فسفر یکی از عناصر مهم و ضروری برای گیاهان محسوب می شود که در رشد، انتقال انرژی، بیوسنتز ماکرومولکول ها، فتوسنتز، تنفس سلولی و به طور کلی سوخت و ساز سلولی نقش اساسی دارد. همچنین فسفر در ترارسانی پیام و تنظیم فعالیت پروتئین ها دخالت دارد. از آنجا که گیاهان فقط قادر به جذب یون فسفات آزاد از منابع فسفر آلی و معدنی می باشند، این عنصر یکی از اصلی ترین عوامل محدود کننده رشد گیاهان به شمار می رود. بهره گیری و استفاده موثر از فسفات آلی نیازمند فعالیت مجموعه ای از آنزیم ها موسوم به اسیدفسفاتازها می باشد که هیدرولیز مونواسترهای فسفات را در محدوده ph اسیدی کاتالیز می‏کنند. atpap26 یکی از آنزیم‏های مهم در بازیابی فسفات از ترکیبات داخل و خارج سلولی است. در این پژوهش، توالی کامل cdna رمزکننده ژن atpap26 پس از همسانه‏سازی، به گیاهان طبیعی، جهش‏یافته در جایگاه ژن atpap26 آرابیدوپسیس تالیانا و همچنین گیاه توتون به عنوان یک میزبان بیانی غیرهمسان منتقل شد و به کمک روش rt-pcr بیان ژن مذکور در گیاهان مختلف مورد بررسی قرار گرفت. در گیاه جهش‏یافته آرابیدوپسیس، تخریب ژن atpap26 موجب افزایش بیان ژن‏های atpap17 و atpap8 و نیز atplp9 شد که پیآمد آن افزایش 5/1 تا 2 برابری در فعالیت فسفاتازی با سوبستراهای pep و plp در مقایسه با گیاهان طبیعی شد. جالب توجه این که تغییرات معنی دار در فعالیت سایر اسیدفسفاتازها بیانگر وجود شبکه‏ای ارتباطی برای هماهنگی جهت حفظ هموستازی فسفات در بین آن‏ها است. افزایش بیان atpap26 و در نتیجه، افزایش فعالیت فسفاتازی در این گیاهان، افزایش حداقل 20 درصدی در محتوای فسفات و در نتیجه افزایش 50 و 30 درصدی بیوماس در گیاهان بیش‏بیانی آرابیدوپسیس و توتون را در پی داشت. همچنین انتقال ژن atpap26 به گیاهان جهش‏یافته آرابیدوپسیس موجب جبران تغییرات در اثر نقص ایجاد شده شد. همچنین نشان داده شد که گیاهان توتون تراریخت در مقایسه با گیاهان طبیعی غیرتراریخت در شرایط کمبود فسفات دارای ریشه اصلی کوتاه تر با انشعاب کمتر و نیز تعداد ریشه های فرعی کمتری هستند، در حالی که چنین فنوتیپی در گیاهان آرابیدوپسیس مشاهده نشد. مشاهده تأخیر در جوانه‏زنی و بروز فنوتیپ کوتولگی در گیاهان تراریخت توتون نشان می دهد که احتمالاً بیوسنتز اسیدجیبرلیک کاهش یافته است، در حالی که گیاهان تراریخت و جهش‏یافته آرابیدوپسیس تغییرات فنوتیپی قابل مشاهده‏ای نشان ندادند. افزایش بیوماس در گیاهان تراریخت در شرایط کمبود فسفات نویدبخش راهکاری مناسب در جهت کاهش آلودگی‏های ناشی از مصرف بی‏رویه کودهای فسفاته و فضولات صنعت مرغداری است.

