توان آنها را به هسته یا کلروپلاست سلول گیاهی منتقل کرد. به دلیل پلی پلوئیدی ژنوم پلاستیدهای گیاهی، در صورت تراریختی کلروپلاست، هزاران کپی از ژن هدف در هر سلول وارد و حجم بسیار بالایی از پروتئین نوترکیب در این اندامک ها تولید می شود. بیماری های قلبی- عروقی سومین عامل مرگ و میر انسانی هستند. پروتئین انسانی tpa (tissue plasminogen activator) یکی از مهم ترین پروتئین های نوترکیب داروئی است که به منظور از بین بردن لخته خون در بخش های مختلف بدن از جمله رگ های خون رسان به قلب و مغز استفاده می شود. فرم اصلاح شده پلاسمینوژن بافتی (k2s) دارای نیمه عمر پلاسمایی طولانی تر، قدرت نفوذ در لخته و فعالیت تجزیه فیبرین بالاتر می باشد. در این پروژه تحقیقاتی، به منظور انتقال ژن k2s به کلروپلاست گیاه توتون،cdna مربوطه پس از تکثیر به کمک pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، در ناقل t/ptz57r درج و همسانه سازی شد. پس از اطمینان از صحت چارچوب بازخوانی ژن از طریق توالی یابی، قطعه هدف در ناقل کلروپلاستی pkcz خاص گیاه توتون درج و در باکتری e. coli سویه dh5? همسانه سازی شد. جهت تسهیل تخلیص محصول پروتئین تولیدی از طریق کروماتوگرافی، توالی شش هیستیدین و توالی پروتئازی فاکتور xa به انتهای آمینی ژن k2s الحاق شد. ناقل حامل ژن هدف با استفاده از روش زیست پرتابی، به ریزنمونه های برگی شلیک شد. سپس ریزنمونه های دریافت کننده ژن به منظور انتخاب سلول های تراریخته بر روی محیط گزینش گر حاوی 500 میلی گرم در لیتر آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین قرار گرفتند. پس از باززایی جوانه های تراریخته، به منظور رسیدن به هموپلاسمی، زیرکشت های متعدد و حداقل سه دوره باززایی نوساقه در حضور آنتی بیوتیک گزینش گر انجام شد. حضور و تلفیق تراژن k2s در گیاهان ترانس پلاستومیک با آنالیز pcr و هموپلاسمی به کمک کاوشگرهای طراحی شده و آزمون دورگه سازی به روش سادرن به تایید رسید. ارزیابی بیان ژن هدفk2s و میزان پروتئین تولیدی با آنالیز rt-pcr، sds-page، لکه گذاری نقطه ای، وسترن بلات و الایزا انجام شد. فعال بودن پروتئین تولید شده در گیاهان تراریخته با آزمون زیموگرام تایید شد. پروتئین tpa تولیدی در گیاهان ترانس پلاستومیک توتون، با ستون نیکل و روش کروماتوگرافی میل ترکیبی به فلز، تخلیص شد. حضور پروتئین tpa (فرم k2s) در نمونه های حاصل تخلیص پس از وسترن بلات، مورد تایید قرار گرفت. نتایج این تحقیق نشان داد که میزان پروتئین tpaتولید شده در کلروپلاست به طور قابل ملاحظه ای نسبت به گزارشات قبلی بیان پروتئین tpaدر هسته گیاه افزایش داشته است و اندامک کلروپلاست به عنوان یک بیوراکتور طبیعی از پتانسیل خوبی جهت بیان tpa برخوردار است.

