انواع مارکرها برای شناسایی صحیح ژنوتیپ ها و ارقام گیاهی قابل استفاده هستند. از آنجایی که مارکر ریزماهواره هم بارز و فراوانند و نیز قابلیت تکثیر قابل اطمینانی دارند، در تحقیق حاضر، برای بررسی امکان شناسایی 33 ژنوتیپ سیب (malus domestica borkh) بومی ایران مورد استفاده قرار گرفتند. نمونه های گیاهی در سال 1388 از کلکسیون موسسه تحقیقات و اصلاح نهال و بذر کرج تهیه شدند و در دانشگاه گیلان مورد بررسی قرار گرفتند. ژنوتیپ های مذکور به وسیله 14 جایگاه ژنی توصیفی ssr جهت تعیین هویت مولکولی تفکیک شدند. در مجموع، 83 آلل چند شکل در این 14 جایگاه ژنی (به طور متوسط 5/92 آلل در هر جایگاه ژنی) نمایان شدند و محتوای اطلاعات چند شکلی به طور میانگین 0/71 بود. دندروگرام به طور یکسان برای داده های مورفولوژیک و مولکولی بر اساس روش upgma رسم شد و ژنوتیپ ها در 7 و 6 گروه اصلی قرار گرفتند. همسانی بالایی میان نتایج مشاهده شد. نشانگر های ریزماهواره مورد استفاده در این مطالعه توانستند با دقت بالاتری تنوع ژنتیکی میان ژنوتیپ ها را نشان دهند. تجزیه به مختصات اصلی، تجزیه کلاستر را جهت مشخص نمودن ارتباط مابین ژنوتیپ ها تایید نمود

چکیده در سال های اخیر شب پره پشت الماسی (diamondback moth)، plutella xylostella (linnaeus1758) مخرب ترین آفت خانواده کروسیفر یا چلپاییان در سرتاسر دنیا شده است که با توجه به مقاومت آن نسبت به سموم شیمیایی از عوامل کنترل کننده ی میکروبی نظیر bacillus thuringiensis برای مدیریت آن استفاده می شود. در این پروژه، در راستای حرکت به سوی مدیریت تلفیقی آفات و تسهیل استفاده از عوامل بیمارگر حشرات در کنترل بیولوژیک آفات به صورت بررسی تفاوت قدرت کنترل بیولوژیک چند جدایه ی ایرانی b. thuringiensis انجام پذیرفت. آزمایشات زیست سنجی با جدایه های b. thuringiensis به منظورتخمین lc50 و lt50 صورت پذیرفت. پرورش لارو شب پره پشت الماسی روی برگ های کلم درشرایط کنترل شده ژرمیناتور انجام شد. به منظور تعیین غلظت و انتخاب واحد مناسب، جدایه ها از روش های شمارش اسپور به وسیله ی لام هموسیتومترو شمارش کلنی روی محیط کشت آگارغذایی (na) استفاده شد. زیست سنجی با فرو بردن دیسک های برگی در محلول باکتری باغلظت های مختلف روی لاروهای سن 1، 2 و 3 شب پره پشت الماسی انجام شد. آزمون مقایسه ای با 5 تیمار (جدایه ها) و در 5 تکرار برای سن سوم و 3 تکرار زمانی برای سنین 1 و2 لاروی و هر تکرار شامل 10 لارو در قالب طرح کاملاً تصادفی صورت گرفت و آماربرداری از تلفات بعد از 5 روز انجام شد همچنین تجزیه واریانس و فاکتوریل درسه غلظت بالا، متوسط و پایین به دست آمد. نتایج نشان داد که بیشترین lc50 به دست آمده برای سنین 1، 2 و 3 لاروی به ترتیب cfu/ml103×3bacillus thuringiensis subsp kurstaki)dipel )، cfu/ml104×2 (bacillus thuringiensis subsp kurstaki)dipel و cfu/ml106×1 (bacillus thuringiensis subsp kurstaki)dipel می باشد و کمترین lc50 به ترتیب cfu/ml 102×6 جدایه 79، cfu/ml102×2 جدایه 87 و cfu/ml104×1 جدایه87 می باشد. برای lt50 بدست آمده در غلظت 108 برای سن سوم لاروی و 106 برای سنین اول ودوم لاروی بیشترین زمان بدست آمده به ترتیب 85/34 ساعت مربوط به (bacillus thuringiensis subsp kurstaki)dipel ، 01/79 ساعت جدایه 29 و 23/74 ساعت جدایه 29 و همچنین کمترین lt50 به دست آمده بترتیب 12/33 ساعت جدایه 20، 33/58 ساعت جدایه 79 و 21/55 ساعت جدایه 79 می باشد. با توجه به اطلاعات به دست آمده در این بررسی بیشترین اثر کشندگی b.thuringiensis روی سن دوم لاروی پروانه پشت الماسی مربوط به جدایه 87 بوده است.