فسفر از ترکیبات لازم برای ساختارهای بیومولکولها و فرآیندهای سلولی است. گیاهان برای مقابله با کمبود فسفر راهکارهای متفاوتی اتخاذ میکنند. در این رساله بررسیهای فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مطالعات مولکولی متعددی بر روی آرابیدوپسیس تالیانا در شرایط کمبود فسفر صورت گرفته است. براساس تیمار این گیاه در غلظتهای مختلف فسفات بعد از 21 روز از لحاظ فیزیولوژیک تغییرات وزن تر و خشک، تغییرات شکل ظاهری ریشه گیاه، تغییرات مقدار فسفر کل، فسفات آزاد و تغییرات میزان آنتوسیانین بررسی گردید. طول ریشه اصلی، تعداد ریشه های جانبی و مقدار آنتوسیانین در غلظتهای پایین فسفات افزایش یافته است، در حالی که فسفات آزاد و فسفر کل در غلظت های صفر، 2/0و 5/0 میلی‏مولار نسبت به غلظتهای بالاتر کاهش یافته است. بررسی میانگین تعداد ریشههای مویی نشان داد که به جز در تیمار بدون فسفات که بدون ریشه مویین بوده، رابطه معکوسی بین غلظت فسفات و تعداد ریشههای مویی وجود دارد. از آنالیز دادههای فوق چهار حالت تغذیه ای فسفات برای گیاه بدست آمد: تنش فقدان کامل فسفات (صفر میلی مولار)، تنش کمبود فسفات 2/0 تا 5/0 میلیمولار، شرایط فسفات کافی بین 2/1 تا 3 میلیمولار و شرایط فسفات اضافی 5 میلی مولار. الگوی بیان ژنهای رمز کننده اسید فسفاتازها به نامهای pap12، pap1، pap5 گیاهان رشد یافته در محیط تغذیه ای فسفات کافی (+p) با غلظت 5/2 میلی مولار و بدون فسفات (-p) با روش rt-pcr مقایسه ای بررسی گردید. بطور مشخصی، ژن pap5 تنها در تنش فقدان فسفات و pap1 و pap12 در همه شرایط بیان می شدند. به طور کلی، در این تحقیق میتوان گیاهان را از نظر تغذیه فسفات به 4 گروه تقسیم بندی نمود: 1. تنش فقدان فسفات،که در آن وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی در کمترین حد قرار دارند، ریشههای اصلی طویل تر و تارهای کشنده اصلا وجود ندارد. مقدار آنتوسیانین در بیشترین مقدار میباشد، فسفات آزاد و فسفات کل در گیاه در کمترین حد ممکن میباشد. 2. غلظت کمبود فسفات (2/0 و 5/0 میلیمولار)، در این غلظتها وزن تر و خشک ریشه و بخش هوایی تفاوت چندانی با غلظتهای بعدی ندارند اما میزان فسفات آزاد و فسفر کل در گیاه همچنان در حداقل میباشد تا این مرحله همواره مقدار فسفات آزاد و فسفر کل ریشه از بخش هوایی بیشتر میباشد و مقدار آنتوسیانین، طول ریشه اصلی و تعداد ریشههای جانبی وتارهای کشنده هم بالا است. 3. غلظت با فسفات کافی (2/1 تا 3 میلیمولار)، میزان فسفات آزاد تا 30 میکرومول و فسفر کل به بالاتر از 100 میکرومول بر واحد وزن میرسد مقدار آنتوسیانین، طول ریشه اصلی، تعداد ریشه های جانبی وتارهای کشنده به حد متعادلی میرسد. 4. غلظت اضافی فسفات (5 میلیمولار)، گرچه فسفر کل به بالاترین حد میرسد، اما فسفات آزاد در واحد وزن گیاه کمتر شده است، وزن تر وخشک بخش هوایی وریشه کاهش یافته وریشههای جانبی وتارهای کشنده نیز تعداد کمتری دارند. در رابطه با الگوی بیان ژنهای اسید فسفاتاز بررسی شده میتوان دو ژن اسید فسفاتاز pap12,pap1 را جزو ژن هایی دانست که پروتئینهای حاصل از بیان آن ها همیشه مورد نیاز گیاه است. اما بیان ژنهایی مانند pap5 در شرایط بحران و تنش به کمک گیاه میآید تا با استفاده از منابع در دسترس به دوام و بقای گیاه تا از بین رفتن شرایط تنشزا بیانجامد

