بیماری نیوکاسل، یکی از مهمترین بیماری های عفونی پرندگان به ویژه ماکیان است که باعث خسارات اقتصادی وسیعی در صنعت مرغداری می گردد. عامل این بیماری، پارامیکسوویروس تیپ یک ماکیان (apmv-1) و عضوی از خانواده ی پارامیکسوویریده است. این ویروس به نام ویروس بیماری نیوکاسل نیز موسوم می باشد. علاوه بر روش های مرسوم ارزیابی حدت جدایه ها، تعیین حدت توسط روش های ملکولی نیز قابل انجام می باشد. در این راستا، حدت ویروس به وسیله ی تعیین توالی آمینواسیدی ناحیه ی شکافت پروتئین فیوژن صورت می پذیرد. این ناحیه بین اسید آمینه های شماره ی 112 تا 117 قرار گرفته است. سویه های بدون حدت دارای دو اسید آمینه ی بازی در این ناحیه بوده و اسید آمینه ی شماره ی 117 لوسین می باشد در حالی که سویه های دارای با حدت بالا، دارای بیش از دو اسید آمینه ی بازی در ناحیه ی فوق بوده و اسید آمینه ی شماره ی 117 نیز فنیل آلانین می باشد. با توجه به شیوع این بیماری در 18 ماه گذشته در اکثر نقاط کشور، بر آن شدیم تا ویروس یا ویروس های در گردش در گله های طیور استان خراسان را جداسازی، تعیین هویت و مورد ارزیابی پاتوتایپینگ ملکولی و بررسی فیلوژنی قرار دهیم. جهت انجام این کار، نمونه گیری از مغز 10 لاشه ی مرغ گوشتی و تخم گذار مشکوک به بیماری نیوکاسل از مناطق مختلف استان خراسان رضوی و شهرستان بیرجند صورت گرفت. نمونه ها پس از جمع آوری و هموژن کردن در محیط حاوی آنتی بیوتیک و ضد قارچ، به تخم مرغ جنین دار 11-9 روزه ی عاری از ویروس بیماری نیوکاسل تزریق شدند. تخم مرغ ها روزانه به مدت یک هفته توسط دستگاه کاندلینگ بررسی شدند و مایع آلانتوئیک جنین های تلف شده جمع آوری و به وسیله ی آزمون های هماگلوتیناسیون (ha) و ممانعت از هماگلوتیناسیون (hi) با سرم حاوی آنتی بادی اختصاصی، ارزیابی شدند. rna مایع آلانتوئیک نمونه های مثبت استخراج و پس از تبدیل شدن به cdna توسط پرایمرهای اختصاصی پوشش دهنده ی ناحیه ی شکافت پروتئین فیوژن، تکثیر شدند. سپس 6 محصول pcr از ژل آگارز برش زده شدند و پس از خالص سازی، توالی یابی گردیدند. در نهایت کروماتوگرام خام توالی های نوکلئوتیدی پس از ویرایش مورد ارزیابی های پاتوتایپینگ ملکولی قرار گرفتند. توالی های نوکلئوتیدی حاصله نیز پس از همسان سازی چند گانه (multiple alignment) با توالی های همسنگ در بانک های اطلاعات ژنی، مورد ارزیابی فیلوژنتیک قرار گرفتند. براساس نتایج حاصله، علی رغم تفاوت های اندک در ناحیه ی تکثیر شده ی ژن فیوژن، تمام جدایه ها واجد توالی آمینواسیدی 112-rrqkrf-117 در ناحیه ی شکافت پروتئین فیوژن بودند. با توجه به وجود بیش از دو اسید آمینه ی بازی در این ناحیه و حضور اسید آمینه ی فینل آلانین در موقعیت شماره ی 117 و نیز با عنایت به تابلوی بالینی و کالبدگشایی و سیمای هیستوپاتولوژیک، ویروس بیماری نیوکاسل دخیل در واگیری های اخیر منطقه و احتمالا کشور، متعلق به پاتوتیپ ویسروتروپیک ولوژنیک ارزیابی گردید. از نظر فیلوژنی نیز تمامی جدایه های ویروس بیماری نیوکاسل در نقاط مختلف استان و همچنین شهرستان بیرجند، از یک منشا واحد و در کلاس ii، ژنوتیپ vii و تحت ژنوتیپ d (viid) در کنار جدایه هایی از چین و تایوان قرار گرفتند. این جدایه ها در تقسیم بندی ویروس های بیماری نیوکاسل براساس دودمان (lineage) نیز در دودمان 5 و تحت دودمان d (5d) واقع شدند.