باکتری bacillus thuringiensis (b.t) به عنوان یک میکروارگانیسم و حشره کش بیولوژیک موفق در بین سایر عوامل مطرح می باشد. این باکتری گرم مثبت و اسپوردار بوده و به واسطه ی تولید کریستال پروتئین قابلیت حشره کشی بر روی تعداد زیادی از راسته های حشرات را دارا می باشد. دامنه تاثیر این باکتری به نوع کریستال پروتئین آن بستگی دارد. استرین های مختلف این باکتری، کریستال پروتئین های مختلف دارند. باکتری b.t را از محیط های زیستی نظیر خاک، لاشه ی حشرات، بقایای گیاهی، آب های جاری و گرد و خاک انبارهای مواد غذایی می توان استخراج و خواص فنوتیپی و ژنوتیپی آنرا مورد بررسی و مطالعه قرار داد. در تحقیق حاضر 744 نمونه ی مختلف از 11 مکان مختلف استان آذربایجان غربی که تاکنون هیچ گونه اقدام باکتری پاشی در آن صورت نگرفته بود جمع آوری و مورد ارزیابی قرار گرفت. برای استخراج جدایه های باکتری b.t از روش انتخابی استات سدیم در چهار غلظت (2/0، 25/0، 3/0 و 35/0 مولار با 8/6=ph) استفاده گردید.شناسایی اولیه باکتری براساس وجود کریستال پروتئین و شکل کریستال با استفاده از رنگ آمیزی کوماسی بلو صورت گرفت و بر روی جدایه های حاوی کریستال پروتئین آزمایشات بیوشیمیایی شامل آزمون لسیتیتاز، اسکولین، ساکارز و سالیسین انجام شد. سپس برای تشخیص پائوتیپ جدایه های استخراجی آزمایشات زیست سنجی بر روی آفات شامل پروانه ی سفیده ی کلم (pieris brassicael.) و شب پره ی هندی (plodia interpunctella h.) از راسته بالپولکداران، پشته ی گونه culex pipiens l. از راسته دوبالان و شپشه آرد (tribolium confusum h.) از سخت بالپوشان مورد استفاده قرار گرفت. همچنین برای تشخیص و آشکارسازی ژن های سنتزکننده کریستال پروتئین (cry) در جدایه ها از روش مولکولی با استفاده از تکنیک pcr و آغازگرهای اختصاصی cry1، cry2 و ‍cry9 به عنوان ژن های تولیدکننده ی توکسین موثر بر روی راسته ی بالپولکداران، cry3 و ‍cry7 موثر بر روی راسته ی سخت بالپوشان و cry4 و ‍cry11 موثر بر روی دوبالان استفاده گردید. از 744 نمونه مختلف 301 کلنی بدست آمده که با تجزیه آنها 48 جدایه استخراج گردید. شاخص کل باکتری bacillus thuringiensis (b.t) در این تحقیق 064/0 معادل 4/6 درصد محاسبه گردید. که بالاترین شاخص مربوط به شهرستان خوی (0/147) و پایین ترین آن از ارومیه (041/0) بدست آمد. از چهار غلظت استات سدیم (2/0، 25/0، 3/0 و 35/0 مولار) به ترتیب 13 جدایه (08/27 درصد)، 26 جدایه (16/54 درصد)، 6 جدایه (5/12 درصد) و 3 جدایه (51/6 درصد) استخراج گردید که بیشترین استخراج مربوط به غلظت 25/0 مولار با 26 جدایه (16/54 درصد) بود. بیشترین استخراج جدایه ها از منبع خاک با 66 درصد حاصل شد و در بررسی های شکل شناختی، کریستال پروتئین به شکل هرمی با 19 جدایه (58/39 درصد) بیشترین فرم را به خود اختصاص داد براساس آزمایشهای بیوشیمیایی بیشترین تیپ بیوشیمیایی مربوط به زیرگونه b.t.subsp.kurstaki با واکنش es+sa+le+su- با 12 جدایه (25 درصد) و تیپ های دیگر شامل israelensis b.t.subsp با واکنش es+sa+le+su- و b.t.subsp.galleriae با واکنش es+sa+le+su- هر کدام با 7 جدایه (58/14 درصد) در درجه بعدی قرار گرفتند.در زیست سنجی جدایه ها بر روی آفات شامل پروانه ی سفیده ی بزرگ کلم، شب پره ی هندی، پشه ی کولکس و دو مرحله ی لاروی و حشره کامل شپشه آرد بعد از 48 ساعت تلفات 75 الی 100 درصد بترتیب در پروانه ی سفیده ی کلم و شب پره ی هندی توسط 3 جدایه (25/6 درصد) و 6 جدایه (5/12 درصد) مشاهده گردید، اما در این محدوده (75 الی 100) در روی پشه ی کولکس و لارو حشره کامل شپشه آرد تلفاتی مشاهده نگردید و همچنین بعد از 72 ساعت بر روی سفیده ی کلم، شب پره ی هندی و پشه ی کولکس تلفات 75 الی 100 درصد به ترتیب در 17 جدایه (4/35 درصد)، 17 جدایه (4/35 درصد)، 4 جدایه (8 درصد) و در روی لارو و حشره کامل شپشه آرد تلفاتی در این محدوده مشاهده نگردید. در بخش مولکولی و تشخیص ژن های cry نتایج نشان داد که در 48 جدایه ژن های cry1، cry2، cry3، cry4، ‍cry7، cry9 و ‍cry11 به صورت انفرادی به ترتیب در 47 جدایه (9/97 درصد)، 38 جدایه (79 درصد)، 24 جدایه (50 درصد)، 22 جدایه (8/45 درصد)، 2 جدایه (1/4 درصد)، 6 جدایه (5/12 درصد) و 9 جدایه (75/18 درصد) و به فرم ترکیبی شامل ژن های مولد توکسین در بالپولکداران شامل cry2+cry1، cry1+cry9، ‍cry2+cry9 و ‍cry1+cry2+cry9 به ترتیب در 37 جدایه (08/77 درصد)، 6 جدایه (5/12 درصد)، 4 جدایه (33/8 درصد) و در گروه دوبالان cry3+cry7 در 9 جدایه (75/18 درصد) و در گروه سخت بالپوشان cry4+cry11 در هیچ جدایه ای مشاهده نشد. بیشترین و کمترین ژن تشخیص داده شده در 48 جدایه بترتیب مربوط به cry1 و ‍cry7 با 47 جدایه (9/97 درصد) و 2 جدایه (1/4 درصد) و در فرم ترکیبی نیز cry1+cry2 و cry3+cry7 به ترتیب با 37 جدایه (08/77 درصد) و بدون جدایه مشاهده گردید.