نوترکیبی ژنتیکی یکی از مراحل مهم در پروسه زندگی سلول ها می باشد. مطالعه بر روی نوترکیبی همولوگ ها می-تواند برای هدف گیری ژن ها و تولید واریته های آپومیکت در گیاهانی مثل ذرت و برنج مورد استفاده قرار گیرد. مهمترین عامل در وقوع این رخداد،عدم وقوع میوز به هنگام تشکیل کیسه های جنینی می باشد. تاکنون تعدادی از ژن های درگیر در نوترکیبی گزارش شده است. تفکیک صحیح کروموزوم ها در طی پروسه میوز بستگی به جفت شدن صحیح کروموزموم ها و تشکیل بی والنت ها در زیگوتن میوز دارد. dmc1 یکی از آنزیم های نوترکیبی و از اعضای خانواده reca/rad51 بوده و نقش مهمی در نوترکیبی میوزی بازی می کند و از ویروس تا انسان محافظت شده می باشد. خاموشی ژن dmc1 می تواند باعث اختلال در تشکیل کمپلکس سیناپتونی و نقص در تشکیل بی-والنت ها و متعاقب آن تفکیک نامتعادل و نامنظم کروموزوم ها در هنگام تشکیل گامت ها شود. بر همین اساس استفاده از فن آوری rnai در بررسی خاموشی این ژن از طریق تولید گیاهان تراریخته هدف گیری شد. به دلیل اطلاعات اندک از ژن های میوزی در ذرت ، در ابتدا طول کامل cdna dmc1 ذرت را از طریق insilico cloning و مقایسه ژن dmc1 برنج با est های ذرت پیدا شد، سپس توالی اسید آمینه آن برای مقایسات فیلوژنتیکی در بین پروکاریوتها ، آرکئوباکتریها و یوکاریوتها به کار رفت. برای تبیین بیشتر نقش dmc1 ساختار و عملکرد محصول این ژن از طریق مطالعات تطبیقی و مقایسه ای آشکار گردید. پس از استنتاج های کلی در خصوص نقش dmc1 قطعه تکثیری از انتهای ´3 اگزون 15 ذرت به طول تقریبی bp400 در ناقل phanibal به سه صورت سنس و آنتی سنس جداگانه و هر دو با هم به عنوان کاست های rnai قرار گرفت. سپس کاست ها بوسیله آنزیم noti از phanibal جدا شده و ناقل های باینری به نامهای part-dmc1-asa, part-dmc1-as , part-dmc1-s جهت انتقال به گیاه توتون ساخته شدند. برگ های توتون بوسیله این سه کاست که حاوی ژن nptii)) مقاومت به کانامایسین بوده، بمباران شده و به طور تدریجی به محیط های حاوی 25 و50 میلی گرم در لیتر کانامایسین جهت گزینش تراریخته از غیر تراریخته، کشت شدند. پس از باززایی، dna گیاهان تراریخته فرضی و شاهد استخراج و با آغازگرهای اختصاصی dmc1 و nptii عملیات pcr انجام گرفت. متاسفانه، علیرغم تکرار آزمایشات هیچ تکثیری با پرایمرهای اختصاصی برای ژن dmc1 در گیاه توتون غیر تراریخته به دست نیامد. بعلاوه، تفاوت معنی داری بین گلدهی و میزان بذور تولیدی گیاهان تراریخته و غیر تراریخته توتون مشاهده نگردید. این موضوع به احتمال زیاد می تواند به خاطر تفاوت در عدم تشابه کامل اگزون 15 ذرت و ناحیه ´3 این ژن در توتون بوده و به همین دلیل وکتور rnai تولید شده در توتون کارآمد نبوده است. بنابراین، تصمیم گرفته شد که حداقل سه کاست ساخته شده به کالوس حاصل از جنین های نارس ذرت (هیبرید سینگل کراس 704) شلیک شده، و فعالیت ژن dmc1 در سطح کالوس مورد مطالعه قرار بگیرد. بدین منظور و بر اساس پتانسیل القایی سیستم rnai در سلولها، پس از سه و هفت روز، rna کل از بافت های مختلف ذرت به عنوان شاهد و کالوس های شلیک شده استخراج گردید. جهت انجام pcr rt- اولین رشته cdna ساخته شد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن dmc1 به مطالعه نیمه کمی بیان dmc1 مبادرت گردید. آغازگرهای اختصاصی ژن اکتین به عنوان ژن کنترل کننده داخلی طراحی و برای نرمال کردن داده های rt به کار رفت. آنالیز ژن dmc1 ذرت در هر دو نوع بافت رویشی و زایشی از خود بیان نشان داد. rt-pcr نیمه کمی و real time pcr نشان داد که تفاوت معنی داری بین بیان نسبی ژن dmc1 در کالوس های شلیک شده با کاست rnai و شاهد وجود دارد. این امر نشان داد که خاموشی با کاست ساخته شده rnai موفق بوده است.

