بررسیهای اخیر در علم پزشکی حاکی از آنست که بدلیل فعالیت سیستمهای ژنتیکی هوشیار در سلولهای میکروارگانیسمهای بیماریزا، گونه های مقاوم نسبت به آنتی بیوتیکهای موجود در حال گسترش روزافزون هستند. از این رو کشف آنتی بیوتیکهای جدید امروزه از شاخه های مهم تحقیقات در علوم دارویی محسوب می گردد. در این تحقیق در ادامه مطالعاتی که پس از شناسایی بر روی سویه ای از گونه streptomyces graminofaciens جدا شده از خاک صورت گرفته بود، شرایط مناسب تولید آنتی بیوتیک توسط این گونه مورد بررسی قرار گرفت . پس از تایید اثر ضدمیکروبی مواد آنتی بیوتیکی بر میکروارگانیسمهای بیماریزای مقاوم، تولید در حجم 15lit و مراحل استخراج و خالص سازی با روشهای مختلف استخراج با حلال، کروماتوگرافی ستونی، ژل فیلتراسیون و preparative tlc بطور متوالی انجام شد. بررسی اثر ضدمیکروبی در هر مرحله با آزمونهای آنتی بیوگرام استاندارد و ردیابی با روشهای شیمیایی (رنگ آمیزی)، فیزیکی (اسپکتروفتومتر uv) و بیولوژیک (بیواتوگرافی)، صورت می گرفت . در نهایت به دو ماده دارای فعالیت ضد میکروبی با ظاهر روغنی، چسبنده و زرد رنگ و وزن تقریبی 1/5-2mg دست یافتیم. خواص فیزیکوشیمیایی، اسپکتروسکوپی و بیولوژیکی این مواد مورد مطالعه قرار گرفت و مشخص گردید که در بین انواع آنتی بیوتیکها، بیشترین شباهت را به خانواده آنتی بیوتیک های ماکرولیدی از خود نشان می دهند. از آنجا که تاکنون آنتی بیوتیکی با طیف اثر گسترده و موثر بر پاتوژنهای مقاوم گرم مثبت ، گرم منفی و ماندیدا از این گونه میکروبی جدا نشده است ، این تحقیق در نوع خود اولین مورد به شمار می رود. با توجه به اهمیت آنتی بیوتیکهای تولیدی این گونه، تعیین ساختار دقیق ملکولی که لازمه آن تولید در مقیاس وسیع تر و بهره گیری از روشهای خالص سازی پیشرفته و روشهای طیف سنجی خاص مواد آنتی بیوتیکی است ، از اهداف آینده برای ادامه این تحقیق شمرده می شود.

آنزیم اوره آز از دسته آنزیمهای هیدرولاز می باشد که هیدرولیز اوره (سوبسترای اصلی) را کاتالیز کرده و باعث آزادسازی آمونیاک و co2 می گردد. این آنزیم که در کیت های آزمایشگاهی برای اندازه گیری اروه در سرم کاربرد فراوان دارد یکی از پروتئینهای موجود در دانه لگومینوزها (نخودیان) می باشد. جهت یافتن منبع مناسب برای تولید این آنزیم دانه های متعددی مورد بررسی قرار گرفتند که عبارت بودنداز: لوبیا چشم بلبلی، لوبیا چیتی، لوبیا سفید، لوبیا قرمز، لوبیا رشتی، لوبیا سبز، باقلا سبز، باقلا زرد، باقلا تازه، سویا تازه و سویا خشک ، که از میان آنها دانه روغنی سویا حاوی بیشترین مقدار آنزیم بود و بنابراین جهت مطالعه مناسب تشخیص داده شد. برای استخراج آنزیم از دانه سویا، پس از خرد و پودر کردن دانه رسیده، پودر در بافر فسفات 0/1 مولار، ph7/6 (حاوی edta 30 mm و 10mm مرکاپتواتانول) به مدت 4 ساعت در یخچال همزده شد و مدت یک شب در همان محیط نگهداری گردید. سپس رسوبات با سانتریفیوژ جدا شده و از محلول رویی جهت سنجش مقدار فعالیت آنزیم و پروتئین موجود استفاده گردید. پس از استخراج آنزیم دانه، برای جداسازی پروتئینها، روشهای متعددی از جمله رسوب باحلالهای آلی مانند استن، اتانول، ایزوپروپانول و متانول در حجم های مختلف استفاده شد ولی بدلیل غیرطبیعی کردن پروتئین و غیرفعال شدن آنزیم و در نتیجه کم بودن میزان بازدهی هیچ یک مناسب تشخیص داده نشد و از آنها استفاده نگردید. برای خالص سازی آنزیم ابتدا از ستون سفاکریل s-200 استفاده شد و یک پیک پروتئنی بدست آمد که فعالیت بسیار خوب اوره آزی داشت .