در حال حاضر میلیون ها نفر در سراسر جهان برای گریز از اثرات کشنده بیماری دیابت به تزریق دائمی انسولین نیاز دارند. بنابراین توسعه سیستمی که بتواند این دارو را با قیمت و فراوانی مناسب در اختیار مصرف کنندگان قرار دهد؛ امری ضروری می باشد. با توسعه تکنیک مهندسی ژنتیک، انسولین انسانی در باکتری e. coli و مخمر تولید گردید؛ ولی به علت معایب تولید پروتئین های نوترکیب در میکروارگانیسم ها مانند هزینه نسبتاً بالا، امکان آلودگی با پروتئین های سمی و نیاز به مراحل هزینه بر خالص سازی؛ بیشتر تحقیقات برروی تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان متمرکز شده است. در این مطالعه، سازه pbi121 شامل توالی های ضمیمه حاوی کزاک، ltb، اکستنسین، ژن پروانسولین انسانی، پنتراتین و شش اسیدآمینه هیستیدین به واسطه گری اگروباکتریوم lba4404 pv. agrobacterium tumefaciens به گیاه توتون انتقال یافت. حضور ژن مورد مطالعه در ژنوم گیاهان تراریخت توتون توسط آزمایش مولکولی pcr تأیید گردید. همچنین نتایج حاصل از واکنش rt-pcr بر صحت بیان ژن پروانسولین انسانی در گیاهان تراریخت توتون تأکید نمود. نتایج حاصل از الیزا نیز نشان داد که گیاهان تراریخت توانایی ترجمه و تولید پروتئین الحاقی را داشته و انسولین تولیدی در بافت های گیاهی کاملاً فعال بوده و قابلیت کاربرد در پزشکی را دارد. به نظر می رسد که مقدار تخمینی پروتئین نوترکیب تولید شده در گیاهان تراریخت to(در حدود 18/0% کل پروتئین های گیاهان تراریخت) مناسب باشد و تولید این گیاهان تراریخت از نظر اقتصادی مقرون به صرفه است. همچنین، حضور و بیان ژن پروانسولین انسانی در گیاهان تراریخت توتون در نسل بعد نشان داد که ژن مورد نظر به صورت پایدار در ژنوم گیاهان توتون قرار داشت. رشد گیاهان نسل اول در محیط کشت حاوی کانامایسین با نسبت مندلی 3:1 نیز انتقال ژن پروانسولین انسانی به گیاهان نسل بعد را تأیید نمود. اگرچه تا به حال پروانسولین انسانی در گیاهان تولید شده است ولی تا به امروز هیچ کدام از الحاق های مورد استفاده در این پژوهش در گیاهان استفاده نشده است. با توجه به نتایج مثبت به دست آمده از این پروژه به نظر می رسد سازه مذکور دارای توانایی مناسبی جهت تولید و بیان ژن پروانسولین بوده و برای بررسی های بیشتر و انتقال به گیاهان دیگر مناسب باشد.

در سال¬های اخیر، استفاده از گیاهان به¬عنوان میزبان¬هایی برای تولید پپتیدهای نوترکیب باارزش، به¬دلیل مزایایی همچون ایمنی بالا، هزینه پایین و تغییرات پس از ترجمه، سطح وسیعی از تحقیقات را به¬خود اختصاص داده است. یکی از پپتیدهای باارزشی که هزینه بالای تولید آن، بررسی سایر سیستم¬های تولید پروتئین نوترکیب نظیر گیاهان را برای تولید ارزان¬ و ایمن¬تر آن، الزامی کرده است، فعال¬کننده پلاسمینوژن بافتی (tpa) می¬باشد. گلیکوپروتئین tpa، دارویی گران¬قیمت است که به منظور انحلال اختصاصی لخته¬های خونی ایجاد شده متعاقب برخی بیماری¬های قلبی عروقی نظیر سکته و ترومبو¬آمبولی، تجویز می¬شود. هدف از انجام پژوهش حاضر، بررسی قابلیت تولید پروتئین نوترکیب tpa در سیستم¬های گیاهی به میزبانی گیاهان توتون و کاهو و همچنین مقایسه تاثیر سه سیگنال پپتید zera، extensin و kdel بر تولید پروتئین نوترکیب tpa در گیاهان می¬باشد. در این پژوهش cdnaی ژن tpa تحت کنترل پیش¬برنده s35camv و خاتمه دهنده nos به همراه سه سیگنال پپتید zera، extensin و kdel به¬صورت سه سازه مختلف با نام¬های