مواد و روش کار 1- در این مطالعه از محیط کشت مایع و جامد pplo، برای کشت نمونه ها استفاده شده است. 2- نمونه برداری جهت کشت 2-1- نمونه برداری ازپرندگان تلف شده نمونه ها از کلینیک تخصصی بخش طیور و کلینیکهای بخش خصوصی اخذ گردید، لاشه های جوجه های گوشتی که در آنها درگیری کیسه های هوایی وجود داشت به صورت تصادفی انتخاب و به طور میانگین از هر گله حدود 4 تا 6 نمونه گرفته و مشخصات مرغداری مربوطه به صورت کامل یادداشت می گردید. در مجموع 150 نمونه از 50 مرغداری اطراف مشهد گرفته شد. اطلاعات فرم هر مرغداری شامل موارد زیر بود: 1- تاریخ نمونه گیری 2- ظرفیت مرغداری 3- نوع پرورش: گوشتی تخم گذار 4- تعداد تلفات 5- سن درگیری گله 6- تعداد نمونه گرفته شده روش نمونه گیری به این صورت بود که ابتدا با دستکش، قسمت های خارجی لاشه را با الکل ضدعفونی و تمیز کرده سپس با قیچی تمیز قسمت های خارجی بخش های مورد نیاز را برش داده تا به کیسه های هوایی و نای و شکاف کامی دسترسی پیدا کرد. سپس با قیچی استریل شده نای را برش داده و یک سوآپ استریل را داخل ترشحات نای زده و نمونه گرفته می شد و بعد سوآپ حاوی نمونه داخل لوله حاوی سرم فیزیولوژی قرار می گرفت. سوآپ بعدی را داخل مجرای بینی فرو برده و از ترشحات داخل بینی هم نمونه گرفته می شد و سوآپ داخل لوله قرار می گرفت. سوآپ بعدی به داخل شکاف کامی زده می شد و نمونه گرفته می شد و سوآپ آخری هم برای کیسه های هوایی بود و از کیسه های هوایی نمونه گرفته می شد. بعد از جمع اوری نمونه ها داخل لوله ها، لوله های مربوطه در جا لوله ای قرار می گرفت و در کنار یخ داخل سبد به آزمایشگاه منتقل می شد. در آزمایشگاه در زیر هود انتقال این نمونه ها به داخل محیط کشت مایع pplo صورت می گرفت به این صورت که ابتدا یک لوله حاوی سوآپ های نمونه در روی شیکر قرار می گرفت تا کل محتوای نمونه ها در روی سوآپ ها پخش شود سپس 2تا سوآپ را برداشته و داخل محیط مایع pplo که به آن nadو cystein اضافه شده بود تلقیح شد و 2 سوآپ دیگر به داخل محیط مایع pplo که بدون nadوcystein بود تلقیح می شد و سپس 2 تا محیط مایع دوباره با فیلتر 0/45 میکرون به داخل لوله های استریل جدید منتقل می شد. در مورد بقیه لوله های حاوی نمونه هم همین روش به کار برده شد و در آخر تمام محیط های مایع با درج مشخصات و تاریخ در روی آنها داخل انکوباتور 37 درجه قرار می گرفت(4،1) 3- کشت وجداسازی پس از قرار دادن نمونه ها در انکوباتور، محیط های کشت روزانه مورد بررسی قرار می گرفت. تغییر رنگ درطی بیست و چهار ساعت اول ناشی از آلودگی باکتریایی یا رشد مایکوپلاسماهای ساپروفیت قلمداد شده و این نمونه ها از انکوباتور حذف می گردیدند. در روزهای بعد هر تغییر رنگی از قرمز به زرد سریعا پاساژ داده شده و مجدد به محیط کشت مایع انتقال داده می شد. نمونه هایی که تا 10روز هیچ تغییر رنگی نداشتند نیز در روز دهم پاساژ داده شده و به محیط مایع منتقل می شدند. محیط های مایع کشت مجدد، به مدت 17 روز در انکوباتور می ماند و روز هفدهم نمونه هایی که تغییر رنگ به سمت زردی داشت به محیط جامد منتقل می شد. بهرحال نمونه های اصلی تا یک ماه در انکوباتور حفظ شده و در صورتی که شواهدی از رشد در آنها یا ساب کالچر آنها مشاهده نمی شد بعنوان نمونه منفی حذف می گردیدند(5،4). 3-1- روش کشت درمحیط جامد روش کشت به این صورت بود که از محیط کشت مایع تغییر رنگ داده، با سرنگ استریل از داخل لوله محیط کشت، مقداری از محیط را برداشته و سپس به فیلتر استریل وصل کرده و انتقال به محیط کشت جامد به طوری که فقط سطح محیط جامد را به صورت یک لایه نازک بپوشاند، صورت می گرفت. محیط های کشت جامد بعد از درج مشخصات نمونه مربوطه و تاریخ در روی آنها در انکوباتور 37 درجه قرار می گرفت و بعد از مدت 7 تا 10 روز پرگنه های مایکوپلاسما مشاهده می شد. به دلیل نداشتن لوپ در آزمایشگاه، پلیت های محیط کشت جامد در شرایط استریل و بدون باز کردن درب آنها در زیر میکروسکوپ قرار گرفته و با بزرگنمایی 10، پرگنه های مایکوپلاسما مورد مشاهده قرار می گرفت (5،4). 4-دسته بندی نمونه ها 4-1- از حدود 50 گله ی طیور گوشتی واز تعداد 150 لاشه ی مرغ گوشتی از قسمت های نای، شکاف کامی، داخل مجرای بینی و کیسه های هوایی انها نمونه گیری صورت گرفت. تمام نمونه های گرفته شده در آنها درگیری کیسه های هوایی و وجود چرک در کیسه های هوایی و پرده اطراف قلب وجود داشت و از لاشه هایی نمونه برداری صورت می گرفت که ترشحات در مجاری هوایی ، نای و برونش ها دیده می شد 4-2-مراحل کشت نمونه ها درمحیط ها 1- کشت اول نمونه های گرفته شده با فیلتر 45/0 میکرون به داخل محیط کشت مایع pplo 2- در طی 24 ساعت بعد از کشت اول نمونه ها در محیط مایع، هر تغییر رنگی در محیط ها از قرمز به سمت زرد، ناشی از الودگی باکتریایی قلمداد شده و این نمونه ها از انکوباتور حذف می گردید. 3- محیط کشت های مایع بعد از قرار گیری در انکوباتور، هر 48 ساعت جهت مشاهده تغییر رنگ مورد بررسی قرار می گرفت. 4- تغییر رنگ ایجاد شده در محیط های کشت مایع، با عدم تغییر رنگ نمونه کنترل که به عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شده بود، مقایسه می شد. 5- تغییر رنگ در محیط کشت های مایع حدود 2 تا 3 هفته طول می کشید 6- در صورت مشاهده تغییر رنگ در محیط های کشت مایع، بلافاصله کشت توسط فیلتر در محیط مایع یا جامد pplo صورت گرفت. 7- 7 تا 10 روز بعد از کشت در محیط جامد، پرگنه های مایکوپلاسما در زیر میکروسکوپ با درشت نمایی 10 مورد مشاهده قرار می گرفت(1،3). از کشت تعداد 150 نمونه اخذ شده از 50 گله ی گوشتی، تعداد 16 جدایه مایکوپلاسما، از نمونه ها حاصل شد (66/10%) و تعداد 4 گله از 50 گله ی مورد مطالعه، از نظر آلودگی به مایکوپلاسما مثبت شدند (8%). هر کدام از این 4 مورد مثبت به دست آمده، نتیجه ی کشت تمامی نمونه های گرفته شده از گله ی مربوطه است. تمام نمونه های مربوط به این 4 گله، که مثبت گزارش شدند در کشت اول در محیط مایع، تغییر رنگ از قرمز به سمت زرد را به وضوح نشان می دادند و 7 تا 10 روز بعد از کشت در محیط جامد، پرگنه های مایکوپلاسما در زیر میکروسکوپ با درشت نمایی 10 مورد مشاهده قرار می گرفت. دیدن این کلنی ها، که ظاهری شبیه تخم مرغ نیمرو دارد، تاییدی بر این نتایج است. با استفاده از روش pcr با پرایمر یونیورسال، نتایج مثبت به دست آمده تایید نهایی شد. فقدان رشد مایکوپلاسما در یک محیط رشد غنی، نتیجه فقدان یک ماده غذایی خاص نیست بلکه ناشی از حضور ترکیب یا ترکیباتی سمی برای مایکوپلاسما است. اعتقاد بر اینست که سویه های غیر قابل کشت مایکوپلاسما سویه های سخت گیر خاصی نیستند بلکه انها حساسیت بیشتری به مهارکننده های موجود در محیط کشت بویژه در ترکیباتی همانند پپتون و عصاره مخمر دارند. لذا دو واژه غیر قابل کشت و سخت گیر واژه های نسبی هستند که تنها در مورد یک سیستم کشت خاص که محرکها و احتمالا مهار کننده های رشد وجود دارند قابل تفسیر است(6). یکی از مسائل مهم در جداسازی مایکوپلاسمای پاتوژن پرندگان توجه به حضور مایکوپلاسماهای ساپروفیت به ویژه مایکوپلاسما گالیناسه اوم و مایکوپلاسما گالیناروم می باشد. رشد این مایکوپلاسماها خیلی سریعتر از مایکوپلاسماهای پاتوژن می باشد(7).

تب کیو یک بیماری مشترک بین انسان و دام میباشد که توسط کوکسیلا بورنتی ایجاد می شود، نشخوارکنندگان منبع اصلی عفونت انسانی محسوب می شوند. به طور کلی عفونت کوکسیلا بورنتی در گاو بدون علامت است اما می تواند با مشکلات تناسلی همراه باشد. شیر خام یا محصولات لبنی که از شیر غیرپاستوریزه تهیه می شوند (پنیر) ممکن است آلوده به فرم حاد کوکسیلا بورنتی باشند. هدف از این بررسی، تعیین میزان آلودگی به کوکسیلا بورنتی در نمونه های شیر مخزن گاوهای شیری می باشد. در این مطالعه تعداد 100 نمونه شیر مخزن برای شناسایی کوکسیلا بورنتی با استفاده از روش touch down pcr مورد آزمایش قرار گرفت. نمونه هاازکارخانه ی پگاه در شهرستان مشهد جمع آوری شد. پرایمرهای طراحی شده قطعه ای از ژنis1111a، حاوی 687 جفت باز در کوکسیلا بورنتی را تکثیرمی-کنند.درمطالعه ی حاضر،ازتعداد 100 نمونه شیر مخزن گاو مورد بررسی، تعدادپنج نمونه (5%) به کوکسیلا بورنتی آلوده بودند. نتایج این مطالعه نشان داد که گاوها می توانند منبع عفونت کوکسیلا بورنتی در ایران باشند، بنابراین برای پیشگیری از گسترش عفونت در جمعیت های انسانی وحیوانات،کنترل کوکسیلوز گاوی اهمیت زیادی دارد. در مطالعات وسیع تری می توان میزان شیوع آلودگی را تعیین نمود.