این پزوهش در بخش کشت بافت و انتقال ژن، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران - کرج در سال 1392 انجام شد. بیماری آتشک که بوسیله باکتری erwinia amylovora ایجاد می شود، هر ساله عملکرد و کیفیت خانواده سیبیان را کاهش می دهد. هدف از این پژوهش جداسازی و بررسی بیان ژنهای دفاعی pr2, pr1 و pr8 با تحریک بیان آنها با ماده bth در مقاومت القایی در درخت به بود. بدین منظور درختچه های دو ساله به رقم اصفهان تحت تیمار با ماده bth قرار گرفت و 5 روز بعد rna از گیاهان تیمار شده و شاهد استخراج و از روی آن cdna ساخته شد. تکثیر ژنهای pr2, pr8 توسط آغازگرهای عمومی برای این ژنها، به وسیله واکنش pcr انجام گرفت. سپس به منظور توالی یابی، باندهای مورد انتظار پس از جداسازی از ژل روی ناقل ptz57r/t الحاق و پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری اشرشیاکولای سویه xl1blue همسانه سازی گردیدند. dna پلاسمیدها استخراج شد و جهت توالی یابی مورد استفاده قرار گرفت. مقایسه توالیهای بدست آمده با سایر توالیهای موجود در بانک اطلاعات نشان داد که تشابه بالایی با ژنهای شناخته شده در سیب و گلابی دارند. برای بررسی بیان این ژن ها آغازگرهای اختصاصی طراحی شد. استفاده از این آغازگرها در واکنش زنجیره ای پلیمراز به تکثیر کارآمد قطعاتی با طولهای مورد انتظار منجر شد. سپس میزان بیان آنها از طریق واکنش real time pcr ارزیابی شد. نتایج نشان داد که بیان هر سه ژن مورد بررسی پس از تیمار گیاه با بیون، به میزان بالایی افزایش یافت.

باکتری bacillus thuringiensis یک باکتری گرم مثبت، خاکزی و اسپورزا است که مشخصه ی آن تولید اجسام کریستالی می باشد که بر علیه لارو راسته های مختلفی از حشرات سمیت دارد و این ویژگی باعث شده است که از آن جهت در مبارزه بیولوژیکی با آفات استفاده شود. در این پژوهش از مناطق استان های اصفهان، تهران و مازندران تعدادی نمونه ی خاک جمع آوری شد و با استفاده از روش انتخابی استات سدیم جدایه های بومی باکتری b. thuringiensis از آن استخراج شده و با استفاده از رنگ آمیزی گرم و مشاهده ی کریستال پروتئینی، شناسایی شد. در نهایت 19 جدایه که دارای شکل کلونی و کریستال مختلف بودند جداسازی شدند. سپس با استفاده از روش های بیوشیمیایی، بیوتیپ آنها مشخص گردید. برای این جدایه های بومی و 41 جدایه بومی که از شهرک نهال و بذر و همچنین موسسه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران گرفته شده بود، واکنش زیست سنجی بر علیه مگس سرکه (راسته دوبالان) انجام شد. همچنین برای جدایه های بومی واکنش pcr برای تشخیص ژن های cry4a، cry4b، cry10، cry11، cyt1 و cyt2 گذاشته شد. بر اساس واکنش های بیوشیمیایی بیشترین بیوتیپ ها مربوط به تیپ 9 با فراوانی 63/1% و بیوتیپ 1 (thuringiensis) با فراوانی 21% بودند. در رابطه با زیست سنجی اکثریت (66/7درصد) جدایه ها در غلظت استفاده شده باکتری هیچ اثر سمی روی لاروها نشان ندادند. 23/3 %، سمیت ده درصد داشتند و 10% سمیت بیست درصد و یا بالاتر را نشان دادند. در بررسی ژنتیکی جدایه های بومی ژن های cry4a، cry4b، cry10، cry11، cyt1 و cyt2 به ترتیب دارای فراوانی 24، 44، 16، 28، 8 و 16 درصدی بودند. در بین جدایه های ارزیابی شده، جدایه ی 402 حاوی هر شش ژن مورد آزمون تشخیص داده شد، دارای بیشترین اثر کشندگی نیز در آن دیده شد و لذا این جدایه می تواند از میان جدایه های دیگر جهت ارزیابی های بعدی مانند کارایی در برابر سایر آفات راسته دوبالان، همچنین کارایی جهت تجاری شدن پیگیری شود.