ژن کیتیناز chis جداشده از bacillus pumilus sg2 دارای سه ناحیه ژنی شامل دامنه کاتالیتیک گلیکوزیل هیدرولاز18، دامنه فیبرونکتین3 و دامنه اتصال به کیتین، به گیاه آرابیدوپسیس منتقل و قابلیت آن در ایجاد مقاومت در برابر بیماری های قارچی مورد ارزیابی قرارگرفت. دو ساختار ژنی شامل توالی کامل ناحیه کدکننده ژن chisو همچنین توالی دامنه کاتالیتیک گلیکوزیل هیدرولاز18(gh18) که با حذف دو دامنه دیگر از ژن chis ایجاد شده بود، بطور جداگانه به گیاهان منتقل شدند. صحت انتقال و ادغام ژن ها توسط آزمون های pcr و سادرن بلات تأیید و نسخه برداری از ژن های انتقالی نیز با روش rt-pcr اثبات شد. بررسی هایelisa و وسترن بلات نشان دادند اکثر لاین های تراریخت که ژن مربوطه را رونویسی کرده بودند پروتئین آن را نیز تولید کرده اند. بررسی آنزیمی نشان داد که با حذف ناحیه اتصال به کیتین، فعالیت کیتینازی پروتئینgh18 در مقایسه باchis تغییری نکرده است. همچنین بررسی های ضد قارچی در شرایط آزمایشگاهی نشان داد با حذف ناحیه اتصال به کیتین فعالیت ضدقارچیgh18 در مقایسه با chis شدیداَ کاهش یافته است. عصاره پروتئینی گیاهان دارای ژنchis توانست رشد قارچ های بیماریزای گیاهی, rhizoctonia solani, sclerotinia sclerotiorum, botrytis cinerea, bipolaris sp., alternaria raphani, alternaria brassicicola, trichoderma reesei, و fusarium graminearum را کنترل کند، در حالی که عصاره پروتئینی گیاهان واجد gh18 تنها رشد هیف های a. brassicicola را به صورت محدود کنترل کرد. همبستگی مثبتی بین میزان بیان پروتئین نوترکیب لاین های تراریخت و اثر بازدارندگی آنها روی رشد قارچ ها مشاهده شد. ارزیابی مقاومت گیاهان کامل نیز نشان داد گیاهان لاین تراریخت achis11 که بیشترین بیان chis را دارا بودند در مقایسه با گیاهان شاهد غیر تراریخت، مقاومت بالاتری در برابر r. solani و a. brassicicola نشان داده و توانستند خسارت بیماری را کاهش دهند. بررسی های مرفولوژیک لاین های تراریخت شده با chis نشان داد در مقایسه با گیاهان شاهد و گیاهان واجد gh18، سرعت رشد، ارتفاع گیاه و طول ریشه در آنها افزایش یافته و سریع تر وارد فاز زایشی شده اند. این تحقیق اولین گزارش از انتقال یک ژن کیتیناز از bacillus pumilus به گیاه می باشد.

در سال های اخیر، تغییر سطح سلول های زنده کاربردهای فراوانی در زمینه های بیوتکنولوژی، ایمونولوژی و میکروبیولوژی داشته است. در این بین تغییر سطح سلول های باکتریایی به عنوان مهمترین میکرو ارگانیسم های مورد استفاده در صنایع بیوتکنولوژی، مورد علاقه محققین بسیاری بوده است. بیان و اتصال پروتئین های هترولوگ به سطح سلول، یکی از راه های تغییر سطح سلول های باکتریایی می باشد. در باکتری های گرم مثبت، یک یا دو آنزیم با عنوان سورتاز وجود دارد که اتصال سوبسترای پروتئینی به دیواره سلول را با ایجاد یک پیوند کووالان کاتالیز می کند. این آنزیم با تشخیص توالی آمینو اسیدی با عنوان موتیف شناسایی آنزیم سورتاز که در انتهای کربوکسیل پروتئین سوبسترا قرار دارد، در یک واکنش ترانس پپتیدازی آن را شکسته و پروتئین سوبسترا را به لایه پپتیدوگلیکانی دیواره سلولی متصل می کند. در باکتری باسیلوس سوبتیلیس، دو سورتاز مختلف با عنوان yhcs و ywpe گزارش شده است، اما هنوز هیچ سوبسترای پروتئینی که توسط این آنزیم یه دیواره سلولی باکتری متصل شوند، شناسایی نشده است. با این وجود ارتباط yhcs با دو پروتئین با عنوان yhcr و yfkn که در انتهای کربوکسیل خود توالی مشابه موتیف شناسایی آنزیم سورتاز دارند، تایید شده است. در این تحقیق به منظور شناسایی سیستم آنزیمی سورتاز در باکتری باسیلوس سوبتیلیس، سعی شد با استفاده از آنزیم سورتازyhcs ، پروتئین کیتیناز که در انتهای کربوکسیل آن موتیف شناسایی آنزیم سورتاز در پروتئین yhcr اضافه شده بود، به سطح باکتری باسیلوس سوبتیلیس متصل شود تا بتوان در کنترل بیولوژیک عوامل بیماری زای گیاهی در سطح مزارع از آن استفاده کرد. برای رسیدن به این هدف، ابتدا سعی شد ژن کد کننده آنزیم yhcs به همراه ژن کد کننده آنزیم chitinase که در انتهای کربوکسیل آن موتیف شناسایی آنزیم سورتاز از پروتئین yhcr اضافه شده بود، درون وکتور بیانی جاسازی شده و تغییرات سطح سلول باکتری، پس از ورود وکتور به آن با تکنیک های sds-page، western blotting و flow cytometery بررسی شود. نتایج این بخش از آزمایشات حاکی از آن بود که پروتئین کیتیناز به طور موفقیت آمیزی به سطح باکتری متصل شده و فعالیت کیتینازی از خود نشان می دهد. در ادامه ی آزمایشات، یک سوبسترای پروتئینی طراحی شد که در قسمت میانی آن توالی شناسایی آنزیم سورتاز در پروتئین yhcr جا سازی شده بود. این سوبسترای پروتئینی به همراه آنزیم سورتاز yhcs توسط روش کروماتوگرافی ستون نیکل خالص سازی شدند و بر هم کنش آنها در محیط in vitro مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بخش از آزمایشات نشان دهنده ی آن بود که آنزیم yhcs به تنهایی قادر به انجام عمل ترانس پپتیدازی در محیط بیرون از سلول زنده نیست و برای فعالیت خود احتیاج به عوامل دیگری نیز دارد. به طور کلی نتایج این تحقیق روشن شدن بخشی از سیستم آنزیمی سورتاز در باکتری باسیلوس سوبتیلیس بود که در آن آنزیم سورتاز yhcs و موتیف شناسایی آنزیم سورتاز در پروتئین yhcr نقش کلیدی را ایفا می کنند.