استافیلوکوکوس اورئوس باعث مسمومیت غذایی از طریق آزاد کردن انتروتوکسین ها در غذا می شود. این مطالعه با هدف ارزیابی حضور ژن های مولد انتروتوکسین های a تا e و مقاومت آنتی بیوتیکی در استافیلوکوکوس اورئوس کواگولاز مثبت جدا شده از نمونه های پنیر عرضه شده در سطح شهر مشهد انجام شد. از 25 نمونه (25 درصد) از 100 نمونه پنیر مورد بررسی، استافیلوکوکوس اورئوس با میانگین آلودگی cfu/gr5 10 ×5/5جداسازی گردید. کلیه جدایه ها به روش pcr مورد تایید قرار گرفتند. از مجموع 25 سویه تایید شده، 6 سویه (24 درصد) دارای حداقل یک ژن کد کننده انتروتوکسین بودند. بیشترین فراوانی مربوط به ژن مولد انترتوکسین (sea) a 4 سویه (16 درصد) و سپس ژن مولد انتروتوکسین (sec) c 2 سویه (8 درصد) بود، هیچ کدام از سویه ها واجد ژن مولد انتروتوکسین های e,d,b نبودند. حساسیت یا مقاومت آنتی بیوتیکی سویه ها با استفاده از روش انتشار از دیسک توسط 14 آنتی بیوتیک مختلف ارزیابی گردید. بر اساس نتایج بدست آمده 100 درصد جدایه ها حداقل نسبت به یک آنتی بیوتیک مقاوم بودند. بیشترین میزان مقاومت به ترتیب نسبت به پنی سیلین (92 درصد) ، آمپی سیلین (72 درصد)، اگزاسیلین (60 درصد) مشاهده شد. هیچ کدام از سویه ها نسبت به ونکومایسین و جنتامایسین مقاومت نشان ندادند. با توجه به میزان بالای آلودگی استافیلوکوکوس در پنیر و سطح قابل توجه مقاومت آنتی بیوتیکی، استافیلوکوکوس های انتروتوکسیژنیک در پنیر، به عنوان خطر بالقوه برای سلامت مصرف کننده می باشند، لذا تشخیص این سویه ها و کنترل منبع آلودگی پنیر باید به عنوان بخشی از استانداردهای کنترل کیفی پنیر و محصولات لبنی مورد توجه قرار گیرد. کلمات کلیدی: استافیلوکوکوس اورئوس ، انتروتوکسین ،,pcr مقاومت آنتی بیوتیکی.?

اسپیروکتوز روده ای توسط باکتری های گرم منفی فنری شکل جنس برکیسپایرا ایجاد می شود. باکتری هم از انسان و هم از حیوانات مختلف جداسازی شده است و برخی از گونه های آن پتانسیل زئونوتیک بودن دارند. باکتری در طیور موجب کاهش تولید تخم مرغ، تولید تخم مرغ آلوده به مدفوع و مدفوع آبکی می-گردد. هدف از انجام این مطالعه بررسی میزان شیوع گونه های برکیسپایرا در گله های طیور تخمگذار اطراف مشهد بود.در مرحله ی اول تعداد 100 نمونه سواب رکتال از 20 گله مرغ تخمگذار( 5 نمونه از هر گله) اخذ گردید. نمونه ها در شرایط بیهوازی روی محیط آگار انتخابی کشت داده شدند و به مدت 7-5 روز گرمخانه گذاری گردید. بر اساس همولیز و کلونی های مشکوک شیری رنگ و مسطح در محیط کشت tsa وسپس با بررسی توسط میکروسکوپ فاز کنتراست، نمونه هایی که باکتری برکیسپایرا در آن ها تشخیص داده شده بود، مورد استخراج dna قرار گرفتند. سپس مرحله ی pcr توسط پرایمرهای اختصاصی جنس روی نمونه ها انجام گرفت. از 100 نمونه بررسی شده 41 نمونه با بررسی میکروسکوپی مثبت گزارش شد که با انجام آزمایش pcr، 37 نمونه باند مورد نظر برای برکیسپایرا را تشکیل داد.به نظر می رسد این اختلاف مربوط به حضور سایر باکتری-های اسپیروکت مانند در نمونه های مورد بررسی باشد. سپس روی این نمونه ها مرحله pcr توسط آنزیم های اختصاصی گونه انجام پذیرفت.از این 37 نمونه 14 نمونه از نظر باکتری برکیسپایرا اینترمدیا، 18 نمونه از نظر باکتری برکیسپایرا پیلوسی کولی،6 نمونه از نظر برکیسپایرا مردوخی و 4 نمونه از نظر برکیسپایرا اینوسنس مثبت تعیین گردید وبرکیسپایرا هایودیسانتریه در تمام نمونه ها منفی تشخیص داده شد و تعداد 3 نمونه که از نظر جنس مثبت گزارش شدند در هیچ یک از گونه های مورد بررسی قرار نگرفتند.

کلستریدیوم پرفرنجنس یک باکتری گرم مثبت، بی هوازی، دارای فرم اسپور و میله ای شکل می باشد.این باکتری یک پاتوژن مهم برای انسان و گونه های مختلف حیوانات است. باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس به عنوان عامل بیماری های روده ای بسیاری شناخته شده است که باعث ایجاد بیماری هایی مثل آنتریت نکروتیک و آنتریت هموراژیک در حیوانات و مسمومیت غذایی،اسهال با منشا آنتی بیوتیکی و اسهال تک گیر در انسان می باشد. در پرندگان نیز می تواند بیماری کشنده ی آنتریت نکروتیک را ایجاد کند. تخمین زده شده است که سالانه چیزی حدود دو بیلیارد دلارخسارات ناشی از این بیماری در صنعت طیور می باشد. باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس بر اساس توانایی در تولید 4 توکسین اصلی alpha, beta, iota و epsilon به 5 تیپ مختلف e-d-c-b-a تقسیم می شوند. علاوه بر این، تمامی گونه ها ممکن است که توکسین های دیگری علاوه بر 4 توکسین اصلی تولید نمایند که شامل انتروتوکسین(cpe), net b beta2, netb, delta, theta, kappa, lambda, gamma, eta, neuraminidase, urease mu, nu می باشند. نمونه های گردن، بال و کبد و سنگدان مرغ به صورت تازه و غیر منجمد (به تعداد 180 نمونه)از سوپرمارکت ها و فروشگاه های عرضه کننده ی مواد پروتئینی در مشهد به صورت کاملا تصادفی جمع آوری شدند.در این مطالعه ایزوله های باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس که از نمونه های گردن و بال و کبد و سنگدان جمع آوری شده، به دست آمده بود با استفاده از روش multiplex pcr مورد بررسی قرار گرفت. ژنcpa وcpb ، در حدود 3.33? از نمونه ها دیده شد.تنها باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس تیپ c در نمونه ها دیده شد.در single pcr نیز برای 6 ایزوله ی کلستریدیوم پرفرنجنس،ژن netb در 5 ایزوله(83.33%) و ژن tpel در 3 ایزوله (50%) شناسایی شد.

در نیم قرن گذشته صنعت جهانی طیور پیشرفت قابل توجهی داشته است که این پیشرفت ها در نتیجه فعالیت های عمده در زمینه مدیریت طیور، گسترش دانش تغذیه و توسعه صنعت خوراک، استفاده از دانش ژنتیک در برنامه های پرورشی و تشخیص و کنترل بیماری های طیور بوده است. امروزه ضعف سیستم ایمنی در جوجه های گوشتی که به علت سرعت بالای رشد انتخاب شده اند، با کمتر بودن وزن ارگان های لنفاوی از جمله بورس فابریسیوس، طحال و تیموس نمود پیدا کرده است، از طرفی حضور عوامل استرس زای محیطی و نیز عوامل بیماری زای سرکوب گر ایمنی باعث مختل شدن سیستم ایمنی شده که به دنبال آن عوامل عفونی از قبیل ویروس های برونشیت عفونی، انفلوانزای پرندگان، بیماری نیوکاسل و نیز باکتری هایی چون مایکوپلاسما، اشرشیاکولی و غیره موجبات سندرم های تنفسی پیچیده ای را فراهم می سازند. مطالعه حاضر با هدف بررسی هیستوپاتولوژیک وضعیت سرکوب ایمنی در ارگان های لنفاوی چون بورس فابریسیوس، تیموس، طحال و لوزه های سکومی در هنگام بروز سندرم های تنفسی انجام شده است. جهت انجام این پژوهش، نمونه گیری از لاشه ی جوجه های گوشتی 25 تا 30 روزه مربوط به 20 گله مبتلا به سندرم های تنفسی و 5 گله عاری از سندرم تنفسی به عنوان گروه کنترل (4 نمونه لاشه از هر گله) صورت گرفت. پس از اخذ تاریخچه گله و درجه بندی وضعیت بیوسکیوریتی و مدیریت گله و نیز درجه بندی ضایعات کالبدگشایی، بافت بورس فابریسیوس و طحال جدا گردید و توسط بورسامتر اندازه گیری شد. سپس از اندام های تنفسی نظیر نای و همچنین بافت های لنفاوی شامل بورس فابریسیوس، تیموس، طحال و لوزه های سکومی نمونه های بافتی تهیه گردید. ارزیابی هیستوپاتولوژیک بافت ها بر اساس درجه بندی ضایعات احتمالی در هر کدام از آن ها به تفکیک انجام شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که میانگین اندازه ی بورس و طحال در گروه بیمار به طور معنی داری کوچک تر از گروه کنترل بود، ضایعات کالبدگشایی در نای، کیسه های هوایی و لوزه های سکومی در گروه بیمار به طور معنی دار شدیدتر از گروه کنترل بود، در حالی که ضایعات کالبدگشایی ریه در گروه بیمار و کنترل تفاوت معنی داری نداشتند. در بررسی پاتولوژیک ضایعات و مقایسه با گروه کنترل منفی، مشخص شد که ضایعات موجود در نای، بورس فابریسیوس، طحال، تیموس و لوزه های سکومی در گروه بیمار به طور معنی داری بیشتر و شدیدتر از گروه کنترل بود. نقش مدیریت و بیوسکیوریتی در هیچ یک از پارامترهای مورد بررسی در گروه های بیمار، تفاوت معنی داری با گروه های کنترل منفی نشان نداد. بر اساس مطالعه انجام شده، سرکوب ایمنی به عنوان یک جزء پنهانی و پایدار در اتیوپاتوژنز سندرم های تنفسی در گله های مورد بررسی شناخته شد و نقش مهمی در بروز سندرم های تنفسی ایفا می کند.