pzt، pext و pkt به ژنوم گیاهان توتون و کاهو با روش میانجیگری اگروباکتریوم منتقل شد. نتایج آنالیز گیاهان تراریخت نسل¬های t0 و 1t در دو سطح dna و rna ، با استفاده از تکنیک¬های pcr و rt-pcr، صحت حضور هر سه سازه مورد استفاده و تولید رونوشت از آن¬ها¬ را تائید نمود. همچنین آنالیز داده¬های حاصل از آزمون الایزا بر روی گیاهان توتون تراریخت، نشان داد که تاثیر در افزایش تولید پروتئین نوترکیب tpa در نسل t0، برای گیاهان تراریخت شده با سازه¬های pkt و pext، کم و برای سازه pzt بسیار ناچیز و فاقد تفاوت معنی¬دار با گیاهان غیرتراریخت می¬باشد. این نتایج در مورد گیاهان تراریخت نسل 1t بسیار متفاوت بود و نشان داد که بیشترین تاثیر در افزایش تولید پروتئین نوترکیب tpa در نسل 1t، به¬ترتیب برای گیاهان تراریخت شده با سازه¬های pzt، pext و pkt اتفاق افتاد. مقدار پروتئین تولید شده با این سازه¬ها به ترتیب برابر با 03/0 ، 014/0 و 005/0 نانوگرم در میلی لیتر محاسبه شد. با توجه به یکنواخت بودن سن گیاهان تراریخت نسل 1t و عدم این یکنواختی در گیاهان نسل t0 به¬علت عدم هم¬زمانی در کشف گیاهان تراریخت، احتمالا تولید پروتئین نوترکیب در برخی گیاهان نسل t0 به علت پیر بودن آنها دچار تقلیل شده است. بنابراین تولید پروتئین نوترکیب در نسل 1t مبنای مقایسه تاثیر سیگنال پپتیدها قرار گرفت. لذا بر این اساس علاوه بر قابلیت انتقال ژن tpa به گیاهان توتون و کاهو به صورت پایدار، نتیجه¬گیری می¬شود که سیگنال پپتیدهای zera و extensin گزینه¬های مناسبی برای افزایش تولید پروتئین نوترکیب tpa، در مقایسه با سیگنال kdel می¬باشند.

جلبک به عنوان نسل سوم تولید کننده سوخت های زیستی علی الخصوص بیودیزل تمام پیش شرط های لازم به منظور تبدیل شدن به منبع پایدار تولید سوخت زیستی، از جمله توانایی رقابت با سوخت های فسیلی در زمینه هزینه تولید ، عدم نیاز به زمین کشاورزی مستعد، مصرف آب محدود و توانایی بالای ترسیب co2 اتمسفر را دارا است. در این تحقیق نخست از بین 11 گونه مختلف ریزجلبک انواع پربازده شناسایی شدند و معین شد که عملکرد تولید روغن، که خود مستقیماً از عملکرد تولید زیست توده تأثیر می پذیرد، خصوصیت مناسبی برای انتخاب و شناسایی گونه های پربازده می باشد. همچنین انواع تیمارهای بیوشیمیایی به منظور افزایش عملکرد تولید چربی بر روی گونه های موردنظر مطالعه شد. اعمال 200 میلی گرم در لیتر میواینوزیتول 50 درصد محتوی روغن سلولی را در گونه dunaliella salina افزایش داد اما از آنجائی که روش های معمول مثل کنترل شرایط رشد (دما، ph و شوری) و تأمین مواد غذایی در محیط رشد جلبک کارایی لازم برای افزایش تولید چربی در بیومس را ندارند، دستکاری¬ ژنتیکی آنزیم¬های کلیدی در سنتز اسیدهای چرب و افزایش بیان آن ها از طریق مهندسی کلروپلاست و هسته در دستور کار قرار گرفت. از جمله این ژن ها می توان me و accd را نام برد که در تحقیق حاضر بر روی سازه های ژنومی و کلروپلاستی ریزجلبک از جمله گونه d. salina، همسانه سازی شدند و نهایتاً ژن accd در ژنوم کلروپلاست این گونه با موفقیت الحاق شد. بیان موفق این ژن از راه اندازهای دائمی s16 اثرات محدودی بر روی میزان ونحوه تجمع چربی های سلولی در لاین های تراریخته را باعث شد اما بیان این تراژن خصوصیات کیفی بیودیزل تولیدی را بخوبی ارتقا داد. این نتیجه کارایی کاربرد رویکردهای ژنتیکی را در بهبود خصوصیات تولیدی روغن از منبع جلبک به تأیید رساند.

