هدف این تحقیق بررسی تأثیرات انجماد شیشه ای کمپلکس های تخمک–کومولوس (توده های coc) گوسفند بر بقای توده ها، بلوغ تخمک ها، بیان ژنهای بلوغ و آپوپتوزی، شیوع ناهنجاریهای کروموزومی و تغییرات فراساختاری توده ها بود. توده های coc جدا شده دارای کیفیت خوب به چهار گروه، غیرانجمادی کنترل، انجمادی conventional straw ، cryotop و solid surface تقسیم شدند. در گروههای انجمادی conventional straw وcryotop، توده های منجمد شیشه ای شده به ترتیب در درون نی انجمادی و بر روی نوک نوارcryotop قرار گرفتند و مستقیماً در نیتروژن مایع غوطه ور شدند درحالیکه در گروه انجمادی solid surface، توده های منجمد شیشه ای شده پس از قرار گرفتن بر رویcryotop ، ابتدا سرد و سپس به نیتروژن مایع منتقل شدند. پس از بررسی بقا، توده های coc سالم به همراه توده های تازه گروه کنترل، در شرایط آزمایشگاهی بالغ شده و وضعیت هسته ای تخمک ها ارزیابی شد. علاوه بر آن، بیان نسبی ژنهای بلوغ و آپوپتوزی با روش کمی real-time pcr مورد ارزیابی قرار گرفت و شیوع ناهنجاری کروموزومی نیز با روش کاریوتیپ بررسی شد. در آخر، تغییرات فراساختاری توده های منجمد شده و تخمک های منجمد و بالغ شده نیز بین گروههای مختلف مقایسه شد. نتایج نشان داد که میزان بقای توده های منجمد و ذوب شده در گروههای cryotop و solid surface نسبت به گروه conventional straw بالاتر بود (به ترتیب 2/85 ± 83/84 و 1/72 ± 78/56 در برابر 1/48 ± 63/43% ، 0/05>p)، بعلاوه اگر چه در گروه cryotop، میزان بلوغ تخمک ها شبیه به گروه کنترل بود (3/09 ± 48/81 در برابر 3/01 ± 51/94%) ولی در مقایسه با سایر گروههای انجمادی درصد بالاتری داشت (3/09 ± 48/81 در برابر 1/69 ± 36/60 و 2/51 ± 6/09% ، 0/05>p). با وجود کاهش بیان نسبی ژنهای بلوغ (gdf9 و bmp15) پس از انجماد شیشه ای، گروه cryotop در میان گروههای انجمادی، بیشترین بیان را به خود اختصاص داده بود. بالاترین میزان بیان گیرنده bmprii در گروه کنترل بود، در حالیکه گیرنده alk5 میزان بیان مشابهی را در تمام گروهها داشت. بیان ژنهای پروآپوپتوزی (بجزbax) و ضدآپوپتوزی در گروه cryotop در مقایسه با سایر گروههای انجمادی بیشتر بود. ژن bax در گروه solid surface بیش از حد بیان شده بود. گروه conventional straw نیز پایین ترین میزان بیان ژنهای آپوپتوزی را نشان داد. میزان شیوع ناهنجاری کروموزومی در گروه cryotop نسبت به گروه کنترل بیشتر بود (5/42 در برابر 20% ، 05/0<p). همچنین نتایج بررسی های فراساختاری نشان داد که انجماد شیشه ای با روشهای cryotop و solid surface سازمان دهی کلی اووپلاسم را حفظ کرده در حالیکه انجماد conventional straw این سازمان دهی را بهم ریخته بود. علاوه بر آن پس از انجماد شیشه ای، تعداد واکوئل ها در اووپلاسم افزایش یافت، گروهی از این واکوئل ها به صورت جزیی یا کامل با چربی پر شده و گروهی نیز دارای داربست میکروفیلامنتی بودند. در تمام گروههای انجمادی، توزیع میتوکندریها به حالت گروه گروه در اطراف قطرات چربی در آمده بود و پس از انجماد conventional straw، میتوکندریهای متسع و حتی پاره نیز مشاهده شدند. اتصالات فاصله دار میان تخمک و سلول های کومولوس اطراف و کمپلکس های اتصالی بین سلول های کومولوس در دو گروه انجمادی cryotop و solid surface به خوبی حفظ شده در حالیکه در گروه انجمادی conventional staw، سلول های کومولوس زوایدشان را از منطقه شفاف به عقب کشیده بودند. در تخمک های بالغ نیز از تعداد و تراکم گرانولهای قشری پس از انجماد conventional straw و solid surface کاسته شده بود. در نهایت، انجماد با روش cryotop در مقایسه با دو روش انجمادی دیگر روش مطمئنی بنظر رسیده و می تواند بقا، بلوغ پس از ذوب و میزان بیان ژنهای بلوغ را افزایش دهد و همانند گروه کنترل سبب القای مرگ سلولی از طریق مسیر آپوپتوزی گردد. بعلاوه این روش فراساختار توده های coc را نیز بخوبی حفاظت می کند ولیکن کاستی هایی در زمینه حفظ سازمان دهی کروموزومی تخمک از خود نشان می دهد.

فیبروز کبدی که به دنبال پاسخ ترمیمی کبد به آسیبهای مزمن اتفاق می افتد یکی از مهمترین مشکلات جوامع بشری در حوزه سلامت است؛ و در حال حاضر تنها راه درمانی چنین بیمارانی در مراحل پیشرفته آن، پیوند کبد می باشد. اما متاسفانه در این زمینه نیز مشکلات عدیده ای، از جمله کمبود عضو اهدایی، امکان رد پیوند، عمل جراحی پیچیده و هزینه گزاف وجود دارد. مطالعات اخیر نشان داده اند که طب ترمیمی قابلیت آن را دارد که به عنوان یک جایگزین در درمان چنین بیمارانی مطرح باشد. همچنین سلولهای مزانشیمی مغز استخوان توانایی تمایز به سلولهای کبدی را در محیط آزمایشگاهی و بدن دارند. اما همواره میزان و کیفیت تمایز این سلولها و نیز نقش آنها در ترمیم کبد بسیار پایین بوده است. به همین خاطر در مطالعه حاضر سعی شد تا راهکارهایی برای تمایز بهتر سلولهای مزانشیمی در محیط کشت و پیوند موثرتر آنها به کبد ارائه شود.در این مطالعه ابتدا سلولهای مزانشیمی مغز استخوان موش در حضور و عدم حضور بستر نانو رشته ای (گروه نانو مثبت و نانو منفی) به سلولهای شبه هپاتوسیتی اولیه (روز 18) و نهایی (روز 36) تمایز داده شدند؛ و بیان ژنها و پروتئینهای اختصاصی هپاتوسیتی آنها توسط روشهای real-time pcr و ایمنوفلورسنت بررسی شده، همچنین فراساختار سلولها با روشهای الکترون میکروسکوپی مطالعه شده، و عملکرد آنها با واکنش های pas و prod، و نیز اندازه گیری میزان ترشحات اختصاصی کبدی مورد بررسی قرار گرفت. در مرحله بعدی مطالعه سلولهای مزانشیمی و نیز سلولهای شبه هپاتوسیتی اولیه و نهایی گروه های نانو مثبت و منفی به موشهای مدل فیبروز کبدی ناشی از تتراکلرید کربن پیوند شدند. یافته ها نشان داد که بسیاری از شاخص های هپاتوسیتی بالغ، نظیر بیان آلبومین، hnf4a، کانکسین-32 و سیتوکروم 1a1، همچنین تولید و ترشح اوره، آلفافتوپروتئین و آلبومین، و نیز فعالیت آنزیم سیتوکروم p450 در سلولهای شبه هپاتوسیتی نهایی گروه نانو مثبت بالاتر از گروه نانو منفی بود. از طرفی دیگر مطالعه پیوند سلولی مشخص ساخت که سلولهای شبه هپاتوسیتی نهایی گروه نانو مثبت در مقایسه با گروه های نانو منفی و مزانشیم تیمار نشده، توانسته بودند با درصد بالاتری در بافت کبدی جایگزین شده، به هپاتوسیتهای فعال (آلبومین مثبت) تبدیل شوند و میزان آلبومین سرمی را بطور معنی داری افزایش و نیز میزان فیبروز را کاهش دهند. این یافته ها بیانگر آن است که خصوصیات توپوگرافیک حاصل از بستر نانو رشته ای می تواند موجب تمایز بهتر و حفظ عملکرد سلولهای شبه هپاتوسیتی مشتق از سلولهای مزانشیمی مغز استخوان موش شده، و آنها را برای اهداف سلول درمانی مساعد تر سازد.

چکیده: بیماری مالتیپل اسکلروزیس به عنوان یک بیماری التهابی مزمن و پیشرونده در سیستم عصبی مرکزی است که به تخریب میلین وآکسونها می انجامد. بهترین مدل حیوانی آن که در مطالعات برای بررسی اتیولوژی و پاتوژنز ودرمانهای جدید بکار می رود مدل experimental autoimmune encephalomyelitis (eae) است. این مطالعه در دو بخش انجام گرفت. در بخش اول مطالعه پس از ایجاد مدل eae با استفاده از پپتید mog در موشهای c57bl/6 استخراج پروتئین از مغز و نخاع صورت گرفت. پروتئینها با کمک تکنیک پروتئومیکس ( ترکیبی از الکتروفورز دو بعدی و اسپکترومتری جرمی) در سه گروه: کنترل، نمره بالینی 1 و نمره بالینی 3 مورد بررسی ومقایسه قرار گرفتند. در مغز 42 لکه پروتئینی که تغییر بیان معناداری را نشان می دادند شناسایی شدند که 8 پروتئین افزایش بیان و34 پروتئین کاهش بیان را نشان دادند. در نخاع 26 لکه پروتئینی تغییر معناداری را نشان داده که 15 پروتئین کاهش بیان و11 پروتئین افزایش بیان را نشان دادند. این پروتئینها عمدتا در این گروهها : اختلال در آزاد سازی یونی و ترانسمیترها، پروتئین های متابولیسم انرژی و میتوکندریایی، تخریب سد خونی – مغزی، پروتئین های مرتبط با آپوپتوز، پروتئین های ساختاری، انتقال سیگنال قرار گرفتند. از مجموع 68 پروتئین سیستم عصبی مرکزی که تغییر بیان معنادار داشتند، 42 پروتئین دراین مطالعه برای اولین بار در ارتباط با ام اس معرفی شدند. در مرحله دوم مطالعه ، موشهای eae با استفاده از سلولهای پیشساز عصبی مشتق ار سلولهای بنیادی جنینی تیمار شدند. پس از بهبود نسبی موشهای eae ( در نمره بالینی 3 )، پروتئین های مغز ونخاع این موشها وگروه کنترل و نرمال با کمک تکنیک پروتئومیکس مورد بررسی و مقایسه قرار گرفتند. نتایج نشان داد که در مغز 13 لکه پروتئینی ودر نخاع 17 لکه پروتئینی وجود دارند که که بدنبال بیماری تغییر معنادار را پیدا نموده و در گروه تیمار سلولی به طور معنادار بهبود یافتند. این پروتئینها عمدتا در این گروهها: اختلال در آزاد سازی یونی و ترانسمیترها، پروتئین های متابولیسم انرژی و میتوکندریایی، پروتئین های مرتبط با آپوپتوز و پروتئین های ساختاری قرار گرفتند. از مجموع 30 پروتئین سیستم عصبی مرکزی که تغییر بیان معنادار داشته و بدنبال تیمار سلولی بهبود یافته بودند، 25 پروتئین دراین مطالعه برای اولین بار در ارتباط با ام اس معرفی شدند. نتایج بخش اول این مطالعه در بررسی مکانیسم بیماری مفید خواهد بود و همچنین احتمال استفاده از آنها به عنوان کاندید مارکر شناسایی زود هنگام بیماری است. نتایج بخش دوم این مطالعه در تدوین راهکار های درمانی جدید از جمله استفاده از سلولهای بنیادی مفید خواهد بود.

سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی(sscs) تنها گروه از سلولهای بنیادی بالغ هستند که قابلیت انتقال اطلاعات ژنتیکی به نسل بعد را دارند و تاکنون اثر سن سلولهای غذا دهنده در حمایت از رشد و تکثیر آنها موضوعی قابل بحث است .این مطالعه به منظور مقایسه اثر هم کشتی سلولهای سرتولی مشتق از موش بالغ و نابالغ با سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی صورت گرفته است sscs. از موش نابالغ جدا شده و کشت شدند و سپس روی سلولهای سرتولی مشتق از موش بالغ و موش نابالغ و روی سلولهای sto ، منتقل شدند. پس از 5 روز ویژگیهای کلونیها بررسی شد از رنگ آمیزی ایمونوفلوئورسنت جهت بررسی کیفی بیان مارکرها استفاده شد. و از تست پیوند جهت اطمینان از بنیادی بودن سلولها استفاده شد. این سلولها 10 روز پس از کشت به مدل عقیم پیوند شده و توانستند به محل غشائ پایه لوله های منی ساز مهاجرت کنند . نتایج نشان میدهند که 5 روز پس از انتقال کلونیها روی لا یه های غذا دهنده مساحت کلونیها ، تعداد آنها و تعداد سلولهای موجود در هر کلونی به نحو معنی داری در گروه سلولهای سرتولی مشتق از موش نابالغ بیشتر بود،نتایج فلوسایتومتری نشان میدهد که تعداد سلولهای ?6-integrin مثبت روی سلولهای سرتولی مشتق از موش نابالغ به نحو معنی داری بیشتر بود .همچنین افزایش معنی داری در تعداد سلولهای -integrin ?1مثبت روی سلولهای سرتولی مشتق از موش نابالغ نسبت به سلولهای منتقل شده روی سلولهای سرتولی مشتق از موش بالغ و سلولهای روی sto دیده شد.بر اساس نتایج فوق تعداد sscsروی لایه غذا دهنده سلولهای سرتولی مشتق از موش نابالغ نسبت به دو گروه دیگر بیشتر بود، که ممکن است مربوط به تفاوت سلولهای سرتولی مشتق از موش نابالغ و بالغ در ایجاد کنام مناسب برای sscs باشد

مقدمه : اگرچه سلول های بنیادی جنینی خودنوزا بوده و توان تمایز به انوع سلول های موجود در بدن را دارند ولی تمایز جهت دار آنها به یک نوع سلول خاص، با یک شیوه خاص، بعنوان چالشی است که هنوز باقی مانده است. از طرفی، چنین تمایزی در موجود زنده در یک محیط سه بعدی روی می دهد، لذا استفاده از داربست هایی که بتواند چنین وضعیتی را برای تمایز سلول ها فراهم آورد ضروری به نظر می رسد. روش ها: ما پس از کشت سلول های بنیادی جنین انسان بر بستر های با و بدون "فیبر نانو"، کلونی های حاصله را به سمت "اکتودرم عصبی" القاء نموده و پس از ایجاد ساختار های "شبه لوله عصبی" ،آنها را بر سطوح "نانو" و بدون "نانو" مجددا کشت نمودیم و با انجام آزمایش های rt-pcr، ایمونوسیتوشیمی و فلوسایتومتری بیان مارکر های عصبی را بررسی کردیم و به منظور بررسی مورفولوژی سلول ها در حضور و عدم حضور فیبر نانو، اقدام به تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی کردیم. انجام patch clamp نیز به منظور بررسی وجود پتانسیل عمل و جریانهای عصبی در سلول های عصبی بالغ، صورت گرفت. یافته ها: رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی و نتایج فلوسایتومتری آشکار کرد که میزان بیان مارکرهای پیش ساز عصبی در گروه نانو با اختلاف معنی دار نسبت به گروه فاقد نانوصورت می گیرد. در مرحله بلوغ این سلول ها، تولید موتور نورون با رنگ آمیزی ایمونوسیتوشیمی برای مارکرهای hb9,islet و chat در سطح پروتئین و در سطح rna با استفاده از rt-pcr تایید شد. تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی، افزایش تعداد زواید اکسونی بر بستر نانوفایبر را نشان می داد، و نتایج patch clamp حاکی از وجود جریان های یونی قویتر و همچنین وجود پالس هایی شبیه به پتانسیل عمل در گروه دارای داربست نانو بود. در نهایت می توان گفت داربست نانوفایبری توانسته است شرایط بهتری را برای رشد و تمایز سلول ها فراهم سازد.

کبد ارگانی حیاتی است و در متابولیسم، ذخیره، غیر سمی کردن دارویی و ترشح نقش دارد و باعث حفظ هموستازی بدن می شود. عمده وظایف کبد به عهده هپاتوسیت هاست که 80% از حجم کبد را تشکیل می دهند و مهم ترین سلول کبد هستند. آسیب به آن در بیماری های کبدی منجر به اختلال عملکرد کبد می شود. بیش از 3 میلیون نفر از هموطنان مبتلا به بیماری های کبدی هستند و با توجه به افزایش روزافزون تعداد آنها و کمبود اندام اهدایی و خطر دفع پیوند کبد و عوارض جانبی آن نیاز مبرمی برای بدست آوردن منبعی جهت تیمار آنهاست. با توسعه سلول درمانی در صدد پیوند هپاتوسیت برآمدند تا این روش جایگزین پیوند کل کبد شود. تمایز سلول های بنیادی جنینی که سلول هایی پرتوان با قدرت تکثیر بالا هستند که به عنوان منبعی ایده ال برای تولید هپاتوسیت مطرح می شوند. هپاتوسیت های مشتق شده از سلول بنیادی جنینی علاوه بر استفاده در درمان بیماری های کبدی برای مطالعه تکوین کبد و آزمون های کشف دارو نیزکاربرد دارند. اما گزارشات نشان میدهد، تا بحال تولید هپاتوسیت های بالغ و کارا از سلول های بنیادی جنینی در محیط آزمایشگاه به میزان کم صورت میگیرد. شاید به این علت که سرنوشت سلول بنیادی جنینی علاوه برفاکتور های رشد و ترکیب شیمیایی بستر، تحت تاثیر ساختار فیزیکی بستر خارج سلولی نیز است که به عنوان یک فاکتور مهم در تنظیم خود نوزایی سلول بنیادی و باعث پیشبرد عملکرد های سلول ,بیان ژن ,تکثیر و تمایز آن می شود. برای رسیدن به این هدف ما نیاز به استفاده از فاکتورها و بستر مناسب داریم که ساختاری شبیه بدن داشته باشد که شاید سلول های بنیادی جنینی در این برهم کنش ها، در روند تمایز، به بلوغی برسند که برای انجام عملکردهایش در شرایط آزمایشگاه ضروری است. بستر های طبیعی که برای پوشش دادن ظروف آزمایشگاهی و کشت سلول استفاده می شود ترکیباتش از ظرفی به ظرف دیگر کمی متفاوت است و همچنین حاوی فاکتورهای بیماریزا است و نیز بازتابی از ژئومتری و تخلخل و ابعاد سه بعدی غشای پایه برای سلول نیست. بنابراین در راستای رسیدن به تمایز کاراتر و حفظ عملکرد هپاتوسیت مشتق شده ازسلول های بنیادی جنینی، ما در این مطالعه برای تمایز هپاتوسیتی hesc از بستر مسطح نانوفیبری با روش الکتروسپین استفاده کردیم، که ساختاری شبیه غشای پایه که زیر سلول های اپتلیالی را فرش میکند، دارد. کیفیت تمایز در سه مرحله تکوینی یعنی اندودرم، هپاتوسیت ابتدایی و بالغ مورد ارزیابی قرار گرفت و در سطح ژن (با تکنیک های rt-pcr) و (qrtودر سطح پروتیین (ایمونوفلورسنت و فلوسیتومتری) و آزمون های عملکرد(از قبیل ترشح، جذب و ذخیره سازی) آزموده شدند. به منظور تعیین نقش بستر نانوفیبری در حفظ عملکرد هپاتوسیت مشتق شده ازسلول های بنیادی در طولانی مدت در آزمایشگاه، چند روز بعد از روز آخر تمایز نیز کارایی بررسی شد. این مطالعه راهی نو در تولید هپاتوسیت های بالغ و کارا از سلول های پرتوان برای استفاده در درمان بیمارهای کبدی، مهندسی بافت و یا استفاده در غربال داروها در اختیار محققین قرار می دهد.

تکثیر و خودنوزائی دو ویژگی مهم سلول های بنیادی است. عوامل بسیار زیادی بر تکثیر و خودنوزائی سلول-های بنیادی تأثیر می گذارند. برخی از مهم ترین این عوامل، فاکتورهای خارج سلولی هستند. این فاکتورها، مسیرهای پیام رسانی را در داخل سلول فعال می کنندکه منجر به رخدادهای مهمی در داخل سلول می شود. یکی از این رخدادها، بیان ژن است. سلول های بنیادی پیش ساز عصب به دلیل اهمیت، در این پایان نامه برای مدل سازی در نظر گرفته شده اند. از جمله مهم ترین فاکتورهای خارج سلولی موثر بر تکثیر و خودنوزائی سلول های بنیادی پیش ساز عصب، فاکتورهای رشد egf و bfgf می-باشد. این فاکتورهای با فعال کردن برخی مسیرهای پیام رسانی از جمله erkو akt و بیان برخی ژن ها، از جمله c-fos، سرنوشت سلول را تحت تأثیر قرار می دهند. در این پایان نامه ما به مدل سازی مسیرهای پیام رسانی egf و bfgf، از سطح سلول تا بیان ژن c-fos پرداخته ایم. این مدل بر اساس معادلات دیفرانسیل مرتبه اول غیرخطی است. معادلات دیفرانسیل مدل، بر اساس قوانین شیمیائی حاکم بر مسیرهای پیام رسانی استخراج شده اند. پارامترهای موجود در مدل، که شامل شرایط اولیه و ضرایب قدرت واکنش هاست، بر اساس اطلاعات کیفی و کمی موجود و همچنین آزمایشات انجام گرفته برای بیان ژن c-fos، بدست آمده است. مدل ارائه شده دراین پایان نامه شامل 164 واکنش و 351 پارامتر است. نتایج حاصل از مدل به خوبی توصیف کننده نحوه فعال شدن فاکتورهای موجود در مسیرهای پیام رسانی و بیان ژن c-fos تحت تأثیر فاکتورهای egf و bfgf می باشد.