ویروس نفریت عفونی سبب ایجاد بیماری تحت بالینی با واگیری بالا در جوجه های جوان می شود که به کلیه ها آسیب می رساند. مطالعه حاضر، در جهت تعیین توالی و آنالیز فیلوژنتیکی ژنوم کپسید سروتیپ یک ویروس نفریت عفونی می باشد. نمونه گیری مربوط به دو گله جوجه گوشتی بود. جوجه های مورد مطالعه دارای علائم اسهال، کاهش رشد، عدم یکنواختی در سطح گله، بی حالی و افسردگی بودند. برخی از نمونه ها از جوجه هایی اخذ گردید که هیچ گونه علائم بالینی خاصی را نشان نمی دادند. نمونه گیری از مدفوع صورت گرفت و پس از هموژن با استفاده از rnx، rna استخراج گردید. سپس با استفاده ازپرایمر های اختصاصی ازrna استخراجی،cdna تهیه گردید و pcr انجام شد و الکتروفورز به عمل آمد. جهت انجام تعیین توالی، محصول pcr ارسال گردید. کروماتوگرام خام توالی ها جهت ویرایش و تعیین توالی پروتئینی با استفاده از نرم افزارclc main workbench 5 دریافت گردید. علی رغم تلاش زیاد نتوانستیم کل ژنوم کپسید anv1 را توالی یابی کنیم. این شکست نشان دهنده تنوع بالا در ژنوم کپسید این ویروس همانند سایر آستروویروس ها می باشد. صحت این مطلب در پژوهش ما با شناسایی سه گروه مختلف anv2 در گله شماره یک و یک گروه مطعلق به anv2 در گله شماره دو به اثبات رسید.مطالعه حاضر اولین گزارش anv2 در خاورمیانه است. برای اثبات این استنتاج نسبتا منطقی توالی یابی محصولات pcr انجام شد. قدم بعدی جداسازی ویروس و تکثیر و تعیین توالی آن با استفاده از پرایمر های رندوم و تطبیق توالی های در کنار یکدیگر است.

باکتری کلستردیوم پرفرنجنس عامل بیماری آنتریت نکروتیک و درماتیت قانقاریایی در طیور می باشد. همچنین انتروتوکسین باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس به عنوان عامل مسمومیت غذایی در انسان مطرح است.این بیماری‎ها می‎توانند مشکلات اساسی را در صنعت طیور ایجاد کنند.هر دو بیماری آنتریت نکروتیک و درماتیت قانقاریایی باعث ایجاد خسارات زیادی به علت مرگ و میر،کاهش عملکرد و نیز حذف لاشه طیور می‎شوند از طرفی مسمومیت غذایی ناشی از انتروتوکین این باکتری، به عنوان یکی از مهمترین بیماری‎های انتقال یافته از طریق آلودگی غذایی در امریکا می باشد.بیماری‎زایی این باکتری به توانایی آن در تولید توکسین‎های متنوع و زیاد بر می‎گردد.این باکتری بر اساس تولید 4 توکسین اصلی(آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا) به 5 تیپ a-e تقسیم بندی می شود.که بیماری های نام برده اکثرا توسط تیپ a ایجاد می‎شوند البته ایزوله های‎ جدا شده از طیور از نظر تولید انتروتوکسین شناخته شده نیستند. برای مدت ها فرض بر این بود که آلفا توکسین باکتری کلستردیوم پرفرنجنس که توسط تیپ a تولید می‎شود نقش مهمی در ایجاد بیماری آنتریت نکروتیک دارد. مطالعات اخیر نشان می‎دهد که آلفا توکسین نقش اساسی در ایجاد بیماری آنتریت نکروتیک طیور ندارد.بر اساس مطالعات جدید توکسین جدید netb به عنوان یک عامل حدت در بعضی از ایزوله‎های جدا شده می‎باشد.شواهد همچنان پیشنهاد می‎دهد ایزوله‎هایی که علاوه بر توکسین netb از نظر توکسین جدید tpelنیز مثبت می‎باشند حدت بالاتری نسبت به ایزوله‎هایی که تنها از نظر توکسین netb مثبت می‎باشند، دارند.بر اساس مطالعات صورت گرفته در کشور‎های مختلف، ژن netb اکثرا از گله‎های درگیر با بیماری آنتریت نکروتیک جداسازی شده است اگرچه موارد اندکی هم از ردیابی این ژن در گله های سالم گزارش شده است. هدف از این مطالعه بررسی حضور ژن توکسین‎های اصلی و توکسین‎های netb و tpel در 36 ایزوله جداشده از 16 گله شتر‎مرغ در گیر با بیماری آنتریت نکروتیک و 20 گله سالم از لحاظ این بیماری می‎باشد.بر اساس نتایج حاصله،توکسین آلفا در تمام ایزوله‎های یافت شد.28 ایزوله از لحاظ توکسین cpb2 مثبت بودند و ژن netb در 8 ایزوله از 16 ایزوله(50 درصد) جدا شده از موارد بیماری یافت شد و هیچکدام از ایزوله‎های جدا شده از موارد سالم واجد ژن netb نبودند.ژن توکسین tpel نیز در 6 جدایه مربوط به موارد بیماری(37.5 درصد) و 2 ایزوله از موارد سالم(10درصد) یافت‎شد.با مقایسه فراوانی ژن netb و tpel در گله‎های سالم و بیمار بر اساس آزمون دقیق فیشر،در مورد توکسین tpel تفاوت معنی داری بین این دو گروه مشاهده نشد(p=0.103)اما در مورد ژن netb معنی دار بود. (p<0.001).این نتایج نشان می دهد netb فاکتوری مهم در ایجاد و پیشرفت بیماری آنتریت نکروتیک در بسیاری از ایزوله‎های کلستریدیوم پرفرنجنس می‎باشد و احتمالا برای تعیین نقش توکسین tpel نیاز به مطالعات بیشتری برای بررسی شیوع این ژن در مقیاس جهانی می باشد.

