طی پاکسازی مخازن نفتی که جهت ذخیره سازی نفت خام و مشتقات آن استفاده می شوند، حجم وسیعی از لجن نفتی به محیط تخلیه می شود که در صورت عدم رسیدگی صحیح، آلودگی های زیست محیطی به ویژه آلودگی خاک را به دنبال خواهد داشت. گزارشات موجود نشان می دهد که بسیاری از اجزای تشکیل دهنده لجن نفتی سرطان زا هستند. در این رابطه روش های پاکسازی متنوع اعم از فیزیکی، شیمیایی و زیستی مورد استفاده قرار گرفته است. در این میان، در شرایطی که امکان فعالیت زیستی وجود دارد، فرایندهای زیستی به سبب امکان اجرا در شرایط متعادل محیطی، سازگار بودن با محیط زیست و صرفه اقتصادی در اولویت اجرا قرار می گیرند. در مواردی که تراکم آلاینده ها بالاتر از حد تحمل سیستم های زیستی است می توان برای تجزیه کامل تر آلاینده نسبت به استفاده متوالی از روش های غیر زیستی (فیزیکی، شیمیایی و حرارتی) و فرایندهای زیستی اقدام نمود. زیست سالم سازی فرایندی است که در آن از میکروب هایی همچون مخمر، قارچ و باکتری برای شکستن و تجزیه ترکیبات خطرناک و سمی به ترکیباتی با سمیت کمتر و یا غیر سمی استفاده می کنند. یکی از روش های زیست سالم سازی که امروزه بیشتر مورد توجه قرار گرفته است، فرایند کمپوست است. در این روش به منظور بهبود خاک آلوده از مواد حجم دهنده طبیعی تجزیه پذیر بهره گرفته می شود. افزودن این مواد به خاک آلوده موجب افزایش کیفیت فیزیکی خاک و نیز تهویه خاک و بنابراین ارتقاء تجزیه میکروبی می شود. در این تحقیق در فرایند کمپوست از باگاس نیشکر به عنوان بهبود دهنده استفاده شد. به منظور بررسی کارایی فرایند کمپوست و نیز تاثیر افزودن مخلوط کودهای نیتروژن و فسفر در زیست سالم سازی خاک آلوده به لجن نفتی کف مخازن نفت خام، چهار راکتور آزمایشگاهی طراحی شد. خاک آلوده به لجن نفتی در سه بیوراکتور تحت تیمار متفاوت قرار گرفت: (1) خاک آلوده همراه با باگاس، (2) خاک آلوده همراه با مخلوط کود و (3) خاک آلوده همراه با باگاس و مخلوط کود). موازی با این سه بیوراکتور، یک بیوراکتور حاوی خاک غیرآلوده (بیوراکتور شاهد) راه اندازی و راهبری شد. این بیوراکتورها تحت شرایط عملکردی تعریف شده به مدت 5 ماه هوادهی شد. طی شش مرحله نمونه گیری از هر بیوراکتور تغییرات جمعیت باکتری های قابل کشت در خاک، تغییرات مقدار لجن نفتی در خاک، میزان تولید co2 در هر راکتور و تغییرات جمعیت میکروبی با استفاده از dgge مورد آنالیز قرار گرفت. طی آنالیزهای انجام شده بیوراکتوری که تنها حاوی باگاس بود بیشترین رشد جمعیت میکروبی، بیشترین میزان تولید co2 و بیشترین کاهش میزان لجن نفتی در خاک (شامل کاهش وزن لجن، کاهش ترکیبات آلی محلول در تولوئن، مواد اشباع و آسفالتن) را نشان داد. بعد از این بیوراکتور، بیوراکتوری که حاوی باگاس و مخلوط کود بود بیشترین رشد میکروبی و تولید co2 و کاهش ترکیبات آروماتیک و اشباع و آسفالتن را نشان داد. آنالیز ملکولی که به منظور بررسی دینامیک جمعیت میکروبی حین تیمار زیستی در هر چهار بیوراکتور انجام شد شامل استخراج ژنوم از خاک، انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز مربوط به ناحیه 16s rrna و سپس آنالیز dgge بود. تغییرات جمعیت میکروبی در هر چهار راکتور مشاهده شد. در مراحل پایانی نمونه برداری، علیرغم کاهش جمعیت میکروبی کل، در هر چهار راکتور افزایش تنوع میکروبی مشاهده شد.