اسید فسفاتازهای ارغوانی(pap) (ec 3.1.3.2) آنزیم های متالوفسفواسترازی هستند که هیدرولیز پیوندهای استری فسفات را در گستره وسیعی از سوبستراها برعهده دارند. در ژنوم آرابیدوپسیس 29 جایگاه ژنی رمز کننده اسید فسفاتازهای ارغوانی شناسایی شده است. به لحاظ ساختاری pap های گیاهی به دو گروه، با وزن مولکولی بالا و پایین تقسیم می شوند. گروه اول به شکل همودایمر فعالند در حالی که گروه دوم که تنها دارای دامین متالوفسفاتاز هستند به شکل منومر فعالیت می کنند. در مقایسه با اسید فسفاتازهای ارغوانی با وزن مولکولی پایین اهمیت زیستی انتهای آمینی و دامین فیبرونکتین و همچنین ساختار دایمری موجود در اسید فسفاتازهای ارغوانی با وزن مولکولی بالا ناشناخته باقی مانده است. در این پژوهش عملکرد ژن های atpap18 و atpap9 با استفاده از روش های مختلف بررسی شده است. این دو ژن به ترتیب hmwو lmw بوده و بیان هر دو در شرایط فقدان فسفات القا شده و هر دو وارد مسیر ترشحی می شوند. بیان فراوان ژن atpap18 منجر به افزایش فعالیت اسید فسفاتازی، ذخایر فسفات و تولید مواد زیستی در گیاهان ترایخت توتون و آرابیدوپسیس گردید. بررسی استقرار سلولی پروتئین atpap18 با استفاده از بیان گذرای این ژن با سازه 35s::atpap18-gfp در سلول های بشره پیاز نشان دهنده استقرار آن در واکوئل و همچنین ترشح آن به خارج از سلول است. آزمایش مشابهی با تراریختی پایدار گیاهان آرابیدوپسیس و سازه 35s::atpap18-gus در محیط واجد فسفات انجام شد. نتایج نشان دهنده حضور رنگ آبی در سلول های تار کشنده و تریکوم و ترشح آن به مقدار زیاد به خارج از این سلول ها بود. در گیاهان آرابیدوپسیس تراریخت شده با سازه 35s::sp18-gus رنگ آبی در محیط واجد فسفات در ریشه ها و در محیط فاقد فسفات در اندام هوایی مشاهده شد. بیان پایدار ژن gfp با استفاده از سازه های 35s::atpap18-gfp و 35s::sp18-gfp در گیاهان آرابیدوپسیس نتایجی مشابه با سازه های دارای ژن gus را ایجاد نمود. همچنین در این پژوهش، وجود دو نسخه متفاوت رونویسی که توسط ژن atpap9 رمز می شود با بررسی لاین های t-dna تایید شد. الگوی بیان هر دو نسخه به طور جداگانه ارزیابی شد. تفاوت نسخه atpap9-2 با نسخه atpap9-1 فقط در انتهای 5 آن است که اهمیت آن مورد بررسی قرار گرفت. الگوی بیان atpap9-1 با اتصال پروموتر آن به ژن گزارشگر gus بررسی شد و نتایج نشان داد که این ژن ویژگی بیان بافتی دارد. نسخه atpap9-1 بیان بالایی در گوشوارک ها و بافت آوندی، به ویژه در پاسخ به آلودگی قارچی دارد. محل استقرار پروتئین atpap9-1 با اتصال آن به ژن gfp مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که این پروتئین در اتصال غشای پلاسمایی به دیواره سلولی درگیر است. این یافته ها همراه با طرح های ساختاری پروتئین atpap9-1 نشان می دهند که این پروتئین احتمالا یکی از اجزای مسیر پیام رسانی است.

آهن و روی دو ریزمغذی ضروری برای رشد گیاهان هستند. خاک های کشاورزی ایران اغلب آهکی بوده و میزان عنصر روی محلول و آهن در دسترس برای گیاهان در آنها کم است. باکتری های حل کننده روی و تولید کننده سیدروفور برای انتقال آهن و روی از خاک به ریشه گیاهان مفید می باشند و گزینه های مناسبی برای استفاده در کشاورزی به عنوان کودهای زیستی به شمار می روند. هدف از این پروژه ارائه روشی مناسب برای جداسازی باکتری های بومی حل کننده روی و تولید کننده سیدروفور است.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.