گیاهان به دلیل تولید پروتئین نوترکیب با هزینه پایین، تولید انبوه و ایمنی بالا، به عنوان جایگزین مناسبی برای سیستم‏های رایج تولید پروتئین نوترکیبدارویی، بویژه در فرمانتور مطرح می‏باشند.فعال کننده پلاسمینوژن بافتی(tpa) یکی از پروتئین‏های دارویی است که برای حل کردن لخته‏های خونی در سکته‏های قلبی و مغزی کاربرد گسترده ای دارد و به دلیل کمیاب بودن و قیمت بالا در دسترس عموم بیماران نمی‏باشد. گیاهان تراریخت حاوی ژن tpa توسط تیم تحقیقاتی گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس تولید شده بود و در این پروژه تحقیقاتی نیز پایداری ژن tpa درنسل دوم گیاهان تراریخته توتون، به منظور امکان‏سنجی و فراهم نمودن مقدمات تولید پروتئین tpa در حجم انبوه مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور بذرهای حاصل از گیاهان تراریختt0با دو سازه pktو pext روی محیط کشت انتخابگر واجدmg l -1 100 کانامایسین کشت شدند سپس روی گیاهان تراریخت، آنالیز pcr و rt-pcr انجام شد و حضور و بیان ژن tpa در گیاهان تراریخت اثبات گردید. از برگ گیاهان تراریخت که دارای بیان ژن tpa، بودند پروتئین کل استخراج و تولید پروتئین هدف با آزمون لکه‏گذارینقطه‏ای اثبات گردید. میزان پروتئین تولیدی با آزمون الایزا برای سازه pkt 023/0% و برای سازهpext 025/0% از پروتئین محلول کل (tsp)تعیین گردید. با انجام آنالیزهای آماری بین گیاهان واجد دو سازه‏ اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد ولی گیاهان تراریخت با دو سازه در مقایسه با گیاه شاهد با آزمون lsd در سطح احتمال95% اختلاف معنی‏داری داشتند. برای تایید بیشتر، آزمون وسترن‏بلات انجام شد، قطعه‏های kda32-21 مشاهده گردید. نتایج بدست آمده نشان دادند که پایداری ژن در گیاهان تراریخت نسل دوم 70% و پایداری بیان 80%می‏باشد، هم چنین میزان تولید پروتئین افزایش یافت اما به علت فعالیت پروتئازها به قطعه‏های کوچکتر شکسته شد

دیابت بیماری است که در اثر آن بدن نمی تواند انسولین تولید و یا به طور موثر از آن استفاده کند. اگرچه انسولین نوترکیب به¬طور تجاری در باکتری و یا مخمر تولید می شود، ولی نیاز به توسعه سیستم های جایگزین برای تولید انسولین وجود دارد. استفاده از قارچ های خوراکی برای تولید داروهای زیستی، که با پیشرفت های اخیر در زمینه بیولوژی مولکولی امکان پذیر شده است، دارای تمام مزیت های سیستم های مبتنی بر گیاه (نظیر هزینه پائین تولید) به همراه ویژگی های منحصر به فرد قارچ ها می باشد. این ویژگی های منحصر به فرد از بیولوژی قارچ ها و ماهیت سیستم تولید آن ها نشأت می گیرد. برای این منظور ناقل دوتاییpcambctb-ins حاوی زیر واحد b سم وبا که به ژن پروانسولین انسانی الحاق شده بود، تحت کنترل پیشبرنده gpd ساخته شد و با استفاده از روش انتقال ژن مبتنی بر اگروباکتریوم به بافت ژیل قارچ صدفی (pleurotus ostreatus) منتقل گردید. شرایط تراریختی قارچ صدفی جدایه ایرانی (iran1649c) از جنبه های مختلفی نظیر سویه agrobacterium tumefaciens ، غلظت سوسپانسیون باکتری و دمای هم کشتی قارچ و باکتری بهینه سازی شد. پس از هم کشتی قارچ و باکتری، بافت های ژیل در محیط گزینشگر حاوی هیگرومایسین و