روش های بسیاری برای کشت و تکثیر سلول های پرتوان انسانی وجود دارد. با این حال هنوز چالش های تکنیکی مهمی باقی مانده است، از آن جمله می توان به ماتریکس ها به عنوان فراهم کننده بستر کشت مناسب و آنزیم های مورد استفاده در روند کشت این سلول ها اشاره کرد. در مورد بسترهای کشت، ماتریژل به عنوان یک بستر تجاری که از سلول های نوعی سارکومای موشی تهیه می شود، هنوز به عنوان بستر کشت در بیشتر آزمایشگاه ها به صورت گسترده ای استفاده می شود. همچنین در مورد آنزیم ها، انواعی از آن ها در بیشتر آزمایشگاه ها استفاده می شود که شامل کلاژناز ، دیسپاز، آکوتاز و انواع تریپسین (مهندسی شده و طبیعی) می باشد، که علاوه بر آنکه کار با آن ها تا حدودی مشکل می باشد، اغلب در کشت هایی که به روش آنزیمی پاساژ داده می شوند آنومالی های ژنتیکی گزارش شده است که استفاده از این آنزیم ها را تا حدودی زیر سوال می برد. در این گزارش ما جزییات تهیه بستر کشت جدیدی را ارایه کرده ایم که تهیه آن آسان و کاربردی است و مهم تر آنکه عاری از هرگونه مشتقات حیوانی است. این بستر از محیط کشت رویی سلول های فیبروبلاست پوست انسانی و بدون استفاده از سرم تهیه می شود. همچنین کشت سلول های پرتوان انسانی بر این بستر از طریق روش های معمول مکانیکی نظیر استفاده از ابزارstempro® ezpassage، بسیار موثرتر، ایمن تر و راحت تر از روش های آنزیمی انجام می شود و مشکلات کار با آنزیم ها را نیز ندارد. با استفاده از دو رده بومی(تولید شده در ایران- پژوهشگاه رویان) سلول های بنیادی جنینی انسانی و دو رده بومی از سلول های بنیادی القایی نشان داده ایم که بستر حاصل از hcm، کشت طولانی مدت سلول های پرتوان انسانی را پشتیبانی می کند. مورفولوژی و بیان آلکالین فسفاتاز در این شرایط مشابه گروه کنترل بود. کاریوتیپ رده های سلولی کشت شده بر این بستر حتی پس از 15 بار پاساژ سالم مانده بود. بیان مارکرهای سطحی مرسوم برای حالت غیر تمایزی شامل: tra 1-81 و ssea3 با تکنیک رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس و همچنین بیان چهار ژن بسیار مهم هسته ای موثر در بنیادینگی شامل oct4 ، sox2، nanog و klf4توسط تکنیک rt-pcr نشان داده شده است. به علاوه، توسط همین تکنیک بیان چند ژن منتخب از هر سه لایه زاینده جنینی، حاصل از تمایز خودبخودی از طریق تشکیل اجسام شبه جنینی جهت تایید آزمایشگاهی پرتوانی سلول ها، نشان داده شده است. این بستر و روش کشت مکانیکی، ما را قادر می سازد تا بتوانیم سلول های پرتوان انسانی را بدون استفاده از مشتقات حیوانی، به صورت کاملاً کاربردی و ساده تر کشت دهیم. استفاده از این بستر و روش کشت، مسیر ما را به سمت کاربردهای کلینیکی تکنولوژی سلول های بنیادی پرتوان انسانی نزدیک تر می کند.

سلولهای بنیادی جنینی سلولهای با قدرت پر توانی و خود تکثیری بالا که قابلیت تمایز به انواع مختلفی از سلولها از جمله سلولهای عصبی , قلبی و کبدی را دارا می باشند. هدف از این مطالعه بررسی توانمندی سلولهای بنیادی جنینی انسانی royan h5 , royan h6 و سلولهای پرتوان القایی o-بمبئی (b-hipsc)در تمایز به سلولهای اریتروئیدی می باشد. روش ها : سلولهای بنیادی جنینی انسانی و سلولهای پرتوان القایی به صورت سوسپانسیون کشت و تکثیر داده شدند و در طی سه مرحله و در حضور ترکیبات القا کننده به سلولهای بلاست و در نهایت به سلولهایی اریتروئیدی تمایز داده شدند.شاخص های سلولهای بلاست kdr, cd31 و cd34 توسط فلوسیتومتری و بیان ژن های tal-1 , runx-1, cd34 و c-kit توسط quantitative real time pcr بررسی شدوتوسط تست سنجش کلونی زایی عملکرد بلاست ها در محیط نیمه جامد متیل سلولز ارزیابی شد و شبه کلونی های مختلط خونی تولید شده در متیل سلولز برای شاخص های اریتروئیدی مورد بررسی قرار گرفت. کلونی های اریتروئیدی تولید شده در محیط کشت سوسپانسیون فاقد متیل سلولز توسط شاخص های hbf, cd71 و gpa به وسیله فلوسیتومتری و بیان ژنهای ?,? و ? گلوبین به وسیله quantitative real time pcr مورد بررسی قرار گرفت. نتایج:نتایج نشان داد که سلولهای بنیادی جنینی انسانی و سلولهای پرتوان القایی قادرند در شرایط آزمایشگاهی به سلولهای اریتروئیدی تمایز یابند. در سلولهای بنیادی جنین انسان rh5 سلولهای kdr+ (79±12.5%) , cd31+-cd34+ ±2.8%)5.6( و kdr+-cd31+ 6±2.12% ) (درصد از کل سلولهای تمایز یافته را به خود اختصاص دادند.در سلولهای hipsc , kdr+ ( 68±1.2) (4±1.9) cd31+-cd34+, kdr+-cd31+ ±2.3) 9.9 (در صد از کل سلولهای تمایز یافته را به خود اختصاص دادند. نتایج بدست آمده در سلول های royanh6 با نتایج حاصل از سلولهای royanh5 مشابهت داشت. افزایش معنی داری در بیان ژن های tal-1 , runx-1, cd34 و c-kit (فقط در سلولهای تمایز یافته از سلولهای royanh6 )در سلولهای بلاست مشاهده شد(p?0.05) .در سلولهای اریتروئیدی بدست آمده از royanh5 شاخص hbf در حدود % 60±4.2 درصد و شاخص cd71 در حدود% 16±1 درصد و درسلولهای b-hipsc11 , hbf در حدود 82±5.4% در صد و شاخص cd71 در حدود% 38±16.2 درصد بیان مشاهده شد .درهر سه گروه سلولی بیان شاخص gpa مشاهده نشد. بیان.ژن های ?و ? گلوبین در همه گروه مشاهده شد.در حالیکه بیان ژن ? گلوبین در هر سه گروه سلولی مشاهده نگردید. نتیجه گیری: نتایج نشان دادند که سلولهای بنیادی جنینی انسانی (royanh5, royanh6) و سلولهای پرتوان القایی o –بمبئی قادرند در شرایط آزمایشگاهی سلولهای اریتروئیدی تولید کنند که با بیان هموگلوبین ? و ? و هسته دار بودن , ویژگی های سلول اریتروبلاست جنینی (primitive erythroblst ) را دارا می باشند. واژگان کلیدی: سلولهای بنیادی جنینی, سلولهای پرتوان القایی o –بمبئی, سلولهای اریتروبلاست

چکیده مقدمه: سلول های پیش ساز عصب دارای توان خود نوزایی و تمایز به رده های نورونی و گلیالی هستند. بنابراین این سلول ها این قابلیت را دارند که در سلول درمانی بیماری های سیستم عصبی که در اثر از بین رفتن های سلول ها ایجاد می شوند، به کار روند. برای استفاده از این سلول ها در درمان بیماری های سیستم عصبی با مشکلاتی مواجه هستیم، از جمله تکثیر این سلول ها و تمایز جهت دار آن هاست. برای این که تکثیر و تمایز سلول های پیش ساز عصب را افزایش دهیم، اثر بررسی chir را به وسیله ی کوچک مولکول 99021 (gsk3) مهار گلیکوژن سنتاز کیناز 3 کردیم. مواد و روش ها: سلول های پیش ساز عصب انسانی از سلول های پرتوان القائی انسانی تهیه شد. gsk استفاده شد و برای بررسی برهمکنش 3 gsk برای مهار 3 chir کوچک مولکول 99021 به ترتیب برای pifithrin ? و xav939 ،dapt با مسیر های دیگر از کوچک مولکول های mtt استفاده شد. تکثیر سلول ها با استفاده از تست p و 53 ?-catenin ،notch مهار سیگنالینگ فلوسایتومتری انجام شد. برای بررسی بیان ژن و پروتئین به ترتیب از ki تعیین شد و برای بیان 67 و ایمونوفلوروسنس استفاده شد. qpcr تکثیر سلول های پیش chir نشان داد که 99021 ki و 67 mtt نتایج: آنالیز داده های تست ساز عصب مشتق از سلول های بنیادی پرتوان القائی را طی 10 پاساژ افزایش داد و بررسی کاریوتایپ آن ها پایداری کروموزوم ها را تایید کرد. 5 تکثیر را xav و 939 dapt اثری روی تکثیر سلول ها نداشت در حالی که pifithrin ? و (notch ژن های مربوط به سیگنالینگ ) hes و 5 hes کاهش دادند. بیان ژن های 1 در سلول های پیش ساز (?-catenin فاکتور های رونویسی مرتبط با ) c-myc و cyclind1 و dapt را دریافت کرده بودند به طور معنی دار در مقایسه با گروه chir عصب که 99021 باعث افزایش نورون زایی شد. ،chir و کنترل افزایش یافت. در روند تمایز، 99021 xav939 دریافت کرده بودند chir اثری بر نورون زایی سلول های پیش ساز عصب که 99021 dapt نورون زایی را به طور کامل در این گروه مهار کرد. بیان ژن های xav نداشت در حالی که 939 و lmx1b ،lmx1a ،th و نیز ژن های دوپامینرجیکی مثل map و 2 ngn نورونی مثل 3 افزایش یافت. chir در اثر حضور 99021 nurr1 و فعال ?-catenin از طریق افزایش سطح gsk نتیجه گیری: نتایج ما نشان می دهد که مهار 3 تکثیر سلول های پیش ساز عصب مشتق از سلول های پرتوان القائی را افزایش می notch کردن تمایز نورونی به سمت سرنوشت نورونی را از طریق افزایش پایداری chir دهد. همچنین 99021 ngn و 3 neurod و درنتیجه افزایش بیان ژن های پیش برنده ی نورونی مثل 1 ?-catenin پیش برد و بیان ژن های دوپامینرجیک را افزایش داد.