این پیک برای خالص سازی بیشتر روی ستون deae - sepharose برده شد و دو پیک فعالیت نشان داد. برای تعیین خلوص پیکها از روش اکتروفورز page استفاده گردید. نتایج حاصل از رنگ آمیزی باکوماسی بلو و تعیین فعالیت ، نشان داد که دو باند پروتئینی ظاهر شده در رنگ آمیزی کوماسی بلو با دو باند فعالیت کاملا انطباق دارند و این مسئله در مورد آنزیم استاندارد نیز صادق است . ph بهینه برای آنزیم اوره آز سویا و آنزیم استاندارد حاصل از jack bean، 7 می باشد. با افزایش مولاریته بافر بکاررفته، فعالیت آنزیم کاهش می یابد. بهترین دما برای فعالیت آنزیم سویا 45 سانتی گراد و برای آنزیم استاندارد 40 سانتی گراد می باشد. پایداری آنزیم در دماهای 25 سانتی گراد الی 42 سانتی گراد تا 48 ساعت نسبتا خوب بوده و پس از کاهش اندکی در چند ساعت اول، در حدود 70-80 درصد ثابت می ماند. در دماهای بالاتر پایداری کمتر می باشد. در دماهای 60 و 65 سانتی گراد این کاهش چشمگیر بوده و فعالیت آنزیم در 6 ساعت به 30 درصد می رسد. بررسی تاثیر یونهای فلزzn2+, mn2+, cu2+, ni+, co2+ و ag+ بر فعالیت آنزیم نشان داد که تمامی آنها اثر بازدارندگی بر فعالیت آنزیم دارند، که در این میان اثر بازدارندگی cu2+ و zn2+ بیش از سایر یونها می باشد. با استفاده از نمودار میکالیس - منتون، مقادیر km و vmax آنزیم به ترتیب 3/417×103 ?mol و 68/9 ?mol/min بدست آمد.

کروماتوگرافی روی لایه نازک (tlc) مدتهای مدیدی است که بعنوان ابزاری مناسب برای شناسایی و خالص سازی مواد مختلف شیمیایی، آلکالوئیدی گیاهی، و چربی ها استفاده می شود. یکی دیگر از موارد استفاده از tlc در زمینه شناسایی میکروبهای مختلف از یکدیگر است . دیواره سلولی باکتریهای مختلف از نظر ساختمان شیمیایی با یکدیگر متفاوت است و در برخی موارد آنتی ژنهایی کاملا اختصاصی در دیواره سلولی هر باکتری وجود دارد که می توان با روشهای مختلف استخراجی و بکارگرفتن حلالهای مناسب ، در عمل استخراج، ماده شیمیایی مورد نظر)آنتی ژن اختصاصی گونه) را جداسازی کرده و با استفاده از عمل کروماتوگرافی به شناسایی باکتری مورد نظر اقدام نمود. در تحقیق حاضر، سعی در شناسایی مایکوباکتریوم توبرکموزیس به کمک عمل کروماتوگرافی روی لایه نازک (tlc) بود. بدین صورت که ماده سولفولیپید (si-i) به عنوان آنتی ژن اختصاصی گونه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس انتخاب شد و به کمک حلالهای مناسب اقدام به استخراج و تا حد امکان خالص سازی آن شد. سپس با راندمان ماده استخراج شده روی صفحات tlc به کمک حلال مناسب کروماتوگرافی و ظاهر کردن لکه های ایجادشده با معرف کرزیل ویوله و مشاهده rf و رنگ لکه های ایجاد شده سعی در شناسایی و خالص سازی ماده مورد نظر شد. هم زمان با استخراج این ماده از دیواره مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ، عصاره دیواره سه گونه مایکوباکتری دیگر نیز با همین روش و تحت شرایط یکسان استخراج شد و روی صفحات پلیت رانده و رنگ آمیزی شد. تحت شرایط موجود و به دلیل برخی محدودیتها در مورد تجربه کافی در این زمینه، تفاوت قابل ملاحظه ای بین عصاره های بدست آمده از سویه های میکروباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریهای آتیپیک مشاهده نشد، که این امر احتیاج به بحث و تحقیقات بیشتری دارد.