سفوتاکسیم کشت شدند. اگروباکتریوم سویه gv3101 در غلظت 0/8(od600nm) و دمای °c25 در هم کشتی قارچ و باکتری بیشترین کارایی تراریختی (تقریبا 40%) را نشان داد. پس از تایید قارچ های تراریخت با استفاده از آزمون pcr با آغازگرهای اختصاصی، درج پایدار ژن ترکیبی ctb و پروانسولین در ژنوم قارچ صدفی با آزمون لکه گذاری سادرن تایید شد. بیان این ژن ترکیبی در سطح رونویسی و پروتئین با روش هایی نظیر rt-pcr، elisa و ایمونوبلاتینگ تایید شد و در میسلیوم قارچ های تراریخت میزان پروتئین ترکیبی ctb و پروانسولین انسانی 0/04% پروتئین محلول کل بود. با توجه به نتایج این تحقیق و بیان موفق ژن های خارجی در قارچ تراریخت، می¬توان به توسعه و تولید داروهای زیستی در قارچ های خوراکی امیدوار بود.

چکیده به تولید پروتئین های دارویی و صنعتی ارزشمند در گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک، کشاورزی مولکولی اطلاق می شود. از مزایای انتقال ژن به ژنوم کلروپلاست در مقایسه با ژنوم هسته می توان به سطح بالای بیان، امکان بیان چند ژن در یک اپرون پلی سیسترونی، نبود اثرات خاموشی ژن و احتمال بسیار اندک انتقال افقی ژن از طریق دانه گرده اشاره نمود. سالانه میلیون ها نفر در دنیا از عوارض ناشی از بیماری های قلبی و عروقی رنج می برند. یکی از مهم ترین داروهای حذف کننده لخته برای درمان این نوع از بیماری ها، پروتئین فعال کننده ی پلاسمینوژن بافتی (tpa) است. این آنزیم پروتئازی با تبدیل پلاسمینوژن به فرم فعال پلاسمین، موجب تجزیه رشته های فیبرین لخته می گردد. فرم کوتاه شده فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (k2s) دارای نیمه عمر پلاسمایی طولانی تر نسبت به tpa است. در تحقیق حاضر، ناقل کلروپلاستی مناسبی به کمک بررسی های بیوانفورماتیکی و با در نظر گرفتن توالی های مورد نظر مانند نواحی احاطه کننده ی اختصاصی گیاه کاهو و عناصر افزایش دهنده بیان در سطوح رونویسی و ترجمه، طراحی گردید. ناقل کلروپلاستی حاوی ژن ترکیبی plygbs::k2s، پس از همسانه سازی، از نظر ساختاری و عملکردی با استفاده از روش های مولکولی مورد تأیید قرار گرفت. به منظور انتقال ژن به کلروپلاست گیاه کاهو، سیستم کشت بافت و باززایی مستقیم نوساقه ها از سلول های تراریخت بهینه سازی شد. ناقل کلروپلاستی (pbl102) با استفاده از روش بمباران ذره ای به ریزنمونه های برگی منتقل گردید و ریزنمونه ها روی محیط گزینشگر حاوی آنتی بیوتیک اسپکتینومایسین (یا استرپتومایسین) قرار گرفتند. پس از چند مرحله واکشت و باززایی، گیاهچه های تراریخت کلروپلاستی به صورت مستقیم از ریزنمونه ها باززایی شدند. نتایج ارزیابی گیاهان تراریخت کلروپلاستی در سطح dna نشان داد که ژن های انتقالی در جایگاه صحیح در ژنوم کلروپلاستی درج شده اند. همچنین، رونویسی از ژن plygbs::k2s به روش rt-pcr اثبات شد. بررسی بیان پروتئین به وسیله آزمون های sds-page، elisa، لکه گذاری نقطه ای و وسترن، تولید پروتئین نوترکیب plygbs-k2s را در کلروپلاست گیاهان کاهو تأیید نمود. کلمات کلیدی: مهندسی ژنوم پلاستیدی، ناقل کلروپلاستی، کشاورزی مولکولی، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی، گیاه کاهو

چکیده ندارد.