مطالعه حاضر با هدف بررسی کیفیت بیهوشی و زمان هوشیابی در بیهوشی ایجاد شده با داروهای ایزوفلوران و پروپوفول در کبوتر انجام شده است. تعداد 20کبوتر نر و ماده از یک نژاد مشابه (کبوتر خانگی columba livia domestica) در دو گروه ده تایی ایزوفلوران و پروپوفول، بیهوش شدند. گروه اول گروه ایزوفلوران: بدون پیش بیهوشی، پرنده با استفاده از ماسک به دستگاه بیهوشی متصل گردید و با استفاده از ایزوفلوران 5% القای بیهوشی صورت گرفت. سپس در داخل نای لوله نایی فاقد کاف قرار داده و برای ادامه بیهوشی به مدت 30دقیقه حیوان از ایزوفلوران (بین 3- 2%) استفاده شد. گروه دوم گروه پروپوفول: بدون پیش بیهوشی، پروپوفول 10% به میزان 14 میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن توسط آنژیوکت زرد رنگ (شماره 24) که در ورید زیر بال قرار داده شد، به صورت وریدی و آهسته تزریق گردید تا القای بیهوشی صورت گیرد. سپس در داخل نای لوله نایی فاقد کاف قرار داده شد و به اکسیژن کمکی متصل گردید. برای ادامه بیهوشی در طول 30دقیقه از پروپوفول به میزان 33/1میلی گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن در هر دقیقه به صورت انفوزیون با پمپ مخصوص(syring pump jsm sp-510) استفاده شد. دمای بدن(کلوآکی) ، تعداد ضربان قلب در دقیقه، تعداد تنفس در دقیقه و میزان اشباع نسبی اکسیژن هموگلوبین شریانی (spo2) در هر دو رژیم بیهوشی قبل از القا بیهوشی و در دقایق 1، 3، 5، 10، 15، 20، 25، 30 بعد از القا و همچنین در پایان دوره هوشیابی ثبت گردید. جهت مقایسه 2 گروه از نظر پارامترهای مورد بررسی در طول زمان مطالعه از تست آماری independent samples t-test و نیز برای بررسی تغییرات این پارامترها بین زمان های مختلف اندازه گیری در هر گروه، از تست آماری repeated measure anovaاستفاده شد و مقادیر p<0.05 معنی دار تلقی گردید. در مطالعه حاضر به دنبال مقایسه دو گروه از کبوتران بیهوش شده با پروپوفول و ایزوفلوران نشان داده شد که کبوتران بیهوش شده با ایزوفلوران بیهوشی آرام و سریعی داشتند اما در کبوتران بیهوش شده با پروپوفول القا بیهوشی نامنظم بود و برای همه کبوتران یکسان نبود. بنابراین میتوان اینگونه بیان نمود که پروپوفول برای کبوتران دارای پنجره امن کوچکی است و با اندکی تغییر در مقدار دارو القا کننده یا نگهدارنده بیهوشی، مشکلات تنفسی و قلبی بروز می کند. لذا شدیدا توصیه می شود برای کاهش اثرات سو ناشی از پروپوفول، وضعیت کبوترها کاملا نظارت شود و همچنین تنفس حمایتی طی بیهوشی داشته باشند. اما در مجموع ایزوفلوران برای بیهوشی کبوتران گزینه مناسب تری است.

صنعت طیور یکی از بزرگ ترین صنایع پیشرو با اشتغال زایی بالا در ایران است، از این رو بررسی عوامل تهدید کننده آن بسیار حائز اهمیت است. همچنین طیور غیر صنعتی ( شامل: طیور زینتی، کبوتران و .... ) اخیراً جایگاه ویژه ای را در جوامع رو به توسعه از جمله ایران از نظر اقتصادی، اشتغال زایی و سرگرمی و حتی به عنوان مدل آزمایشگاهی پیدا کرده اند. مایکوپلاسما یکی از عوامل پاتوژن می باشد که سالانه موجب خساراتی در گله های طیور ودیگر پرندگان می شود. از این رو زمینه بررسی عوامل تاثیرگذار بر سلامت این پرندگان نیز پر اهمیت است. به پرندگان آسیب می رساند. این مطالعه بر روی پرندگان و همچنین لاشه های ارجاعی به بخش تخصصی طیور دانشکده دامپزشکی مشهد انجام پذیرفت. نمونه ها در دو تکرار به روش استاندارد سازمان بهداشت جهانی دام oie)) در محیط مایع pplo کشت داده شدند. سپس موارد مثبت به جهت بدست آوردن تک کلونی برروی محیط جامد pplo کشت داده شدند. استخراج dna به روش جوشاندن انجام گردید. با استفاده از pcr اختصاصی جنس با محصول 1013 جفت باز از ژن 16s rdna تعیین هویت در سطح جنس انجام شد. با پرایمر های اختصاصی گونه مایکوپلاسما که در اختیار بود مورد بررسی قرار گرفتند و مواردی که جدایه با هیچکدام از پرایمر های اختصاصی شناسایی نشد با آنالیز سکانس محصولات 1013 جفت بازی از ژن 16s rdnaو با مقایسه سکانس های ثبت شده در بانک ژن مورد بررسی و تعیین هویت قرار گرفت. طی این مطالعه 3 گروه پرندگان شامل: ماکیان، کبوترسا نان و پرندگان شکاری مورد بررسی قرار گرفتند. 60 نمونه تجمعی (pooled sample) از طیور شامل20 گله مرغ صنعتی گوشتی، 15 گله مرغ تخمگذار و 10 گله مرغ بومی، 8 گله شترمرغ و 7 گله بوقلمون بودند.که از پرندگان زنده سواب شکاف سقفی دهانی، مدخل نایی و از پرندگان مرده سواب نایی وکیسه های هوایی اخذگردید. از این گله ها به ترتیب 12، 5، 9، 2 و 3 نمونه در بررسی های باکتریولوژی و مولکولی مثبت بودند. در پرندگان در سطح گونه،12 نمونه m. iowae ، 6 نمونه m. meleagridis،10 نمونه m. synoviae،13 نمونه m. gallisepticum به روش pcr اختصاصی و 2 نمونه m. gallinaceum،2 نمونه m.gallopavonis، 2 نمونه m. verecundum،2 نمونه m. columborale با روش آنالیز سکانس وجود داشتند. در کبوتران 5 تا از16 نمونه برمبنای سکانس نوکلئوتیدی و در مقایسه با سکانس های ثبت شده در بانک ژن مثبت بودند. 4 نمونهm. cloumborale و 1 نمونه m. gallinaceum بودند. از43 نمونه جداشده از پرندگان شکاری مختلف، 11 نمونه بر اساس کشت و همچنین pcr اختصاصی مثبت بودند.2 نمونه mycoplasma buteonis، 4 نمونه mycoplasma falconis و 5 نمونه هم به هردو آلوده بودند.

کلستریدیوم پرفرنجنس یک باکتری گرم مثبت، بی هوازی و اسپوردار میباشد که در همه جا یافت گردیده و در پزشکی و دامپزشکی حائز اهمیت میباشد و به عنوان گسترده ترین پاتوژن در طبیعت شناخته شده است. این باکتری غالبا در روده مرغان سالم یافت می گردد اما می تواند در شرایطی خاص باعث ایجاد بیماری در بسیاری از گونه های پرندگان به خصوص درمرغان و بوقلمون و شترمرغ گردد. ورم روده نکروتیک شدیدترین بیماری روده ای باکتریایی در طیور میباشد که توسط کلستریدیوم پرفرنجنس ایجاد میشود وصنعت طیور سراسر جهان را متاثر کرده و یک مشکل جهانی محسوب میگردد. توانایی کلستریدیوم پرفرنجنس در ایجاد بیماری با تولید سموم و آنزیم های خارج سلولی همراه است.در نظام معمول طبقه بندی، کلستریدیوم پرفرنجنس بر اساس توانایی تولید 4 توکسین اصلی (آلفا، بتا، اپسیلون و بتا) به 5 تیپ (a-e) طبقه بندی میشود که هر تیپ ترکیب متفاوتی از ژن های توکسین را دارا میباشد. توجه و تمرکز اخیر بر نقش گسترده از استفاده ی آنتی بیوتیک ها در رشد ودرمان عفونت¬های غذایی تولید شده از حیوانات و پتانسیل¬های انتقال وتعیین مقاومت میکروب¬ها در زنجیره¬های غذای انسانی بوده است .به عنوان یک نتیجه¬ی منطقی بیشتر مقاومت¬ها معمولا در مکان¬هایی که استفاده¬ی زیاد از آنتی بیوتیک ها وارتباط محسوس میزبان به میزبان وجود دارد دیده شده است .انسان ها وحیوانات در یک ارتباط نزدیک با شمار زیادی از باکتری ها هستند و این باکتری ها در روده¬ی بزرگ یافت می شوند جایی که در معرض آنتی بیوتیک¬های زیادی قرار گرفته به گونه¬ای که مواد ژنتیکی آنها با سایر باکتری-ها مبادله شده و این باکتری ها از طریق مدفوع می توانند محیط یا حیوان دیگر را آلوده کنند. بنابراین برای جلوگیری از افزایش مقاومت باکتری¬ها نیاز به دانستن کمترین میزان جلوگیری کننده از رشد باکتری ضروری می¬باشد. در این تحقیق سعی شد که mic کلستریدیوم پرفرنجنس در برابر 8 عامل ضد میکروبی بررسی شود که میزان مقاومت به این عوامل از بیشترین به کمترین عبارتند از: سولفادیمیدین و نئومایسن 5/92% ، سولفادیازین 80%، پنی¬سیلین 5/52%، تتراسایکلین 5/37%، فلورفنیکل5/27%، سفازولین 5/22% و سفتری اکسون 20% می¬باشد.