مقدمه و هدف: پایرن یکی از هیدروکربن های آروماتیک حلقوی چهار حلقه ای با زیست تجزیه پذیری ضعیف و پایداری بالا در محیط زیست است که در فهرست آلاینده های دارای اولویت سازمان حفاظت محیط زیست امریکا قرار دارد. هدف از این پژوهش تعیین قابلیت حذف پایرن از خاک با استفاده از بیوسورفکتانت و نیز کاربرد اکسیداسیون فنتون اصلاح شده بود. روش مطالعه: باکتری های تجزیه کننده پایرن و تولید کننده بیوسورفکتانت پس از غربالگری محیطی از یک نمونه خاک آلوده به ترکیبات نفتی جداسازی شدند. همچنین یک سویه باکتریایی تولید کننده بیوسورفکتانت پس از بهینه سازی منبع کربن، منبع نیتروژن، نسبت کربن به نیتروژن، درصد شوری و ph به وسیله روش طراحی آزمایش های تاگوچی، برای تولید بیوسورفکتانت مورد استفاده قرار گرفت. اصلاح زیستی با استفاده از بیوسورفکتانت، سورفکتانت شیمیایی توئین 80، نمونه های فاقد هرگونه سورفکتانت و شاهدهای شیمیایی و میکروبی در دو غلظت پایرن 100 و mg/kg 500 طی 9 هفته صورت گرفت. همچنین اصلاح شیمیایی با استفاده از اکسیداسیون فنتون اصلاح شده در ph خنثی بر روی نمونه های خاک با غلظت پایرن mg/kg 500 -100 انجام شد. سپس یک مرحله اصلاح متوالی شیمیایی – زیستی در شرایط بهینه به دست آمده از مراحل قبل بر روی نمونه های خاک دارای آلودگی مصنوعی به غلظت های 100، 500 و mg/kg 1000 و یک نمونه خاک دارای آلودگی واقعی صورت پذیرفت. نتایج: شرایط بهینه تولید بیوسورفکتانت به وسیله سودوموناس آئروژینوزا شامل منبع کربن روغن زیتون، منبع نیتروژن نیترات آمونیوم، نسبت کربن به نیتروژن 5، شوری 5/0 درصد و ph برابر 7 تعیین گردید. بازده حذف در غلظت پایرن اولیه 100 و mg/kg 500، زمان واکنش 63 روز و کاربرد بیوسورفکتانت، به ترتیب 91 و 6/84 درصد بود. شرایط بهینه اکسیداسیون فنتون اصلاح شده شامل غلظت پراکسید هیدروژن mm 300، غلظت آهن mm 30، زمان واکنش 6 ساعت و عامل شلاته کننده سدیم پیروفسفات تعیین شد. بازده حذف پایرن با غلظت های اولیه mg/kg 500 -100 بین 93 – 39 درصد بود. اصلاح متوالی شیمیایی – زیستی در شرایط بهینه معرفی شده منجر به بازده حذف 95، 86 و 61 درصد برای غلظت های اولیه پایرن 100، 500 و mg/kg 1000 در خاک دارای آلودگی مصنوعی و 64 درصد برای خاک دارای آلودگی واقعی گردید. نتیجه گیری: با توجه به نتایج حاصل از این پژوهش می توان اظهار نمود که فرآیند اصلاح متوالی شیمیایی – زیستی با شرایط بهینه معرفی شده در این پژوهش می تواند به عنوان یک جایگزین کارامد، عملی، رقابتی و قابل قبول برای اصلاح خاک های آلوده به پایرن به شمار رود.