بکارگیری زیست مولکولی و زیست فناوری گیاهی نشان داده است که می توان بسیاری از داروها را در حجم انبوه و به قیمت بسیار ارزان در گیاهان تولید نمود. جذابیت سیستم های گیاهی به دلیل مزایایی همچون ایمنی بالا، هزینه پائین، تغییرات پس از ترجمه و حجم بالای تولید است که نسبت به سیستم های کلاسیک (مثل باکتری ها، مخمرها و سلولهای جانوری) دارند. پروتئین داروئی (tissue plasminogen activator) tpa بطور اختصاصی و نسبتا قوی به لخته های خونی متصل شده و ترجیحا پلاسمینوژن به دام افتاده در داخل لخته ها را فعال و لخته خونی را از بین می برد. از پروتئین نوترکیب tpa به منظور درمان سکته های قلبی و مغزی استفاده می شود. در این تحقیق، به منظور بررسی امکان و نحوه بیان این پروتئین در سیستم بیانی گیاهی، cdna ژن فعال کننده پلاسمینوژن بافتی(tpa) با کمک آغازگرهای اختصاصی در ناقلt/a همسانه سازی و سپس در ناقل بیانی گیاهی pbi121 در مجاورت ژن gus همسانه سازی شد. این ژن تحت کنترل پیشبرنده camv 35s و خاتمه دهنده nos قرار گرفت. توالی افزایش دهنده kozak و ترادف رمز کننده پپتید نشانه kdel، به ترتیب به انتهاهای آمینی و کربوکسیلی ژن tpa افزوده شدند. سازه pbi-tpa ابتدا به آگروباکتریوم سوش lba4404 و سپس به ژنوم گیاهان توتون انتقال داده شد. گیاهان تراریخته روی محیط کشت انتخابگر (حاوی کانامایسینmg.l-1 100) انتخاب شدند و جوانه های تراریخت ریشه دار شده ابتدا به پرلیت و سپس به خاک منتقل شدند به منظور جلوگیری از دگرگرده افشانی غنچه قبل از باز شدن پاکت گذاری و ایزوله شدند و بذور نسل اول (t0) از آنها جمع آوری و ارزیابی پایداری ژن در نسل بعد انجام شد.. واکنش rt-pcr نیز انجام رونویسی و تولید mrna مربوطه را اثبات کرد. ژل sds-page نیز علائم اولیه و احتمالی حضور پروتئین مورد نظر(tpa) را نشان داد و از آزمون وسترن بلات جهت اطمینان از بیان پروتئین tpaاستفاده شد. آزمون زیموگرافی برای بررسی فعال بودن پروتئین تولید شده انجام شد که این آزمون هم حضور و هم فعال بودن پروتئین نوترکیب tpa را اثبات کرد. اکنون اگر بتوان این پروتئین نوترکیب را تخلیص کرد، این پروتئین داروئی توانایی حل لخته های خونی را خواهد داشت. بدیهی است با استحصال و استخراج این پروتئین نوترکیب ارزشمند علاوه بر تولید انبوه و ارزان آن، گام موثر دیگری در جهت پیشرفت داروهای نوترکیب در کشور برداشته خواهد شد.