خانواده ژن های hox ، ژن های بسیار مهمی در تکوین سیستم عصبی مهره داران به شمار می آیند. از آنجایی که این ژن ها در ناحیه تنظیمی خود retinoic acid response element دارند، انتظار می رود که حضور رتینوئیک اسید در روند تمایز سلول های بنیادی یه سلول های پیش ساز عصب بیان ژن های hox را تحت تاثیر قرار دهد. از آنجایی که هر تغییری در بیان ژن ها معلول تغییرات اپی ژنتیکی در ناحیه تنظیمی آن هاست؛ در طرح حاضر به بررسی تغییرات اپی ژنتیکی ژن های hox در روند تمایز سلول های بنیادی جنینی انسانی به سلول های پیش ساز عصب در حضور وعدم حضور رتینوئیک اسید پرداختیم. در ابتدا به منظور اطمینان از روند تمایزی القا شده به سمت سلول های عصبی، سلول های تمایز یافته از نظر بیان شاخص های عصبی nestin وsox1 با استفاده از تکنیک ایمونوسیتوشیمی و فلوسایتومتری بررسی شدند. سپس به بررسی کمی بیان ژن های hox در هر دو گروه تمایزی پرداختیم. بررسی ها نشان داد که تمامی ژن های hox بررسی شده (گروه های 1 تا 5) در حضور رتینوئیک اسید در هر دو مرحله اکتودرم و پیش ساز عصب افزایش بیان معنی داری را نشان می دهند. در حالی که بدون حضور رتینوئیک اسید تنها در ژن های hoxa2, hoxa3, hoxa5, hoxd1 وhoxd4 افزایش بیان معنی دار مشاهده می شود و در ژن های hoxb3, hoxb4, hoxb5 وhoxd1 کاهش بیان نسبت به مرحله سلول های بنیادی در هر دوگروه مشاهده شده و بیان سایر ژن ها نسبت به حالت بنیادی تغییری چشمگیری نکرده است. نتایج بررسی ناحیه تنظیمی ژن های hox در مراحل اکتودرم عصبی و سلول های پیش ساز عصب در حضور رتینوئیک اسید کاهش مدیفیکاسیون h3k27me3 و افزایش مدیفیکاسیون h3k4me3 را نشان داده و در مرحله اکتودرم عصبی بدون حضور رتینوئیک اسید افزایش مدیفیکاسیون h3k27me3 و کاهش مدیفیکاسیون h3k4me3 را نشان می دهد. نتایج بررسی حضور دو آنزیم دمتیلاز utx وjmjd3 نشان می دهد که حضور آنزیم utx در ناحیه تنظیمی ژن های hox در مرحله اکتودرم عصبی در حضور رتینوئیک اسید، افزایش چشمگیری داشته است؛ اما در مرحله پیش ساز عصب مجددا کاهش یافته است. در حالی که حضور آنزیم utx در ناحیه تنظیمی ژن های hox در مرحله اکتودرم عصبی بدون حضور رتینوئیک اسید، افزایش نداشته و در برخی ژن ها کاهش نیز مشاهده می شود. آنزیم jmjd3 در مرحله قبل از تمایز (سلول های بنیادی) در ناحیه تنظیمی این ژن ها حضور دارد ولی در مرحله اکتودرم عصبی در حضور رتینوئیک اسید، حضور این آنزیم کاهش یافته و در مرحله پیش ساز عصب مجددا افزایش می یابد. این در حالی است که حضور این آنزیم در مرحله اکتودرم عصبی بدون حضور رتینوئیک اسید، بطور چشمگیری افزایش داشته است ولی در مرحله پیش ساز عصب مجددا کاهش می یابد.

مقدمه: rest (فاکتور رونویسی خاموش کننده متصل شونده به ناحیه (re1 عنصری ضروری در تکوین طبیعی مغز است. rest هم چنین برای حفظ پرتوانی سلول های بنیادی جنینی (escs)و تمایز آن ها به سلول های عصبی در آزمایشگاه اهمیت دارد. بر طبق دانش ما تا به حال گزارشی از الگوی بیان rest و مکانیسم اپی ژنتیکی آن در سلول های بنیادی پرتوان القایی انسانی و نیز سلول های عصبی مشتق شده از آن ها موجود نیست. هدف: در این مطالعه الگوی بیان rest در تمایز مرحله ای سلول های پرتوان انسانی(hesc , hipsc) به سلول های پیش ساز عصبی(npcs) و سپس سلول های بالغ عصبی (mn) بررسی شد. مواد و روش ها: در این مطالعه الگوی بیان ژن rest در هر مرحله با روش q-pcr بررسی شد. الگوی بیان پروتئین آن با روش وسترن بلات و با رنگ آمیزی ایمونوفلورسنت ارزیابی شد. مکانیسم تنظیم اپی?ژنتیکی بیان rest با روش chip q-pcr تعیین شد. نتایج: میزان بیان ژن rest در روند تمایز سلول های بنیادی پرتوان به سلول های پیش ساز عصب به طور معنی?داری کاهش می یابد، اما میزان آن با تمایز به سلول های عصبی بالغ ثابت می ماند. این کاهش بیان همراه با تغیرات اپی ژنتیکی و افزایش برهم کنش با rest است. بیان پروتئین rest در روند تمایز به سلول های پیش ساز در مقایسه با وضعیت پرتوانی افزایش می یابد و در تمایز به سلول های عصبی بالغ کاهش می یابد. داده های ایمونوفلورسنت نشان داد، rest در سلول های بنیادی پرتوان هم در هسته و هم در سیتوپلاسم است ولی در سلول های بالغ عصبی در سیتوپلاسم یافت می شود. نتیجه گیری: نتایج ما الگوی بیان مشابه با یکی ازالگو های گزارش شده از rest در روند تمایز سلول های بنیادی پرتوان انسانی به سلول های عصبی را نشان می دهد. که در این مطالعه ناحیه تنظیمی آن نیز مورد بررسی قرار گرفت. این مطالعه پنجره جدیدی برای انجام آزمایشات بیشتر در این زمینه برای تمایز موثرتر به سلول های عصبی فراهم می کند. واژه های کلیدی: rest، سلول های بنیادی پرتوان انسانی، سلول های پیش ساز عصبی، سلول های عصبی،کنترل اپی ژنتیکی

مقدمه: تولید انبوه و استفاده از روش های کمتر تهاجمی در به دست آوردن سلول های بنیادی مزانشیمی، خصوصا در افراد مسن که ذخایر سلولی کمی دارند، باعث شده است که محققین همواره به دنبال یک منبع مخصوص بیمار (patient specific) برای این سلول ها در پزشکی ترمیمی باشند. هدف ما در این مطالعه تولید سلول های پیش ساز مزانشیمی از سلول های بنیادی پرتوان القایی (hipsc-mps) و بررسی اثرات درمانی آنها در مدل موشی آسیب حاد کبدی حاصل از تتراکلرید کربن (ccl4) بوده است. مواد و روش ها: در این مطالعه از سلول های بنیادی پرتوان القایی انسانی (hipsc-1) استفاده شد که با روش جداسازی مکانیکی به سلول های پیش ساز مزانشیمی تمایز داده شده و از لحاظ مورفولوژی، پروفایل آنتی ژنی و قابلیت تمایز به رده های استخوان و چربی مورد مطالعه قرار گرفتند. سپس این سلول ها به وسیله pkh-67 نشان دار شده و به مدل آسیب حاد کبدی حاصل از ccl4 به میزان 0.6 ml/kg تزریق شدند. مطالعات in vivo جهت بررسی پارامتر های سرولوژیک، میزان قرار گیری سلول های پیوندی و تاثیرات آنها بر میزان تکثیر بافت کبدی و همچنین ترشحات آنها مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج: سلول های پیش سازمزانشیمی ازسلول های بنیادی پرتوان القایی از لحاظ مورفولوژی، پروفایل آنتی ژنی و قابلیت تمایزی شبیه به سلول های مزانشیمی مغز استخوان داشته و پیوند آنها موجب بهبود عملکرد کبدی در مدل ما شدند. حیواناتی که سلولهای پیش سازمزانشیمی ازسلولهای بنیادی پرتوان القایی را دریافت کرده بودند از لحاظ زنده مانی، پارامترهای سرولوژیک نظیر لاکتات دهیدروژناز (ldh)، بیلی روبین و همچنین لیپید پراکسیداسیون (lp) نتایج بهتری را نشان دادند. از طرفی سلول درمانی با hipsc-mps موجب کاهش 30% در شاخص فعالیت هیستولوژیک (hai) و افزایش سه برابری سلول های در حال تقسیم بافت کبدی شد. به علاوه این تغییرات به همراه کاهش معنی دار در بیان ژن های کلاژن نوع i، mmp13، mmp9و mmp2 و همچنین افزایش معنی دار در بیان ژن های timp1 و timp2 بود. این سلول های پیوندی قابلیت ترشح فاکتور رشد هپاتوسیتی را نیز داشتند. نتایج مشابهی در گروه پیوندی سلولهای مزانشیمی مغزاستخوان انسانی به دست آمد. نتیجه گیری: به طور کلی نتایج ما نشان دادند که hipsc-mps جایگزین مناسبی برای پیوند سلولهای مزانشیمی مغز استخوان در ترمیم آسیب حاد کبدی بوده و با تولید انبوه این سلول های مخصوص بیمار به روش غیر تهاجمی می توان موجب بهبود و حمایت بافت کبدی شد.

مقدمه: سلول های بنیادی اسپرماتوگونی مسئول حفظ اسپرماتوژنز در طول حیات جنس مذکر می باشند . مطالعه این سلول ها از دو جهت دارای اهمیت می باشد: 1) دانش پایه ما در ارتباط با این سلول ها با توجه به اهمیت این سلول ها بسیار کم است و2) از طرفی پتانسیل این سلولها برای استفاده درکاربردهای پزشکی از جمله سلول درمانی و برگرداندن قدرت باروری و بسیاری موارد دیگراهمیت مطالعه این سلول ها را دو چندان می کند.گروهای مختلفی توانسته اند این سلولها را در آزمایشگاه در شرایط مختلف کشت داده و نگه داری کنند. بر اساس مطالعات انجام شده، در کشت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی به صورت تصادفی و خود به خودی کلونی هایی شبه کلونی های سلولهای بنیادی جنینی متشکل از سلوهای شبه سلولهای بنیادی جنینی ظاهر می شوند که اعتقاد براین است که این سلولها پرتوان هستند امایکی از مشکلاتی که در گزارشات دیده می شود این است که بازده به دست آوردن این کلونی ها بسیار کم است . هدف: بر طبق مطالعات انجام شده در کشت وتولید سلولهای بنیادی جنینی با بازده بالا با استفاده از ریز مولکول chirدر ترکیب با دیگر ریز مولکولها, این ریزمولکول از طریق مهار gsk-3 و فعال کردن مسیرwntعمل میکند. اما هیچ گزارشی در مورد مکانیسم عملchirدر تولید سلولهای gpscs وجود ندارد. به همین دلیل مطالعه حاضر به بررسی مکانیسم عمل chir در تولید سلولهای gpscs از سلولهای بیضه ی موش نوزاد می پردازد. مواد و روشها : در این مطالعه ابتدا سلولهای بیضه ای موش نوزاد طبق پروتوکل مروجی و همکاران و همچنین درحضوردیگر مهار کنندهای gsk-3 مانند bio,kenpaulone به سلولهای بنیادی پرتوان جنسی(gpscs) تبدیل و سپس تعداد کلنیها در روزهای 4، 6،8 و12شمارش گردید. پس از آن از مهارکنندهای اجزاء کمپلکس تجزیه کننده ?-catenin شامل مهارکنندهای خو ?-cateninدرسطح سیتوپلاسم (xav939) و در سطح هسته(pnu74654) برای تشخیص اهداف پایین دست ?-catenin استفاده و تعداد کلنیها در روزهای 4، 6،8 و12شمارش گردید. سپس بیان ژنهای oct4، nanog، gfr?1، و plzf در سطح پروتئین با روش ایمونوفلورسنت بررسی گردید. همچنین با استفاده از تست tunnel نیز آپوپتوز در کلنی ها بررسی گردید. نتایج: در روز ششم اختلاف معنی داری بین گروه های chir+xav ، chir+pnu و chir+xav+pnu با گروه chir دیده شد. کلنی های روز چهارم و ششم که مد نظر ما بودند هیچ یک از ژنهای مختص پرتوانی یا سلولهای زایای بررسی شده را چه در سطح mrna و چه در سطح پروتئین بیان نمی کردند. بررسی آپوپتوز به صورت in situ هیچ گونه آپوپتوزی را نشان نداد. نتیجه گیری: براساس داده های ما تفاوت معنی داری درکلنی های روز ششم بین گروه های مورد مطالعه وجود داشت که نشان دهنده ی این است که chir از طریق مهار gsk-3? و فعال کردن ?-catenin عمل می کند. کلنی های تولید شده هیچ یک از ژنهای پرتوانی و ژنهای شاخص سلولهای زایای مورد بررسی قرار گرفته در این تحقیق را بیان نمی کنند بنابراین ماهیت این کلنی ها نامشخص می باشد. کلمات کلیدی: موش نوزاد، بیضه، سلولهای بنیادی پرتوان جنسی(gpscs)، chir، مکانیسم عمل