گازوئیل یکی از پر مصرف ترین و پرکاربردترین محصولات نفتی در ایران و بسیاری از کشورهای جهان است. حجم قابل توجهی از گازوئیل در مخازن زمینی و ایستگاه های سوخت نگهداری می شود که در اثر نشت از این مخازن، می تواند خاک و آب زیرزمینی مجاور را به شدت آلوده نماید. گازوئیل به عنوان آلاینده ای بسیار مهم مورد توجه قرار گرفته است که اثراتی پر خطر بر انسان و دیگر موجودات زنده موجود در محیط می گذارد. روش های شیمیایی و فیزیکی که معمولاً به منظور اصلاح آلودگی مورد استفاده قرار می گیرند، پرهزینه هستند و به راحتی آلودگی را منتقل می کنند. این روش ها ممکن است پسماندهای جدیدی مثل پسماندهای حاصل از سوزاندن تولید کنند و بنابراین مشکل را حذف نمی کنند؛ ولی روش های زیست سالم سازی این معایب را ندارند. زیست سالم سازی فرایندی است که در آن از میکروبهایی چون مخمر، قارچ و باکتری برای شکستن و تجزیه ترکیبات خطرناک و سمی و تبدیل آنها به ترکیباتی با سمیت کمتر و یا غیر-سمی، استفاده می کنند. یکی از روش های ساده ی زیست سالم سازی تحریک زیستی است. تحریک زیستی به معنی واردکردن آب، مواد مغذی و اکسیژن به میزان کافی به خاک است تا در پی آن فعالیت تجزیه کنندگان میکروبی افزایش یابد. پارامترهای فیزیکی و شیمیایی خاک بر جابجایی آلاینده ها در خاک و نیز بر زیست دسترس پذیری آنها موثر هستند. بنابراین، این پارامترها بر تجزیه زیستی آلاینده و نیز بر تنوع میکروبی خاک تاثیری به سزا دارند. باکتریها در فرایندهای تبدیل زیستی نقش موثری دارند. پس برای پایش هرچه بهتر فرایند پاکسازی زیستی به کسب شناخت از شرایط فیزیکوشیمیایی خاک و نیز درک ساحتار میکروبی خاک حین تجزیه آلاینده نیاز است که این پایش به ما در اجرای موثر فرایند میدانی پاکسازی زیستی کمک می کند. به عبارت دیگر با شناختن ساختار جامعه میکروبی خاک می توان روش های زیست سالم سازی را بهینه کرد. در این تحقیق 4 نوع خاک مختلف با گازوئیل به میزان 4% آلوده و در 4 ظرف مختلف ریخته شدند. به منظور بررسی اثر آلودگی بر تنوع باکتریها مقداری از این 4 نوع خاک بدون اینکه آلوده شوند به عنوان شاهد در 4 ظرف دیگر ریخته شدند. 8 بستر آزمایشی مورد تحریک زیستی قرار گرفتند و در آنها تغییر در باکتریهای قابل کشت و غیر قابل کشت آنها به همراه تجزیه ی هیدروکربن ها به مدت 4 ماه رصد شد. بیشترین مقدار کاهش وزنی گازوئیل بعد از 120 روز در بستر آزمایشی خاک حاوی شن بیشتر (44%) ، شوری کمتر و کربن آلیبیشتر (2%) مشاهده شد. بیشترین افزایش تعداد باکتریهای هتروتروف نیز در همین خاک مشاهده شد. بعد از این خاک، در خاکی بیشترین کاهش وزنی مقدار گازوئیل دیده شد که این خاک نیز شور نبود و درصد شن آن با در صد شن خاک اخیر برابر بود. بعد از خاک اول بیشترین مقدار افزایش تعداد باکتریهای خاک دوم در مرحله ی سوم نمونه گیری دیده شد. برای شمارش باکتری های تجزیه کننده ی هیدروکربن ها، خاک حاصل از هر مرحله نمونه گیری در محیط مایع متشکل از نمکهای معدنی کشت داده شد. محیط کشت مذکورحاوی گازوئیل (1%) به عنوان تنها منبع کربن بود. همین طور به منظورغنی سازی سه مرحله ای باکتریهای تجزیه کننده ی هیدروکربن، 4 نوع خاک قبل از راه اندازی بسترهای آزمایشی و 8 نوع خاک (شامل 4 بستر آلوده به گازوئیل و 4 بستر غیر آلوده) حاصل از نمونه گیری آخر در محیط پایه معدنی حاوی گازوئیل کشت داده شد.