1.امتیاز دهی به لاشه های مبتلا به انتریت نکروتیک: موارد درگیر بر اساس علایم کالبدگشایی موجود در روده بویژه ژژنوم شناسایی شده و با توجه به شدت جراحات امتیاز دهی میشود 2-جمع آوری تاریخچه کامل گله،توسط پرسشنامه. 3-جداسازی،کشت و تایپینگ: 1-جداسازی باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس ازروده مرغ های تلف شده و یا درگیر با فرم حاد بیماری آنتریت نکروتیک که در این طرح شامل ده نمونه در طول یک سال میشود . 2- جداسازی باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس ازروده مرغ های سالم و یا تلف شده بر اثرعواملی غیر از آنتریت که در این طرح شامل ده نمونه در طول یک سال میشود . 3- شناسایی حضور و یا عدم حضور ژن های توکسین cpa، cpb، etx وia ژن های مربوط به 4 توکسین اصلی آلفا، بتا، اپسیلون و یوتا که در تایپینگ مولکولی ایزوله های کلستریدیوم پرفرنجنس به کار گرفته میشوند و همچنین حضور و یا عدم حضور دو ژن توکسین cpe وcpb2 که به ترتیب مربوط به کلستریدیوم پرفرنجنس انتروتوکسین و بتا2 توکسین می باشند، با آزمایش multiplex pcr. 4- تعیین حضور یا عدم حضورژن netb در بین جدایه های کلستریدیوم پرفرنجنس جدا شده از گله های بیمار و سالم بوسیله آزمایش single pcr. تعیین حضور یا عدم حضورژن tpel در بین جدایه های کلستریدیوم پرفرنجنس جدا شده از گله های بیمار و سالم بوسیله آزمایش single pcr 5- مقایسه ی گله های سالم و درگیر با بیماری آنتریت نکروتیک از نظر مثبت یا منفی بودن در مورد وجود یا عدم وجود این توکسین ها. برای جداسازی باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس از لاشه مرغ های مبتلا به آنتریت نکروتیک مراجعه داده شده به بخش طیور کلینیک دانشکده دامپزشکی ، بعد از کالبدگشائی و مشاهده جراحات تیپیک ، قسمتی از روده را که بیشتر درگیر است انتخاب نموده، ابتدا و انتهای قسمت مورد نظر را با نخ تمیز محکم گره زده و روده را از دو طرف گره ها قیچی می کردیم. سپس قطعه مورد نظر را به داخل آزمایشگاه منتقل ودر زیر هود و در مجاورت شعله عملیات مربوط به جداسازی باکتری را ادامه می دادیم. ا بتدا سطح سروزی روده لاشه های مبتلا تو سط تیغه اسپاتول داغ استریل می گردید . سپس موضع بوسیله بیستوری استریل برش داده می شد و توسط یک لوپ استریل مخاط روده تخریش و پس از تهیه گسترش میکروبی و انجام رنگ آمیزی گرم زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار می گرفت. شناسائی باکتری بر اساس روش های تشریح شده توسط سومانن و همکاران ( 1993 )، کوئین و همکاران ( 1994 ) و میلر وهمکاران ( 1998 ) صورت پذیرفت . در صورت مشاهده باسیل های گرم مثبت حاوی اسپور، تشخیص احتمالی اولیه بر مبنای کلستریدیوم پرفرینجنس قرارمی گرفت. برای جداسازی کلنی کلستریدیوم پرفرینجنس از نمونه هائی که در رنگ آمیزی گرم مثبت بودند بر روی پلیت آ گار خوندارحاوی7% خون دفیبرینه گوسفند کشت خطی داده می شد. سپس پلیت ها کشت داده شده در داخل جار بیهوازی (anaerobic jar, merck, germany ) بصورت وارونه قرار داده شدند. سپس گازپک a (anaerocult a, merck) در داخل جار بی هوازی قرارداده می شد و پس از ریختن 35 سی سی آ ب مقطر بر روی سطح گازپک برای شروع واکنش جذب اکسیژن، بلافاصله درب جار بی هوازی بسته و این جارها در انکوباتور به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده می شدند. برای تائید شرائط بیهوازی از استریپ های اندیکاتور در هر جار استفاده می گردید . (anaerotest, merck) بعد از این مدت درب جار را در زیر هود و کنار شعله باز و پلیت ها را مشاهده می کردیم. از کلونی های بزرگ صاف و گرد با قطر 2 تا 4 میلیمتر که ایجاد همولیز دو گانه (همولیز کامل در ناحیه داخلی و همولیز ناقص در ناحیه بیر ونی ) کرده بودند، جهت رنگ آمیزی گرم نمونه بر می داریم. باسیل های گرم مثبتی که در شرایط بیهوازی در آگار خوندار همولیز دو گانه ایجاد می کردند به عنوان باکتری کلستریدیوم پرفرنجنس مشخص می گردیدند . برای تائید تشخیص اولیه وهمچنین جداسازی کلنی خالص کلستریدیوم پرفرینجنس (در صورت خالص نبودن کشت اولیه) از نمونه هائی که بر روی پلیت آ گار خوندار همولیز دو گانه ایجاد کرده و در رنگ آمیزی گرم، باسیل گرم مثبت بودند بر روی محیط های اختصاصی رشد کلستریدیوم پرفرنجنس یعنیtsc یا tsn آگار کشت داده می شدند. بعد از کشت خطی بر روی پلیت های حاوی این محیط ها ، کلنی هائی با هسته مرکزی تیره رنگ مشاهده میشوند که بیانگر حضور باکتری کلستریدیوم پرفرینجنس می باشد. از کلونی های ذکرشده گسترش تهیه کرده و بس از رنگ آمیزی و مشاهده در زیر میکروسکوپ، اگر باسیل های گرم مثبت تیپیک کلستریدیوم پرفرنجنس به صورت خالص مشخص گشتند و نیازی به کشت مجدد نداشتند، برای نگهداری باکتری در 70- ، یک تک کلونی تیپیک در یک محیط براث مانند bhi به صورت بیهوازی کشت داده می شد و در 37 درجه به مدت24 ساعت انکوبه می گردید و پس از آن از محیط براث حاوی باکتری برداشت نموده و پس از ترکیب با گلیسرین در میکروتیوپ های مخصوص جهت نگهداری در فریزر 70- ، استفاده می شد. استخراج dna به روش boiling کریوتیوپ های جدایه های کلستریدیوم پرفرنجنسی که درفریزر 70 - نگهداری می شوند را خارج کرده، ابتدا برای چند ساعتی در فریزر 20- قرار داده وسپس در محیط آزمایشگاه قرارمیدادیم تا شوک ناشی از اختلاف دمای فریزر 70 – و محیط باعث از بین رفتن باکتری نشود. یک قطره از نمونه هایی که در محیط bhi به همراه گلیسرول در کریوتیوپ نگهداری می شوند در زیر هود لامینارو کنار شعله با آنس برداشت نموده و در محیط بلاد آگار یا tsn در شرایط بی هوازی کشت می دادیم. بعد از 24 ساعت یک تک کلونی تیپیک از باکتری را با آنس برداشت نموده و در 1 سی سی سرم فیزیولوژی موجود در میکروتیوپ 1.5 سی سی که از نوع dna &rna free بود کاملا حل کرده تا محلول کدری حاصل شود. برای بهتر حل شدن چند ثانیه مخلوط را ورتکس می کردیم. سپس با دور xg3000، 1 تا 5 دقیقه سانتریفیوژ کرده، باکتری ته میکروتیوپ جمع شده و مواد دیگر مثل آگار بالا می ماندند. محول رویی را خالی کرده دوباره 1 سی سی سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرده و عمل شستشو را تکرار میکردیم تا موادی که ممکن است همراه باکتری برداشت کرده باشیم را حتی الامکان خارج نماییم. بعد از این که عمل شستشو را 2-3 بار تکرار کردیم و تخلیه نهایی محلول رویی ، 200 سی سی آب مقطر 2 بار تقطیر استریل اضافه میکردیم .دیواره باکتری ترکیده می شد.در این جا نیز مخلوط را خوب ورتکس می کردیم. سپس میکروتیوپ ها را در بن ماری یا حمام 100 درجه به مدت 20 دقیقه قرار میدادیم. در اینجا بهتر است بر روی درب میکروتیوپ ها به منظور پیشگیری از باز شدن در حین جوش در اثر فشاربخار با سوزن استریل سوراخ کوچکی ایجاد بنمائیم. بعد از جوشیدن بلافاصله میکرتیوپ ها را در فریزر 20- قرار می دادیم تا یک شوک حرارتی حاصل شود. سپس 10 دقیقه در دورxg 10000 سانتریفیوژ میکردیم، dna استخراج شده در بالای محلول قرار می گیرفت و پلیتی از مواد زاید در ته میکروتیوپ تشکیل می شد. محلول رویی را به آرامی با سمپلر برداشت کرده به طوریکه به پلیت تشکیل شده برخوردی نکند و در یک میکروتیوپ 0.5 سی سی dna &rna free نگهداری می کردیم تا در واکنش pcr از آن استفاده نماییم.