سلول های بنیادی جنینی، سلول های پر توانی هستند که دارای دو خصوصیت مهم خود نوزایی و توانایی تبدیل شدن به سه لایه زاینده جنینی را دارند. این سلول ها برای اولین بار در اوایل سال 1980 از موش و همچنین در اواخر سال 1990 از پریمات ها و انسان جداسازی شدند. در این بازه زمانی و پس از دهه 90، جانداران مختلفی به عنوان نمونه مدل انتخاب و سلول های بنیادی جنینی پرتوان آنها بنابراهداف محققین، جداسازی و مورد بررسی قرار گرفتند. در کنار سایر نمونه های مدل، رده پرندگان و به طور خاص جنین جوجه، نیز مورد توجه قرار گرفت و اولین رده سلول های پرتوان جنینی جوجه در سال 1996 که حاصل جداسازی و انتقال بلاستودرم جنین جوجه در مرحله x بر اساس جدول eg & k بود، تولید و در محیط آزمایشگاه برای طولانی مدت نگهداری شد. این سلول ها همانند سایر سلول های پرتوان جنینی، تحت شرایط خاص کشت، وضعیت خودنوزایی و همچنین توانایی تمایز یافتن به سه لایه جنینی را داشتند. در این طرح مشاهده گردید که برای دستیابی به رده سلول های بنیادی جنینی جوجه، فاکتورهای رشد، سیتوکین ها و به خصوص کوچک مولکول ها نقش مهمی ایفا می کنند. تا به امروز تحقیقات زیادی برای تولید و حفظ این سلول های پرتوان، جهت دستیابی هر چه بیشتر به فرایند هایی که در طی تکوین رخ می دهد، انجام شده است. با این وجود هنوز ناگفته های زیادی در این مسیر دیده می شود و تلاش بر اینست که بتوان مسیرهای ناشناخته برای حفظ این سلول های پرتوان در محیط آزمایشگاهی را بخوبی شناسایی کرد و رده این سلول های پرتوان را تولید کرد. واژگان کلیدی: بلاستودرم جنین جوجه، سلول های بنیادی جنینی پرتوان، سلول های بنیادی جنینی جوجه، کوچک مولکول ها

cdna ی ژن پروتئین پراکسی زومی (pep) یاfndc5،کدکننده ی پروتئینی 209 اسید آمینه ای است که کلونینگ گونه ی موشی آن در سال 2002 میلادی صورت گرفته است. نشان داده شده که بیان pep / fndc5 ، در روند تمایز سلول های بنیادی موشی به ویژه در سلول های پیش ساز عصب، افزایش می یابد. همچنین کاهش بیان pep/fndc5 میزان عصب زایی را در سلول های بنیادی موشی در حدود60% کاهش می دهد. این داده ها در مجموع پیشنهاد می دهند که ممکن است pep/fndc5 در تمایز عصبی نقش ایفا کند. علاوه براین نشان داده شده که کینازهای فعال شونده توسط میتوژن ها ( mapks ) ، که بزرگراه پیام رسانی در مسیرهای پیام رسانی گوناگون هستند، بسته به نوع سلول، نوع القاگر و روش کار، نقش مهمی را در تمایز عصبی ایفا می کنند. نقش pep/fndc5 در عصب زایی ناشناخته است. یکی از روش های مفید در شناسایی نقش یک ژن یا یک پروتئین، یافتن رابطه ی آن با مسیرهای پیام رسانی شناخته شده در فرآیندهای سلولی است. هدف از این پژوهش بررسی این مسئله است که آیا میان فعال شدن mapkها و بیان pep/fndc5 هماهنگی وجود دارد؟ در صورت وجود هماهنگی، می-توان برای درمان بیماری هاینورودژنریتیو ، کاربردهای پزشکی گوناگونی را پیشنهاد داد. در این پژوهش یک روند گام به گام برای بررسی بیان pep/fndc5 با استفاده از real time pcr و فعال شدن mapkها با استفاده از western blot، در روند تمایز عصبی سلول های بنیادی موشی انجام شد که نشان دهنده ی وجود هماهنگی میان بیان pep/fndc5 و روند فعال شدن erk1/2 ، می باشد.

هدف: سیروز کبدی یکی از علل عمده مرگ و میر در جوامع بشری است، و در حال حاضر پیوند کبد به عنوان تنها راه نجات بخش بیماران مبتلا به آن شناخته شده است. اما به دلیل مشکلاتی که وجود دارد، دانشمندان به سمت سلول درمانی سوق پیدا کرده اند که به دلیل ویژگی های سلول های بنیادی مزانشیمی از جمله امکان استفاده اتولوگ، جایگزین مناسبی در این زمینه می باشند. نتایج حاصل از پیوند سلول های بنیادی مزانشیمی در جانوران مدل نشان داده که اثرات پیوند این سلول ها کوتاه مدت است. لذا در این مطالعه سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسان با هدف تجدید اثر کوتاه مدت آنها در چند مرتبه به مدل موشی فیبروز کبدی حاصل از تزریق تتراکلریدکربن، پیوند شد. روش: فیبروز کبدی با استفاده از تزریق داخل صفاقی تتراکلریدکربن با دوز ml/kg 1 به موش های ماده nmri با دوبار تزریق در هفته و به مدت چهار هفته ایجاد گردید. گروه ها شامل: 1) نرمال ( موش های طبیعی)، 2) شم (تزریق تتراکلریدکربن و حامل سلول ها)، 3) گروه‍‍‍‍ی که یک بار 106 ×3 سلول در پایان هفته چهارم به آنها پیوند زده می شود (1tx)، 4) گروه‍‍‍‍ی که سلول ها را در پایان هفته های چهارم، پنجم و ششم و هربار به میزان 106×1 سلول دریافت می کنند (3tx). سلول های مزانشیم مغز استخوان با pkh26، نشان دار و از طریق رگ دمی پیوند زده شدند. نمونه برداری در گروه های سلول درمانی، یک و سه هفته پس از آخرین پیوند سلول و در گروه شم در انتهای هفته های پنجم، هفتم و نهم صورت گرفت. نتایج: در این مطالعه مشاهده شد که میزان بقای موش ها در گروه 3tx بیشتر از گروه های دیگر بود. همچنین میزان لانه گزینی سلول ها در گروه 3tx تقریبا سه برابر گروه 1tx ارزیابی شد، اما هیچ تمایزی از سلول های لانه گزینی کرده در کبد به هپاتوسیت، مشاهده نگردید. میزان نکروز و فیبروز بافتی و بیان ژن های وابسته به فیبروژنز (col1a1, timp1َ)، در گروه 3tx کمتر از 1tx بود، در حالی که بیان ژن وابسته به فیبرولیز(mmp13) در گروه 3tx بیشتر بود. با ارزیابی تست های سرم شناسی کبد مشاهده شد که میزان alt در گروه 3tx بیشتر از 1tx بود که نشان دهنده لانه گزینی بیشتر سلول ها در گروه 3tx است. . میزان آلبومین هم در بین گروه ها، تفاوت معنی داری را نشان نداد. نتیجه گیری: داده های حاصل از این مطالعه نشان داد که تکرار دفعات پیوند سلول می تواند سبب افزایش بهبود فیبروز کبدی شود.

با تولید اولین رده‏ی‏ سلول های بنیادی جنینی موشی و پس از آن رده های انسانی، مطالعات گسترده ای در رابطه با زیست‏شناسی سلول های بنیادی پرتوان صورت گرفته است. تولید و نگهداری این سلول ها در آزمایشگاه و حفظ حالت پرتوانی آن ها در پیشرفت علوم داروسازی، سم‏شناسی، سلول‏درمانی، مدل‏سازی بیماری ها و تحقیقات پایه نقش بسزایی دارد. سلول های بنیادی جنینی از جنین های مرحله‏ی بلاستوسیست موشی به دست می‏آیند، اما دسته‏ی دیگری از سلول های پرتوان موشی با نام سلول های بنیادی اپی‏بلاستی(episcs) که از اپی‏بلاست جنین‏های پس از لانه‏گزینی گرفته می شوند،دارای مشابهت بسیاری با سلول های بنیادی جنینی انسانی(hescs) هستند. تولید سلول‏های episc نسبت به دیگر انواع سلول‏های پرتوان از آن جهت حائز اهمیت ویژه است که می‏توان با استفاده از آن‏ها بخشی از وقایع پس از لانه‏گزینی را در محیط آزمایشگاه مورد مطالعه قرار داد. هدف از این طرح، تهیه و جداسازی سلول های بنیادی اپی‏بلاستی موشی است. برای این منظور، جنین‏های موشی 5/6 روزه که در مرحله‏ی بعد از لانه‏گزینی و قبل از مرحله ی گاسترولاسیون قرار دارند، بادقت از بافت رحم خارج شده و ناحیه‏ی اپی‏بلاست آن‏ها پس از جداسازی در محیط کشت حاوی مقادیر مناسب عوامل رشد activin و bfgf کشت داده شد. سلول‏های اپی‏بلاست، پس از انتقال به محیط کشت مناسب، با موفقیت تشکیل کلونی‏های شاخص episc دادند که مشابه کلونی hescs بودند و ماهیت آن‏ها با معیارهای ریخت‏شناسی(کلونی‏های مسطح از سلول‏هایی با نسبت هسته به سیتوپلاسم بالا) و مولکولی(نشانگرهای پرتوانی با رنگ‏آمیزی ایمونوفلورسانت) تایید شد. تولید این نوع مهم از سلول‏های بنیادی پرتوان، ‏روشی قابل ردیابی برای مطالعه‏ی آزمایشگاهی فرآیندهای گاسترولاسیون و رشد بعد از لانه‏گزینی و چگونگی تبدیل سلول‏های پرتوان به انواع تمایزیافته را در محیط آزمایشگاهی فراهم می‏آورد.