دو ایزوآنزیم بتاگلوکزیداز داخل سلولی از قارچ رشته ای نوروسپوراکراسا، موتان ‏‎(fgsc,cell -1 no. 4335)‎‏ خالص سازی شد و خصوصیات فیزیکوشیمیایی آنها تعیین گردید. خالص سازی با طی مراحل تفکیک با استن، ژل فیلتراسیون، و کروماتوگرافی تعویض یون انجام گرفت. خلوص آنزیمها براساس حضور تک باند پروتئینی در ژل در طی ‏‎sds-page‎‏ و با رنگ آمیزی نقره تایید گردید. از دو ایزوآنزیم یادشده، یک ایزوآنزیم، پروتئینی بود با ساختمان همودیمر (که بتا گلوکزیداز ‏‎a‎‏ نامیده شد) و دیگری یک پروتئین مونومر (که بتا گلوکزیداز ‏‎b‎‏ نامگذاری شد) وزن ملکولی بتاگلوکزیداز دیمر ‏‎a‎‏، ‏‎178kda‎‏ ، و بتا گلوکزیداز مونومر ‏‎106kda, b‎‏ تعیین گردید (براساس ‏‎sds-page‎‏). هر دو ایزوآنزیم گلیکوپروتئین بودند و محتوای کربوهیدارت آنها که طبق روش فنل - سولفوریک اسید محاسبه شد نسبتا بالا بود: 2/29% برای بتاگلوکزیداز ‏‎a‎‏ و 2/34% برای بتاگلوکزیداز ‏‎b‎‏. نقاط ایزوالکتریک این آنزیمها براساس روش ‏‎ief‎‏ برابر با 27/6 و 72/4 به ترتیب برای بتاگلوکزیدازهای ‏‎b, a‎‏ تعیین گردید. ‏‎ph‎‏ بهینه برای فعالیت برابر با 0/5 و 5/5 و دمای بهینه برابر با 55 درجه و 60 درجه سانتیگراد، به ترتیب برای بتاگلوکزیدازهای ‏‎b, a‎‏ تعیین گردید. هر دو بتاگلوکزیداز خالص شده، بویه بتاگلوکزیداز ‏‎b‎‏ ، پایداری نسبتا بالایی در برابر ‏‎ph‎‏ و دما از خود نشان می دادند. پایداری بهینه برای هر دو ایزوآنزیم در محدوده 0/9 - 0/5 ‏‎ph‎‏ قرار داشت . فعالیت ایزوآنزیمها در دماهای پایین تر از 40 درجه سانتی گراد تا مدت حداقل 48 ساعت به طور کامل حفظ می شد. در دماهای بالاتر ، آنزیمها نسبتا ناپایدار بودند و در دمای 60 درجه سانتیگراد بعد از 24 ساعت فعالیت خود را از دست می دادند. هر دو بتاگلوکزیداز به شدت توسط کاتیون مس ‏‎(cu++)‎‏ فعال می شدند و به وسیله ‏‎kmno4 , sncl2‎‏ مهار می گردیدند. کاتیونهای ‏‎ag+‎‏ و ‏‎hg++‎‏ نیز شدیدا بتاگلوکزیداز ‏‎a‎‏ را مهار می کردند. پارامترهای کینتیکی ‏‎vmax, km‎‏ این ایزوآنزیمها در مقابل سوبسترای سلوبیوز، به ترتیب ‏‎1/5mm‎‏ و ‏‎12/2 umol min-1 mg-1‎‏ برای بتاگلوکزیداز ‏‎2/76mm, a‎‏ و ‏‎143/5 umolmin -‎‏ برای بتاگلوکزیداز ‏‎b‎‏محاسبه شد.