در این تحقیق بافت شناسی چشم و هیستوشیمی غده هاردرین در پنج قطعه مرغ مینای معمولی بالغ مورد بررسی قرار گرفت. پس از ذبح و خونگیری، چشم به همراه غده هاردرین از حدقه خارج شده، پس از گذراندن مراحل ثبوت و آماده سازی از چشم مقاطع بافتی تهیه و با رنگ آمیزی های هماتوکسیلین- ائوزین، پریودیک اسید شیف و آلسین بلو رنگ آمیزی گردید. نتایج نشان داد که در مرغ مینا لایه های بافتی چشم مشابه سایر پرندگان می باشد و از لایه های فیبروزی در خارج، لایه عروقی در وسط و لایه عصبی در داخل تشکیل شده است. در قسمت قدامی چشم همانند سایر پرندگان در محل اتصال صلبیه به قرنیه بافت استخوانی وجود دارد.قرنیه دارای استرومای ضخیم و غشاهای بومن و دسمه مشخصی می باشد. لایه عروقی از سه قسمت مشیمیه، جسم مژگانی، و عنبیه تشکیل شده است. مشیمیه پرده ای پر از عروق و به رنگ قهوه ای تیره است که از سه قسمت استروما، طبقه کوریوکاپیلر و پرده بروخ تشکیل شده است. جسم مژگانی از بافت همبند سست و عضلات صاف تشکیل شده است. شبکیه داخلی ترین لایه کره چشم است و از دو لایه اپی تلیوم رنگدانه ای و لایه عصبی تشکیل شده است. غده هاردرین در مرغ مینا کشیده و نامنظم بوده و در سمت شکمی- میانی و در پشت کره چشم قرار دارد. لبه پشتی آن مقعر و دارای انحنا در ناحیه میانی است. لبه شکمی غده محدب می باشد. لبه داخلی آن گرد بوده و لبه جانبی آن کشیده و نوک تیز می باشد و در مجاور عصب بینایی قرار دارد. شکل واحد های ترشحی آن در مرغ مینا از نوع لوله ای- آلوئولی و نوع سلول های آن استوانه ای ساده است که در یک ردیف قرار گرفته اند. در بین واحد های ترشحی تعداد زیادی پلاسماسل قرار دارد که نقش مهمی در سیستم ایمنی بدن دارد. نحوه ی ترشح این غده به نظر می رسد که مروکراین یا آپوکراین بوده و به دلیل داشتن هر دو نوع موکوپلی ساکارید های خنثی و اسیدی به رنگ آمیزی های اختصاصی آلسین بلو و پاس واکنش مثبت نشان داد.

اکثر انتروکوک ها میزبان طبیعی دستگاه گوارش پرندگان، پستانداران و انسان هستند. امروزه با شیوع انتروکوک های مقاوم به آنتی بیوتیک ها و با پخش جهانی در پرنده ها و افزایش بیماری های مربوط به انتروکوک ها به خصوص انتروکوکوس فکالیس، انتروکوکوس فیسیوم، انتروکوکوس دورانس و انتروکوکوس هیره، که باعث بیماری های اندوکاردیت، سپتمی سمی حاد، عفونت های کیسه زرده، سلولیت، تورم پلک و ملتحمه، آرتریت، آمیلوئید مفصلی، استئومیلیت، سالپنژیت و سالپنژیت ـ پریتونیت که باعث ایجاد خسارات به علت مرگ و میر، کاهش عملکرد و نیز حذف لاشه های طیور می‎شوند. هدف این مطالعه جدا سازی انتروکوکوس ها از کلواک و محوطه دهانی پرندگان (ماکیان، طوطی سبز، دلیجه، سار، عقاب طلایی، کلاغ، مینا، کبوتر، قناری، فنچ آفریقایی، طوطی برزیلی، طوطی استرالیایی، اردک، طوطی کاسکو، کاکاتیل، بلبل هزار دستان، یاکریم، بالابان، قرقاول، کبک) و تعیین هویت تا حد گونه به روش تست های بیوشیمیایی، و همچنین تعیین الگوی مقاومت به انتی بیوتیک ها به روش دیسک دیفیوژن در گونه های ایزوله شده بود. در این مطالعه 56 گونه ایزوله جداسازی و تعیین هویت گردید که بیشترین گونه ایزوله به ترتیب انتروکوکوس فکالیس 67.8%، سپس انتروکوکوس فاسیوم 17.9%، انتروکوکوس موندتی 7.2%، انتروکوکوس گالیناروم 3.5%، انتروکوکوس رافینوسوس 1.8% و انتروکوکوس مالودراتوس 1.8% مشخص گردید. که از این 56 ایزوله 64.3% از پرندگان سالم و 35.7% از پرندگان بیمار با علائم اسهال، عدم وزن گیری، بی حالی و ژولیدگی پرها و عفونت تنفسی که به بیمارستان دامپزشکی مشهد مراجعه نموده، ، که %71.4 جدایه ها مربوط به نمونه های اخذ شده از کلواک و 28.6% از محوطه دهانی بوده است. همچنین در تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیک به روش دیسک دیفیوژن انتروکوک ها به ترتیب بیشترین مقاومت دارویی به آنتی بیوتیک های سفازولین، سفتریاکسون،سفالکسین، فلومکوئین، تیامولین، اکسی تتراسایکلین، استرپتومایسین، و بیشترین حساسیت به آنتی بیوتیک های آموکسی سیلین و فلورفنیکول مشاهده گردید.