به صورت کلی تغییرات تعداد باکتریهای تجزیه کننده ی هیدروکربن روند یکنواختی داشت. این روند به این صورت است که با گذشت زمان تعداد باکتری های تجزیه کننده ی هر نوع خاک تا تعداد بیشینه افزایش یافته و سپس کاهش می یابد. این تعداد بیشینه در مرحله ای مشاهده شد که در آن زمان تعداد باکتریهای هتروتروف خاک نیز بیشینه بود. خاکهای غیر آلوده (به جز خاک a ) همواره حاوی باکتری تجزیه کننده ی کمتری نسبت به نمونه ی آلوده بودند که می تواند نشان از تاثیر حضور گازوئیل بر افزایش تعداد باکتریهای تجزیه کننده در خاک آلوده باشد. جهت بررسی دینامیک جمعیت میکروبی حین تیمار زیستی، خاک 8 بستر آزمایشی در هر مرحله نمونه گیری به همراه محیطهای کشت حاوی باکتریهای تجزیه کننده ی هیدروکربن و غنی سازی شده مورد آنالیز مولکولی قرار گرفتند که این آنالیز شامل استخراج ژنوم از خاک و محیط کشت، انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز مربوط به ناحیه 16s rrna و سپس آنالیز dgge بود. تغییرات تنوع باکتریایی در خاک هر 8 بستر آزمایشی مشاهده شد. در مراحل پایانی، همراه با کاهش جمعیت باکتریایی کل، در همه ی بسترهای آزمایشی به جز یک مورد خاک پاک کاهش تنوع میکروبی دیده شد که میزان کاهش تنوع در خاکهای غیر آلوده کمتر بود. شباهت بسیار اندکی در الگوی باندهای dgge مرحله ی اول غنی سازی با مرحله ی (تجدید کشت) سوم وجود دارد این تغییر در ساختار جمعیت باکتریایی حین غنی سازی روی سوبستراهای خاص، پتانسیل فرایند انتخاب در جداسازی سویه های مغلوب محیطی را نشان می دهد. بیشترین مقدار کاهش هیدروکربنهای نفتی در دو بستر آزمایشی دیده شد در حالیکه تنوع باکتریهای تجزیه کننده حاصل از این 2 بستر کاهش یافته است، که می تواند نشان دهنده ی وجود تنوع کمتری از میکروارگانیسم های تطبیق یافته ی تجزیه کننده در این دو بستر باشد.

هیدروکربن های آروماتیک چند حلقه ای (pah) از سمی ترین ترکیبات شیمیایی هستند. دسترس پذیری زیستی پایینی دارند و به علت پایداری طولانی مدت آنها در محیط زیست اثر جبران ناپذیری بر سلامت انسان و محیط زیست وارد می کند. برای حذف و یا خنثی کردن این ترکیبات، علاوه بر روش های شیمیایی، اکنون روش های پاک سازی زیستی یا همان زیست پالایی وجود دارد زیرا این روش ارزان تر بوده و از نظر زیست محیطی ایمن تر است. میکروارگانیسم ها ابزار اصلی زیست پالایی هستند و پایش حضور و فعالیت آنها در محیط زیست اهمیت بسیار زیادی در تحقیقات مولکولی دارد. گونه های سودوموناس حضور همه جانبه ای در محیط زیست دارند، نقش مهمی در تجزیه آلاینده ها ایفا می کنند. منطقه خانگیران واقع در شمال شرقی خراسان رضوی یکی از بزرگترین و قدیمی ترین میدان های گازی ایران در معرض این ترکیبات آلاینده قرار گرفته است. خاک آلوده به صورت میکروکازم هایی از خاک خانگیران آلوده به ppm200 از آروماتیک های چند حلقه ایی (فنانترن، آنتراسن، فلورانتن، پایرن هر کدام به مقدار ppm50) شبیه سازی شد. آزمایش ها در حضور و غیاب هگزادکان پس از افزودن منبع نیتروژن، فسفات و رطوبت کافی انجام شد. تنوع سودوموناس¬ها با استفاده از پرایمر اختصاصی سودوموناس¬ها و تکنیک 16s rdna pcr-dgge مورد بررسی قرار