دژنراسیون سلول های گانگلیون شبکیه شیوع بالایی در چندین بیماری چشم از جمله آسیب های مکانیکی وارده به عصب بینایی دارد. تا کنون درمان موثری در درمان این بیماری های ناتوان کننده وجود ندارد. امروزه فناوری سلول های بنیادی و سلول درمانی روشی مهم برای درمان و جایگزینی سلول های از دست رفته به شمار می رود، این مطالعه امکان حفاظت نرون های آسیب دیده و همچنین تمایز و جایگزینی سلول های پیش ساز عصب مشتق از سلول های بنیادی پر توان القایی انسانی در شبکیه موش های صحرایی را بررسی نموده است. دو روز بعد از ایجاد آسیب در عصب بینایی موش های صحرایی در داخل زجاجیه تزریق شدند. بررسی عملکرد عصب بینایی با استفاده از آزمون پتانسیل بر انگیخته بینایی حاکی از بهبود معنی دار در آمپلی تود موج ها در گروه دریافت کننده سلول ها بود. شمارش سلول های گانگلیون در گروه های مختلف، با استفاده از رنگ dii بعنوان نشانگر پس گرا بدنبال تزریق آن در برجستگی های فوقانی بیانگر بقاء بیشتر سلول های گانگلیون در گروه های دریافت کننده سلول و یا دریافت کننده محیط کشت سلول ها بود. بررسی های ایمونوفلورسنت در جستجوی تعیین سرنوشت سلول های پیوندی موید این مطلب بود که سلول های پیش ساز عصب علاوه براینکه به درستی در لایه گانگلیونی شبکیه قرار گرفته اند شاخص اصلی این سلول ها را هم بیان می کردند. این نتایج نشان داد که پیوند سلول های پیش ساز عصب قدامی مشتق از سلول های بنیادی پر توان القایی در موش های صحرایی مدل آسیب عصب بینایی علاوه بر بهبود عملکرد بینایی با محافظت از سلول های میزبان و رژنراسیون آکسونی، در شبکیه هم جایگزین شده و شاخص سلول های گانگلیون را بیان کردند. این سلول ها ممکن است افق جدیدی را در بحث سلول درمانی در صدمات عصب بینایی و از دست رفتن سلول های گانگلیون که بوسیله بیماری های دیگر ایجاد می شود را ایجاد کنند.

اندودرم یکی از سه لایه زایای جنینی است که اندامهایی چون کبد و پانکراس از آن مشتق می شود. با تمایز هدفمند سلولهای بنیادی پرتوان به اندودرم، می توان یک مرحله به تولید سلول نهایی مربوط به بافت اندامهای مشتق از آن نزدیکتر شد. در این کار تحقیقاتی هدف افزایش کارایی تمایز سلولهای بنیادی پرتوان به سلولهای اندودرمی با رویکردهای مهندسی است. برای این منظور نانو الیاف پلی کاپرولاکتون به روش الکتروریسی تهیه شدند. برای اصلاح سطح نانو الیاف، ابتدا گروههای آمین با آمینولیز گروههای استری پلی کاپرولاکتون ایجاد شد. برای سنجش میزان گروههای آمین روی سطح نانو الیاف از روش نینهیدرین استفاده شد. در مرحله بعدی گروههای آمین سطح، با ماده دی سوکسینیمید کربنات واکنش داده شد. برای بررسی بیشتر گروههای عاملی روی سطح نانو الیاف از آزمون اسپکتروسکوپی atr-ftir استفاده شد. به منظور تثبیت فاکتور رشد اکتیوین بر روی سطح نانو الیاف، بسترهای الکتروریسی شده در محلول اکتیوین، قرار داده شدند. رنگ آمیزی ایمونوفلوروسنتت حضور فاکتور رشد بر روی نانو الیاف و در دسترس بودن قسمت عملکردی آن را تاییدکرد. در مرحله بعدی سلولهای بنیادی پرتوان بر روی بسترهای نانو لیفی متصل به اکتیوین، کشت داده شدند. بررسی نشانگرهای اندودرم در سطح m-rna و پروتئین کارایی فاکتور رشد تثبیت شده بر روی سطح را تایید کرد.

مقدمه: سلول های بنیادی بعنوان یک درمان بالقوه برای ضایعات نخاعی بوده و انواع متعددی از سلول های بنیادی در مدل های حیوانی و انسانی ارزیابی شده اند. سلول های پرتوان القائی با فراهم کردن امکان پیوند سلول از رده سلولی خود بیماربعنوان یک منشا سلولی جالب توجه برای سلول درمانی در طب ترمیمی مطرح می باشد. دراین مطالعه، پتانسیل پیوند دو نوع سلول پیش ساز عصبی و پیش ساز اولیگودندروسیت مشتق شده از سلول های پرتوان القائی انسانی ، در بهبود پاسخ حسی و حرکتی با پیوند هریک از این سلول ها به تنهائی در یک ضایعه نخاعی شدید بررسی شد. روش انجام کار: دو نوع سلول پیش ساز عصبی و پیش ساز اولیگودندروسیت از سلول های پرتوان القائی انسان تولید شدند. سلول های پیش ساز اولیگودندروسیت مارکرهای ویژه پیش سازی مانند pdgfr?, ng2, a2b5, o4 را بیان کردند. سلول های پیش ساز عصبی ویژه گیهای مولکولی پیش ساز عصبی مانند nestin وsox1 را بیان کردند. شش گروه مطالعه شامل گروههای کنترل جراحی ،دریافت کننده فیبروبلاست و pbs ( بعنوان گروههای شم) ، دریافت کننده پیش ساز اولیگودندروسیت ، پیش ساز عصبی و پیش ساز اولیگودندروسیت و پیش ساز عصبی طراحی شدند. سلول ها هفت روز پس از ایجاد یک ضایعه نخاعی شدید با مدل contusion در موش صحرائی پیوند شدند. شدت ضایعه توسط بافت شناسی تائید شد. تست های رفتاری حسی ( پلنتار) و حرکتی ( bbb) بمدت 5 هفته بررسی شدند. مطالعات ایمونوهیستوفلوروسنت 5 هفته پس از پیوند جهت ارزیابی بقا سلول ها در اطراف محل ضایعه انجام شد. یافته ها: تست های رفتاری در طی پنج هفته حاکی از عدم بهبودی معنی دار آماری در پاسخ حسی و حرکتی در بین گروههای مورد مطالعه بود. اما ،یک بهبود معنی دار در رفتارحرکتی ( در مطالعه درون گروهی) در دو گروه دریافت کننده پیش ساز عصبی ودریافت کننده هر دو سلول در همه هفته ها وجود داشت. نتیجه گیری: با در نظر گرفتن جوانب مختلف، بنظر میرسد که پیوند دو نوع سلول پیش ساز عصبی و اولیگودندروسیت توانسته است یک نقش حفاظتی برای نخاع آسیب دیده فراهم نمایدکه منجر به حفظ نورونها شود. اما نتوانسته است که سبب بهبود حرکتی در طی 5 هفته پس از پیوند شود. ما همچنین دریافتیم که سلول های پیش ساز عصبی و اولیگودندروسیت توانستند برای مدت زمان طولانی در محل ضایعه زنده بمانند. ما چنین فرض کردیم که بهبود بیشتر در رفتار حسی و حرکتی ممکن است مستلزم ارزیابی حیوان برای مدت زمان بیشتر و پیوند تعداد بیشتر سلول در جاهای بیشتر در اطراف محل ضایعه نیاز داشته باشد.

شکل گیری اندودرم قطعی (definitive endoderm) یکی از مراحل مهم در تکوین اندام های مشتق از اندودرم مانند پانکراس و کبد در مهره داران می باشد. به همین دلیل در مطالعات آزمایشگاهی، تولید اندودرم به عنوان منبعی برای تولید انواع سلول های کارآمد در درمان بیماری های مرتبط با این اندام ها از اهمیت بالایی برخوردار است. بنابراین، با نگاه به سلول درمانی، معرفی روش هایی تعریف شده تر، کاراتر و کم هزینه تر بسیار سودمند خواهد بود. در پژوهش حاضر، برای تمایز سلول های بنیادی جنینی انسانی به سلول های اندودرم قطعی، یک پروتوکل دو مرحله ای ابداع گردید: مرحله اول (مرحله priming)، استفاده از فاکتورهای مهار کننده پرتوانی سلول های بنیادی به مدت یک روز و مرحله دوم (مرحله inducing)، استفاده از فاکتورهای تمایز اندودرمی سلول های بنیادی جنینی انسانی به مدت سه روز. فاکتورهای استفاده شده در مرحله priming شامل کوچک مولکول های rapamycin، stauprimide، chir، nsc-308848 و فاکتور رشد اکتیوین a (با غلظت 100 نانوگرم بر میلی لیتر) بود و فاکتورهای استفاده شده در مرحله inducing شامل کوچک مولکول های ly294002، cymarin و ide1/2 و فاکتور رشد اکتیوین a (با غلظت 50 نانوگرم بر میلی لیتر)؛ بدین ترتیب 26 ترکیب از مواد القاگر ذکر شده به عنوان گروه های آزمایشی بکار برده شد و از تیمار فاکتور های رشد اکتیوین a (100 نانوگرم بر میلی لیتر) و wnt3a (25 نانوگرم بر میلی لیتر) به مدت یک روز و اکتیوین a (100 نانوگرم بر میلی لیتر) به مدت سه روز (w/a100-a100) به عنوان کنترل مثبت و تیمار dmso (حلال کلیه کوچک مولکول های بکار رفته) به عنوان کنترل منفی استفاده گردید. سپس بر اساس ارزیابی بیان ژن های مختص اندودرمی sox17 و foxa2 به روش real time rt-pcr، گروه تیمار شده با کوچک مولکول rapamycin (100 نانو مولار)، به مدت یک روز و اکتیوین a (50 نانوگرم بر میلی لیتر)، به مدت سه روز (rapa-a50) انتخاب گردید و این پروتوکل انتخابی به همراه گروه های کنترل در سطح بیان ژن های بیشتر برای تمایز اندودرمی و نیز بیان در سطح پروتئین ارزیابی گردید و سپس برای بررسی شایستگی تمایز بیشتر به سمت سلول های پیش ساز پانکراسی (pp) (توسط 5 پروتوکل) و نیز سلول های درونریز پانکراسی (pe) (توسط 3 پروتوکل) و همچنین سلول های شبه هپاتوسیتی (hlcs) (توسط یک پروتوکل) القا گردید. نتایج بیان شاخص های پانکراسی و کبدی در سلول های اندودرمی انتخاب شده (rapa-a50 و w/a100-a100 [کنترل مثبت]) تیمار شده با پروتوکل های رایج تمایز به سلول های پانکراسی و کبدی نشان داد که اندودرم های تولید شده توسط پروتوکل rapa-a50 قابلیت تمایز به پیش سازهای پانکراسی را با کارایی مشابه با اندودرم های تولید شده توسط پروتوکل w/a100-a100 دارا می باشند درحالیکه هیچ یک از اندودرم ها قادر به تمایز به سلول های pe با 3 پروتوکل امتحان شده نبودند. این در حالی بود که اندودرم های تولید شده توسط پروتوکل rapa-a50 با کارایی مشابه با اندودرم های تولید شده توسط پروتوکل w/a100-a100 قابلیت تمایز به سلول های شبه هپاتوسیتی نشان می دهند. نتایج ما روش جدیدی را برای تمایز برای تمایز سلول های بنیادی جنینی انسانی به سلول های اندودرم قطعی معرفی می نماید. اندودرم تولید شده به این روش به نحوی وابسته به پروتوکل قابلیت تمایزی به سلول های pp و نیز قابلیت تمایزی به سلول های شبه هپاتوسیتی را دارا می باشند. ضمنا، این نتایج روشن می سازد که پروتوکل های تمایز به سلول های pe نیاز به بازنگری دارند.