اگرچه برای تشخیص و مانیتورینگ بیماری ها در پرندگان آنالیز بیوشیمیایی لازم می باشد، ولی به دلیل حجم کم نمونه خونی که از پرندگان جهت آنالیز به دست می آید تشخیص آزمایشگاهی محدود شده است. در نتیجه روش مناسبی که نیاز به حجم کمی از خون دارد باید به کار گرفته شود. در این تحقیق تعداد30 قطعه کبوتربا سن بالای شش ماه با میانگین وزن 350 گرم(50± گرم) پس از ارزیابی بالینی و خون شناسی و اطمینان از سلامت آن ها انتخاب شدند. به منظور اندازه گیری میزان گلوکز خون با یک گلوکومتر تجاری و مقایسه ی نتایج حاصل از آن با یک روش استاندارد در شرایط نرمال، هیپوگلیسمی و هیپرگلیسمی، دو تجربه طراحی شد. در تجربه ی اول برای ایجاد شرایط نرمال، 30 قطعه کبوتر (columba livia domestica)یک شب ناشتا قرار داده شدند و روز بعد نمونه های خون از ورید بالی آن هابه دست آمد. میزان گلوکز خون توسط یک گلوکومتر استاندارد تجاری (accu-chek active) در یک قطره خون اندازه گیری شد و باقی مانده ی نمونه ها به منظور اندازه گیری هماتوکریت، شمارش تعداد کل گلبول های قرمز و جدا کردن پلاسما داخل لوله های هپارینه ریخته شد. اندازه گیری هماتوکریت و شمارش تعداد گلبول های قرمز به روش دستی و سنجش میزان گلوکز پلاسما توسط دستگاه اتوآنالایزر (biotecnica, targa 3000)صورت گرفت. تجربه ی دوم در دو گروه 15 تایی در شرایط هیپوگلیسمی و هیپرگلیسمی انجام شد. برای ایجاد شرایط هیپوگلیسمی، انسولین رگولار (1.5 واحد به هر کبوتر) به یک گروه ناشتا و برای ایجاد شرایط هیپرگلیسمی، محلول گلوکز (70 میلی گرم به ازای 100 گرم وزن بدن کبوتر) به گروه دیگر تزریق داخل وریدی شد. بعد از اخذ نمونه های خون،مشابه تجربه یک سنجش میزان گلوکز خون کامل و پلاسما، تعیین هماتوکریت و شمارش تعداد کل گلبول های قرمز انجام شد. اگرچه نتایج خام گلوکومتر در شرایط نرمال، هیپوگلیسمی و هیپرگلیسمی کم تر از مقادیر حاصل از دستگاه اتوآنالایزر بود، ولی مقادیر حاصل از دو روش توسط آنالیز رگرسیون خطینشان داد که رابطه قوی بین نتایج گلوکومتر و اتوآنالایزر در سه شرایط وجود دارد (شرایط نرمال: 0.018=p؛ 0.43=r، شرایط هیپوگلیسمی: 0.001>p؛ 0.95=r، شرایط هیپرگلیسمی: 0.001>p؛ 0.81=r). به دنبال بررسی توسط آزمون رگرسیون خطی، فرمول های زیر جهت همخوانی نتایج گلوکومتر با نتایج دستگاه اتوآنالایزر در شرایط ذکر شده محاسبه گردید: مقدار گلوکز سنجش شده با اتوآنالایزر در شرایط نرمال= 225.7 + (0.401×نتایج گلوکومتر) مقدار گلوکز سنجش شده با اتوآنالایزر در شرایط هیپوگلیسمی= 3.423 + (1.278×نتایج گلوکومتر) مقدار گلوکز سنجش شده با اتوآنالایزر در شرایط هیپرگلیسمی= -18.184 + (1.433×نتایج گلوکومتر) نتایج این مطالعه پیشنهاد می کند که ما می توانیم میزان گلوکز خون واقعی و صحیح کبوترها را با استفاده از نتایج گلوکومتر و فرمول های به دست آمده از رگرسیون با دقت بالایی پیش بینی کنیم.

کلی باسیلوز یکی از شایع ترین بیماری های باکتریایی است که خسارات اقتصادی فراوانی را به صنعت طیور وارد می کند. علاوه بر اهمیت اقتصادی، این بیماری از لحاظ بهداشت عمومی و قابلیت زئونوز بودن نیز بسیار حائز اهمیت است.در مطالعه حاضر به منظور آنالیز فیلوژنتیکی جدایه های اشریشیاکلی، تعداد 170 نمونه مورد بررسی قرار گرفت. نمونه های مورد نظر بر روی محیط کشت مک کانکی آگار و سپس بر روی محیط های کشت بلاد آگار و ائوزین متیلن بلو کشت داده شد. آزمایش استخراج dna به روش جوشاندن صورت گرفت و در نهایت به منظور تعیین گروه فیلوژنتیکی و حدت هر یک از جدایه ها بر طبق مطالعه آقای clermont و همکارانش در سال 2000 آزمایش الکتروفورز در بافر tae و آگار 2% انجام گردید. از تعداد 150 جدایه تهیه شده از جراحات مشخص موضعی و سیستمیک کلی باسیلوز شامل پری کاردیت، پری هپاتیت، عفونت کیسه زرده، سندرم کله بادی و نکروز سر استخوان ران به ترتیب 54 (%8/31)، 37 (%7/21)، 36 (%2/21) و 43 (%3/25) جدایه متعلق به گروه های a، b1، b2 و d بود. بنابراین اکثریت جدایه ها متعلق به گروه فیلوژنتیکی a بوده و سپس گروه d غالب جدایه ها را در میان جدایه های اخذ شده از موارد کلی باسیلوز طیور گوشتی و تخم گذار تشکیل می دهد. همچنین پراکندگی گروه های فیلوژنتیکی در 20 جدایه تهیه شده از مدفوع پرندگان به ظاهر سالم به عنوان گروه کنترل شامل 9 (%45)، 5 (%25)، 1 (%5) و 5 (%25) جدایه بود که به ترتیب متعلق به گروه های a، b1، b2 و d می باشد.

در سال1977، این باکتری به عنوان مهم ترین عامل مولد کولیت با غشـای کاذب ناشی از مصرف آنتی بیوتیک ها شناخته شد. توکسین های a وb مهمترین فاکتورهای حدت c.difficile هستند. امروزه تحقیقات نشان داده اند که حیوانات خانگی و حیوانات پرورشی مزرعه به درجات مختلف می توانند به عنوان مخزنی از آلودگی قابل انتقال به انسان ، نقش ایفا کنند. صنعت پرورش شتر مرغ به عنوان بخشی از صنعت بزرگ طیور پرورشی ، در این مطالعه مورد توجه قرار گرفت. تعداد 100 نمونه ی مدفوع از 10 مزرعه پرورش شترمرغ، واقع در خراسان رضوی، از سنین مختلف گرفته شد. در جریان آماده سازی نمونه ها برای کشت ، آن ها تحت شوک به وسیله ی الکل خالص قرار می گرفتند. برای کشت، از محیط آگار کلمبیای پایه به همراه 5- 7%خون گوسفند استفاده می شد. سپس محیط های کشت داده شده، در دمای c° 37 و تحت شرایط بی هوازی به مدت 72 ساعت انکوبه می شدند. برای شناسایی توالی 16s rdna اختصاصی این گونه و ژن های tcda، tcdb، cdta و/یا cdtb از روش multiplex pcr و برای شناسایی و بررسی ژن tcdc از روش single pcr استفاده شد. تعداد 11 عدد (11%) از نمونه ها بعد از کشت از نظر الگوی رشد، شکل، رنگ، بو و قوام پرگنه ها، و شکل باکتری ها بعد از رنگ آمیزی گرم، آلوده به c.difficile تشخیص داده شدند که از آن تعداد، 10 عدد (10%) به واسطه ی pcr توالی 16s rdna، تأیید شدند. از نظر ژنوتیپ، 5 عدد (50%) از جدایه ها، دارای هر دو ژن tcda و tcdb و 2 عدد (20%) از جدایه ها فاقد ژن tcda و دارای ژن tcdb و سایر جدایه ها (3 عدد) فاقد هر دو ژن tcda و tcdb تشخیص داده شدند. هم چنین تمامی جدایه ها از نظر ژن های مولد cdt (cdta و/یا cdtb) منفی شناخته شدند. به علاوه محصول pcr از نوع 139 جفت- نوکلئوتید در single pcr بدست آمد. با توجه به پروفایل توکسینی به دست آمده در مطالعه حاضر و نتایج تحقیقات حسن زاده و همکارانش مبنی بر جداسازی این باکتری از گوشت شترمرغ، می توان دستگاه گوارش شترمرغ را به عنوان یکی از مخازن آلودگی گوشت این پرنده، به وسیله ی c.difficile در نظر داشت.