گرفت. باندهای حاصل از dgge تعیین توالی شد و سپس با برنامه blast با سایر توالی های موجود در پایگاه ez taxon مقایسه و درصد شباهت آن ها بررسی شد. نتایج نشان داد که بعد از شش ماه مقدار باقی مانده از آلودگی pah 5% (بیشترین مقدار باقی مانده آنتراسن ppm42/6 و کمترین آن مربوط به فلورانتنppm 0937/0) بوده است. طی آلودگی به pah در حضور هگزادکان مقدار pah باقیمانده 10% ( بیشترین مقدار باقی¬مانده مربوط به پایرن ppm13و کمترین آن فنانترن ppm33/1) است. این کاهش آلودگی با افزایش جمعیت باکتری¬های هتروتروف از cfu/g107×5/5 به cfu/g108×46/1 و همچنین جمعیت باکتری های سودوموناس ازcfu/g 104×8/3 به cfu/g105×8/9 منطبق بود. تکنیک dgge نشان داد که جمعیت بارز سودوموناس¬ها (cremoricolorata pseudomonast، pseudomonas plecoglossicida ) با افزودن آلودگی به سمت سودوموناس هایی که نقش مهمی در تجزیه آلودگی دارند (pseudomonas stutzeri ) تغییر می کند و پس از حذف آلودگی دوباره جمعیت بومی سودوموناس¬ها بازسازی می¬شوند. واژگان کلیدی : پاک سازی زیستی، سودوموناس، 16srdna، pah، dgge

بمنظور جداسازی کشت خالص یا مخلوطی از باکتریها که قادر به تجزیه فورفورال بوده و نسبت به آن مقاوم باشند کوشش به عمل آمده است و این اقدام به منظور تلقیح این کشت های میکروبی در سیستم های تصفیه پسابهای حاوی فورفورال انجام شده است . در این راستا نمونه های متنوعی از نقاط مختلف آلوده به فورفورال و نقاط غیر آلوده تهیه گردید. رعایت تنوع در نقاط نمونه گیری امکان دسترسی به کشت هایی منطبق با شرایط منطقه ای را فراهم آورده و نیز بررسی نقش حضور فورفورال در انتخاب باکتریهای تجزیه کننده آن را میسر می سازد. آنگاه عمل غنی سازی و انتخاب به هزینه فورفورال و 2 - فوروئیک اسید (اولین متابولیت حاصل از تجزیه میکروبی فورفورال) به عنوان تنها منبع کربن و انرژی، در مورد همه نمونه ها انجام شد که منجر به جداسازی کشت های مخلوط پایداری گردید که قادر به تجزیه فورفورال و 2 - فوروئیک اسید به عنوان تنها منبع کربن و انرژی بودند. در بررسی نقش عصاره مخمر در غنی سازی این کشت ها به هزینه فورفورال و 2 - فوروئیک اسید، کشت های مخلوط پایداری بدست آمد که به شرط حضور عصاره مخمر قادر به تجزیه فورفورال و 2 - فوروئیک اسید به عنوان تنها منبع کربن و انرژی بودند. در پی سنجش پتانسیل سازش این کشت ها به تجزیه و تحمل مقادیر بیشتر فورفورال، مقاومترین و سریع ترین کشت های تجزیه کننده فورفورال انتخاب گردید و کوشش خالص تجزیه کننده فورفورال از کشت های مخلوط انجام شده و 3 باکتری گرم منفی به اسامی 28y,49,68 بدست آمد. باکتری های اول و دوم قادر به مصرف فورفورال (1500ppm) به عنوان تنها منبع کربن و انرژی بوده و باکتری سوم به شرط حضور حداقل 10ppm عصاره مخمر قادر به مصرف فورفورال (1800 ppm) به عنوان تنها منبع کربن و انرژی می باشد. بررسی تاثیر فورفورال بر مدت مرحله سکون رشد این کشت ها، تشکیل و مصرف 2 - فوروئیک اسید در مراحل مختلف رشد آنها، و نیز مقایسه تجزیه فورفورال در کشت های خالص و مخلوط، بخشی از نتایج این تحقیق می باشد. سنجش همراه فورفورال و 2 - فوروئیک اسید طی مراحل مختلف رشد و در محیط کشت توسط hplc انجام شد که نتایج آن با رسم منحنی نشان داده شده است .