پرتوانی به عنوان ظرفیت سلول ها در تمایز به همه ی لایه های جنینی تعریف شده و سلول های بنیادی جنینی، سلول های پرتوانی هستند که از توده سلولِ درونیِ (icm) بلاستوسیست تولید می شوند. سلول های بنیادی جنینی موشی بطور متعارف روی فیبروبلاست های جنین موشی (mef) و در حضور سرمِ گاوی (fbs) کِشت می شدند. مطالعات نشان داده که با مهار دو مسیر پیام رسانیِ mapk و gsk3 ، سلول های بنیادی جنینی از نژادهای مختلف موشی تولید شدندکه این محیط کشت را“2i” نامیدند. با هدف کشف مسیرهای جایگزین و بهینه کردن محیط کشت سلول های بنیادی، تاثیر تعداد زیادی از ریز مولکول ها مطالعه شده است. به تازگی پژوهشگران پژوهشگاه رویان محیط کشت “r2i” را معرفی کرده اند که با بکارگیری دو کوچک مولکول sb431542 و pd0325901 (مهارکننده های مسیر tgfβ و mapk) نه تنها قادر به تولید سلول های بنیادی جنینی با کارایی حدود 100% هستند، بلکه در مقایسه با محیط کشت شناخته شده ی “2i” ، قدرت حفظ پایداری ژنومی بیشتری دارد. در مطالعه پیش رو، بررسی مکانیسم عملکردی تولید و حفظ پرتوانی سلول ها در حضور r2i انجام شده است. بدین منظور در فاز اول، پروفایل بیان ژن در دو رده سلول بنیادی جنینیِ کشت شده در محیط r2i و 2i بررسی شد که ضرورت فعال بودن مسیر پیام رسانی bmp4 در محیط کشت r2i نتیجه گیری شد. ضرورت نقش مسیر آبشاری bmp4 در حفظ وضعیت پایه پرتوانی در محیط کشت r2i با مهار گیرنده bmp4 اثبات شد که باعث تمایز و مرگ سلولی می شود کارایی بالای محیط r2i در تولید رده سلول بنیادی جنینی، این امکان را فراهم می کند که به بررسی مکانیسم این فرایند پرداخته شود. بنابراین در فاز دوم، پروفایل بیان ژنی و متیلاسیون dna در نمونه های جنینِ کشت شده در روند تولید سلول های بنیادی بررسی شد. ما الگوی بیان متفاوتی را در شبکه تنظیمی ژن های مرتبط به پرتوانی، متابولیسم انرژی، و تنظیم کننده های مورفولوژی سلولی از قبیل آبشار اتصالات اپی تلیالی مشاهده کردیم. نتایج متیلاسیون dna ، وضعیت هیپرمتیلاسیون را در سلول های icm به نسبت سلول های es نشان می دهد. در این آزمایش متیلاسیون dna بخصوص در نواحی line1، msat و iap بررسی شده است. این مطاله درک بهتری از مکانیسم مولکولی و مدار تنظیمی تولید سلول های پرتوان جنینی ارائه می دهد. مطالعات مراحل اولیه ی جنینی نشان می دهد که سلول های icm اپی تلیالی شکل بوده و در روند تکوین و تمایز، به سلول های مزانشیمی تبدیل می شوند. بیشتر بافت ها و ارگان ها از تبدیل سلول های اپی تلیالی به مزانشیمی بوجود می آیند. این فرایند تکوینی را emt و تبدیل سلول مزانشیمی به اپی تلیالی را met می نامند. در طرح حاضر، فرضیه ای مطرح شد که انسداد فرایند emt را برای تولید سلول بنیادی جنینی موشی لازم می دانست. به منظور اثبات این فرضیه، بیان ژن های cdh1، snail، و klf4 در روند تولید سلول های es مورد ارزیابی قرار گرفتند. همچنین با القاء emt با tgf-β1 و activin در دو محیط کشت 2i و r2i این فرضیه ارزیابی شد که در نهایت منجر به تایید فرضیه "لزوم انسداد فرایند emt" در روند تولید سلول های بنیادی جنینی موشی شد.استفاده از سلول های بنیادی به دلیل توانایی نامحدود در تمایز به سلول های جدید، از مهمترین چشم اندازهای طب ترمیمی تلقی می شود. بنابراین بالا بردن کارایی تولید و کشف مکانیسم های مولکولی درگیر در سلول های بنیادی جنینی موشی، راه کاری برای افزایش دانش تولید و نگهداری سلول های بنیادی انسانی (hescs) نیز خواهد بود.

سلول های بنیادی جنینی انسانی دارای قدرت تکثیر و تمایز بالایی می باشند که این خصوصیات، آنها را به عنوان یک منبع جدید در تحقیقات بالینی و سلول درمانی مطرح نموده است. تمایز سلول های بنیادی به انواع سلول های عصبی و مطالعه پروتئین های مهم در این پروسه می تواند به عنوان یک راهکار در جهت شناسایی نشانگرهای مطمئن برای این نوع از سلول ها مورد نظر قرار گیرد و همچنین به شناخت مسیرهای تمایز سلول های عصبی و مکانیسم آن کمک کند. در مطالعه حاضر در اولین قدم پروفایل پروتئینی سلول ها در حین تمایز عصبی به صورت کلی با تکنیک 2d-dige بررسی شد و علاوه بر معرفی پروسه های مهم در تمایز عصبی، پروتئین های مهم در پردازش mrna به طور خاص مطالعه شدند. در قدم دوم برای دستیابی به یک جمعیت خالص از پیش سازهای دوپامینرژیک سلول های بنیادی جنینی انسانی برای مکان ژنی lmx1a به صورت درج ژن گزارشگر در این ژن دستکاری ژنتیکی شده و سپس در مسیر تمایز به نورون های دوپامینرژیک، سلول های مثبت خالص سازی شده و تحت القای فاکتورهای رشد و تمایزی به سلول های عصبی بالغ تمایز یافتند. بیان پروتئین های سطحی به منظور یافتن نشانگر خاص این سلول ها با تکنیک shotgun proteomics بررسی شد و پروتئین های پاسخ دهنده به عنوان پروتئین های کاندید معرفی شدند. در قدم سوم جهت افزایش کارایی تمایز به نورون های دوپامینرژیک، اثر پروتئین نوترکیب فاکتور نسخه برداری lmx1a بر روی تمایز سلول های بنیادی جنینی انسان به سلول های دوپامینرژیک به صورت انتقال مستقیم پروتئین به داخل سلول بررسی شد و نتایج نشان داد که انتقال پروتئین lmx1a به همراه فاکتور shh تمایز به سلول‏های دوپامینرژیک را افزایش می دهد. این مطالعه چشم انداز دستیابی به یک منبع سلولی مناسب از پیش سازها و نورون های دوپامینرژیک جهت سلول درمانی در بیماری پارکینسون را ممکن ساخته است.

استفاده از سلول های بنیادی پرتوان به دلیل توانایی نامحدود در تامین بافت های سلولی جدید، از مهمترین چشم اندازهای طب ترمیمی تلقی می شود؛ از این رو آسان سازی و بالا بردن کارایی تولید سلول های بنیادی جنینی، به عنوان بهترین مدل از سلول های بنیادی پرتوان، از اهمیت ویژه ای برخوردار است. همچنین بهبود روش های تولید رده های پرتوان موجب استفاده حداقلی از جنین های اولیه به عنوان منبع مورد استفاده می گردد و علاوه بر آن اطلاعات ما را در رابطه با فرایندهای حاکم بر پرتوانی بالا می برد. یکی از راه های بالا بردن کارایی تولید سلول های بنیادی پرتوان استفاده از مهارکننده های مسیرهای تمایزی می باشد. تاکنون استفاده از مهارکننده های مسیر mapk و gsk3 (که تحت عنوان 2 inhibitors یا 2i نامیده می شود)، در بالا بردن کارایی تولید رده های پرتوان در مقالات مختلف گزارش شده است. در این طرح ما بر آن بودیم تا با جستجوی بیشتر در بین دیگر مهارکننده های مسیرهای تمایزی به مسیری دست پیدا کنیم که مشکل تولید رده از نژادهای مختلف موشی را از بین ببرد و علاوه بر این گامی بیشتر در جهت شناسایی مسیرهای پرتوانی بردارد. در این مطالعه ما نشان دادیم که با استفاده از کوچک مولکول های pd0325901 و sb431542 که به ترتیب مهار کننده مسیرهای تمایزی mapk و tgf-? می باشند، می توان از جنین های مرحله بلاستوسیست نژادهای مختلف موشی (nmri، balb/c، c57bl/6، dba/2 و fvb/n)، که همگی مقاوم به تولید رده هستند با کارایی 100% سلول های بنیادی پرتوان تولید کرد. این ترکیب که تحت عنوان royan 2 inhibitors یا r2i نامیده شد، می تواند تحت شرایط کشت کاملا تعریف شده (محیط عاری از سرم و لایه تغذیه کننده) نیز منجر به تولید موفق رده های پرتوان از جنین های مرحله بلاستوسیست موش، تک بلاستومرهای جنین های موشی در حال تسهیم و جنین های مرحله بلاستوسیست رت شود. رده های تولید شده تمامی ویژگی های پرتوانی را از خود نشان می دهند و قادر به حفظ وضعیت پایه پرتوانی می باشند. این روش نه تنها یک فرایند موثر برای تولید و نگهداری رده های پرتوان موشی معرفی می کند، دیدگاه جدیدی را نیز در بررسی مکانیسم های حاکم بر پرتوانی باز می کند.

مقدمه: تمایز جهت دار سلول های بنیادی جنینی به سلول های مختلف بدن هنوز به عنوان یک چالش مورد مطالعه در زیست شناسی تکوینی مطرح می باشد. کوچک مولکول ها می توانند به عنوان یک ایده ی جدید برای غلبه بر این چالش باشند. روش ها: ما در این مطالعه با توجه به مسیرهای پیام زسانی موثر در تمایز عصبی از کوچک مولکول های dorsomorphin، a8301، xax939و purmorphamineاستفاده کردیم. سلول های حاصل از هر مرحله ی تمایز را از نظر کیفی، کمی و عملکردی با انجام آزمایشات رنگ آمیزی ایمونوفلوئورسنت، فلوسایتومتری، qrt-pcr وclamppatch مورد بررسی قرار دادیم. یافته ها:رنگ آمیزی ایمونوفلوئورسنت و آنالیز فلوسایتومتری در ساختارهای شبه لوله ی عصبی مشتق از سلول های بنیادی جنینی نشان می دهد که این سلول ها با درصد بالاییnestin+، sox1+ و pax6+ بودند. بعد از برش وکشت مجدد ساختارهای شبه لوله ی عصبی، سلول های تمایز یافته حاصل برای پروتئین های شاخص عصبی و نورون حرکتی شامل tuj1، map2و hb9/isl1 مثبت بودند. تغییرات بیان ژن های اختصاصی در مرحله ی آخر تمایز با کمک تکنیک qrt-pcr مشاهده شد. همچنین با کمک تکنیک کلمپ ولتاژی در نورون های حرکتی حاصل از تمایز جریان های یونی وابسته به ولتاژ، خروج k+ و ورود na+/ca2+ ثبت شد. نتیجه گیری:نتایج بدست آمده نشان می دهد که نورون های مشتق از سلول های بنیادی جینی پروتئین های شاخص نورون های حرکتی بالغ را بیان می کنند و مورفولوژی نورون های بالغ را دارا هستند اما ویژگی های الکتروفیزولوژیکی آن ها نشان می دهد که از لحاظ عملکرد فیزیولوژیک هنوز در مرحله ی پیش از بلوغ قرار دارند و جریانات ورودی na+/ca2+برای شلیک پتانسیل عمل هنوز کافی نیستند. به نظر می رسد که این سلول هاباید مدت زمان بیشتری در شرایط آزمایشگاه تکوین پیدا کنند.

تکوین پیش از لانه گزینی در پستانداران با فیوژن هسته اسپرم و تخمک آغاز می گردد و در ادامه منجر به پدید آمدن ساختار پیچیده ای همچون بلاستوسیست می شود. در روند تکوین اولیه جنین دو رخداد تمایزی مهم حادث می شود که در اولین رخداد تمایزی جنین اولیه به تروفواکتودرم و توده سلولی داخلی تفکیک می شود. دومین مرحله تمایز که در حدود مرحله بلاستوسییستی رخ می دهد توده سلولی داخلی به اپی بلاست و اندودرم اولیه تمایز می یابد. دوفاز تمایزی از اینرو دارای اهمیت است که دو تیپ سلول های بنیادی پایدار و پرتوان بکر موشی و اولیه انسانی به ترتیب از توده سلولی داخلی و اپی بلاست بدست آمده. در تمایز یا تفکیک لایه های جنینی مسیر های تمایزی و نیز فاکتور های رونویسی مهمی نقش بازی می کنند که بیان یا عدم بیان هر یک در سرنوشت لایه ها دارای نقش تنظیمی کلیدی بازی می کند و در تعیین پرتوانی یا تمایز دخیل است. تاکنون به دلیل عدم شناخت دقیق از مارکر های پرتوانی قابل اعتماد و نیز الگو ی بیان آنها در مراحل مختلف تکوین، سلول های بنیادی قابل اعتمادی از گونه هایی همچون بز و گاو و گوسفند بدست نیامده است. بیان مارکر های پرتوانی و اختصاصی لایه ها و همچنین ژن های مسیر های پیام رسانی دخیل در مراحل تکوین نشان داد که، بیان ژنهای پرتوانی در مرحله 16-8 سلولی دارای بیشترین بیان بودند و این فرض را تقویت نمود که اولین مرحله اساسی تکوین در این مرحله رخ می دهد. با بررسی بیان ژن هایی oct4, cdx2 و gata4 این احتمال مطرح گردید که بر خلاف گونه موشی و انسانی دومین فاز تکوین در این گونه احتمالا در مرحله بلاستوسیست روز 14 رخ می دهد. در پی آیند برای برآورد تاثیر هر یک از مسیر های تکوینی بر پرتوانی سلول های جنینی هر یک از مسیر های پیام رسانی به واسطه ریزمولکول هایی مهار شدند که نتایج بدست آمده نشان داد که نتایج آزمایشات نشان داد که به کار بردن مهار کننده های pd0325901 برای مسیر mapk/erk و chir99021 برای مهار gsk3 از مسیر wnt سبب تغییر بیان مارکر-های پرتوانی و اختصاصی لایه ها می گردد. از منظر سلول های بنیادی و پرتوانی جنین های بزی بخواهیم بنگریم باید خاطر نشان کرد که مهار مسیر tgf-? هیچ کمکی به افزایش پرتوانی سلول یا تکثر سلول-های پرتوان نکرده و تا حدودی منجر به افزایش بیان مارکر های تمایزی چون cdx2 و gata4 نیز گردیده است. به دیگر سخن چنین می توان گفت که مهار مسیر وابسته به smad2,3 تا حدودی باعث ازدیاد میل به تمایز در سلول های جنینی گردیده است, و احتمالا در گونه بزی smad2,3 در سرکوب تمایز نقش دارند.

بیماری های قلبی- عروقی بیشترین میزان مرگ و میر را در میان بیماری ها داراست که اهمیت محدودیت های درمان کنونی را در روش های رایج درمانی آشکار می سازد. نقش داربست های سه بعدی برای درمان انفارکتوس قلبی توسط داربست هایی طبیعی که تشابه بیشتری به بافت های مورد را دارند به نظر می رسد که جهت استقرار مجدد ماتریس خارج سلولی آسیب دیده قلب مناسب ترند. در این مطالعه، ما ویژگی های in vito و in vivo یک داربست جدید مشتق شده از پریکارد را مورد بررسی قرار دادیم تا محیط خارج سلولی میوکارد را تقلید نماید. پرده پریکارد انسان، سلول زدایی شده و به صورت یک اسفنج سه بعدی پریکارد با معماری مناسب و سایز منفذهای ایده ال و راه به در آماده سازی شد. سلول های پروژنیتور قلبی (cpcs) بر روی داربست کشت داده شدند. نتایج ما نشان داد که سلول ها بر روی داربست پریکاردیوم(ps) پتانسیل بیشتری برای مهاجرت، بقاء، تکثیر و تمایز در مقایسه با پرده پریکارد سلول زدا شده (dpm) و کلاژن دم رت (col) دارند. مطالعات بافت شناسی و ایمونوهیستوشیمی به طور قابل توجهی نشان داد که داربست-های که یک ماه به صورت زیرجلدی پیوند شده بودند، رگ زایی وسیع تر و تمایز کاردیومیوسیت بیشتر را در ps در مقایسه با dpm و col نشان دادند. در این مطالعه ما امکان ساخت داربست های اسفنجی سه بعدی از ماتریس خارج سلولی طبیعی را نشان دادیم که می تواند یک کاندید مناسب جهت درمان بیماری-های ایسکمی قلبی باشد.

مقدمه: از آن¬جایی که ظرفیت سیستم اعصاب مرکزی (cns) برای ترمیم محدود است؛ محققان برآنند تا پتانسیل ترمیم cns را از طریق رویکردهای مختلف افزایش دهند. اخیرا برخی از مطالعات بیانگر این هستند که آستروسیت¬ها می¬توانند به نوروبلاست و نورون در شرایط in vivo بازبرنامه ریزی گردند. در این مطالعه ما نشان می¬دهیم که تزریق mir-302/367 به عنوان microrna اختصاصی سلول¬های بنیادی عصبی با والپروات در استریاتوم و بطن جانبی می¬تواند آستروسیت¬ها را به ترتیب به نوروبلاست و پیش ساز الیگودندروسیتی تبدیل کند. روش¬ها: برای بررسی اثر توام mir-302/367 و vpa بر نوروژنز ، مارکرهای نوروبلاستی و نورونی به وسیله ایمونوهیستوفلورسنت در استریاتوم و هیپوکامپ سنجیده شد. جهت مطالعات ترمیم میلین، پس از تزریق داخل بطنی ذرات لنتی ویروسی، بیان ژن¬های شاخص پرتوانی و سلول¬های بنیادی عصبی بوسیله real time pcr ارزیابی شد. تست ماز y به منظور تعیین اثرات mir بر روند بهبود حافظه پس از القای نقص حافظه با کوپریزون استفاده شد. ترمیم میلین به وسیله رنگ آمیزی لوکسال فست بلو و ایمونوهیستوفلورسنت ارزیابی شد. در تمام مطالعات، والپروات، 4 روز قبل از تزریق ذرات لنتی ویروسی اعمال و در سراسر دوره آزمایش به طور مستمرر تزریق گشت. نتایج: تزریق توام mir-302/367 و vpa توانست آستروسیت¬های استریاتوم را به پیش سازهای نورونی بازبرنامه ریزی کند. آستروسیت¬های انسانی در اثر بیان mir به نورون در شرایط in vitro تبدیل شدند. نتایج ما نشان داد که پیش درمان با mir-302/367 توانست ظرفیت ترمیم ناحیه ca3 هیپوکامپ را به دنبال اعمال کاینیک اسید افزایش دهد. تزریق ذرات لنتی ویروس منجر به افزایش بیان ژن¬های شاخص پرتوانی و سلول¬های بنیادی عصبی شد. بهبود حافظه و افزایش ترمیم میلین در حیوانات کوپریزونی، 2 هفته پس از تزریق mir-302/367 مشاهده شد. نتیجه گیری: یافته های ما حاکی از آن است که ظرفیت ترمیم cns با بازبرنامه ریزی آستروسیت¬ها و تمایزشان به نورون و الیگودندروسیت توسط mir302/367 در شرایط in vivo، افزایش می یابد.

سلول های بنیادی جنینی موشی ابزاری ارزشمند برای انجام مطالعات تمایز سلولی در شرایط in vitro هستند. تمایز سلولی فرایندی جدایی ناپذیر از رشد و نمو موجودات پرسلولی است. در این مطالعه نقش مسیر آپوپتوتیک میتوکندریایی و تغییرات سطح انرژی سلول در فرایند تمایز سلول های بنیادی موشی به کاردیومایوسیت و آپوپتوز بررسی شده است.

بطور کلی دو سطح پرتوانی na?ve و primedبرای سلول های بنیادی جنینی وجود دارد. استفاده از سلول های بنیادی جنینی انسانی (hescs) و یا سلول های بنیادی پرتوان القایی انسانی (ipscs)که در حالت پرتوانی primed قرار گرفته اند، به دلیل تمایلات تمایزی خاص و همچنین حساسیت آن ها نسبت به منفرد شدن، با محدودیت هایی روبروست. از این رو در طی سال های اخیر تلاش های زیادی در جهت تولید سلول های بنیادی پرتوان na?ve انسانیانجام شده است؛ سلول های پرتوان na?ve دارای کمترین نشتی تمایزی بوده و قادرند در عین حال، به صورت کارآمد به سلول های هر سه رده ی زاینده ی جنینی تمایز پیدا کنند. این سلول ها همچنین به منفرد شدن حساس نبوده و از این رو انجام دستکاری ژنتیکی روی آن ها ساده تر است. بنابراین تولید چنین سلول های پرتوانی از اهداف بلند محققان مختلف بوده و هست. روش های مختلفی برای نائل شدن به این هدف به کار رفته و سلول هایی که تولید شده اند، با وجود داشتن یکسری از ویژگی های na?ve (نظیر فعال شدن هر دو کروموزوم x در رده های سلولی ماده)، اغلب در محیط کشت ناپایدار بوده و یا حفظ پایداری آن ها به حضور مداوم عوامل بیرونی نظیر ژن های خارجی وابسته است. گیرنده های هسته ای (از جملهlrh-1 و rar? ) از جمله ی فاکتورهای رونویسی توانمندی هستند که در القای حالت na?ve در سلول های پرتوان primed موفقیت های چشمگیری داشته اند. همچنین کوچک مولکول هایی معرفی و شناخته شده اند که در رسیدن به این سطح از پرتوانی موثر بوده اند. با توجه به این که روش های قبلی در القای حالت na?ve نیازمند دستکاری ژنتیکی بودند سلول های حاصل، فاقد پایداری لازم برای رشد طولانی مدت در شرایط آزمایشگاه بودند، و همچنین نظر به توانمندی گیرنده های هسته ای و مزایای متعدد کوچک مولکول ها، در طرح حاضر بنا داریم از طریق فعال کردن گیرنده های هسته ای lrh-1 و rar? با استفاده از آگونیست های آن ها، سلول های بنیادی پرتوان primed انسانی را به حالت پرتوانی na?ve بازبرنامه ریزی کنیم. تولید چنین سلول هایی، اقدام موثری در مسیر استفاده بالقوه از این سلول ها در سلول درمانی، مدل سازی بیماری ها و شناسایی داروها خواهد بود.