چکیده : بیماریهای قارچی سالانه خسارات فراوانی به محصولات کشاورزی وارد می کنند. با توجه به اهمیت بیماری های ایجاد شده توسط قارچهای گیاهی مختلف و بالا بودن خسارات آنها بر روی برنج، گندم و کلزا ودیگر محصولات کشاورزی ، بررسی راه های مقابله با این قارچ ها و اتخاذ استراتژی های مناسب در مدیریت و کنترل این بیماری ها ضروری است. یکی از استراتژی هایی که امروزه مورد توجه می باشد، استفاده از میکروارگانیسم هایی است که توانایی هیدرولیز کردن دیواره ی این قارچ ها را دارند. در بیشتر مواقع میکروارگانیسم های جدا شده از خاک نا شناخته بوده و احتمال می رود استفاده از آنها در طبیعت موجب بروز اختلال در چرخه ی طبیعت شود.بنابراین در این تحقیق ژن کتیناز s باسیلوس پومیلوس کلون و به باکتری باسیلوس سوبتیلیس wasd ،یک باکتری جدا شده از خاک که اطلاعات بسیاری در مورد آن بدست آمده و در لیست باکتری های بی خطر fdaو دیگر سازمان های جهانی مانند فائو قرار دارد، ترانسفورم شد. bacillus pumilus دارای دو ژن کیتیناز به نام هایchis و chil است ،که در این پروژه فقط ژن chis مورد بررسی قرار گرفت. در روند کلونیک از e.coli(top10) بعنوان گیرنده استفاده شد سپس پلاسمید ساخته شده، با متود ترانسفورم طبیعی((natural transformation به باسیلوس سوبتیلیس wasd ترانسفورم گردید و بیان ژن کیتیناز و فعالیت آن از طریق ایجاد هاله ی شفاف دور باکتری بر روی محیط پایه ی m9 مدیفای شده به همراه کیتین کلوئیدی مشاهده شد. آزمایشات بیشتر شامل sds-page و آنالیز وسترن بلاتینگ بیان پروتئین کیتیناز را اثبات نمود. میزان فعالیت آنزیم با روش میلر اندازه گیری شد ، برای بررسی اثرات ضد قارچی آنزیم کیتیناز تولید شده توسط باسیلوس سوبتیلیس بر روی یک سری از قارچهای بیماریزای گیاهی ، پس از کشت باکتری حاوی سازه ژنی نوترکیب و تولید آنزیم ، آنزیم بوسیله ی آمونیم سولفات رسوب داده شد و سپس در بافر مناسب حل شد، نتایج حاکی از توقف رشد قارچهای بیماریزای گیاهی در مجاورت با این آنزیم بودند . در مرحله بعدی آنزیم کتیناز (chis )، با استفاده از ستون نیکل ni-nta برای محاسبه پارامترهای کینتیکی همچون ، km ،vmax وkcat ، خالص گردید. واژه های کلیدی:کیتیناز،باسیلوس پومیلوس،باسیلوس سوبتیلیس wasd ،بیماریهای قارچی.

در این پژوهش اثر ضد قارچی باکتری باسیلوس پومیلوس sg2 روی برخی از قارچ های بیماریزای گیاهی مورد بررسی قرار گرفت. به علت همزیستی این باکتری با ریزوکتونیا سولانی و هم چنین ناشناخته بودن این باکتری، ژن کیتیناز chis آن به همراه پروموترش توسط pcr از ژنوم باسیلوس پومیلوس sg2 تکثیر و قطعه تکثیر شده در شاتل وکتور pdhafb کلون گردید. پس از تأیید صحت ساختار، وکتور نوترکیب بوسیله ی آنزیم scai از حالت حلقوی خارج و به صورت خطی در آورده شد. پلاسمید خطی شده به باکتری باسیلوس سوبتیلیس trpc2 منتقل و قطعه ژنی طی فرآیند نوترکیبی همولوگی به جای ژن آمیلاز قرار گرفت. بیان پروتئینchis با روش sds-page و آنالیز وسترن بلات تأیید و میزان فعالیت آنزیم با روش میلر اندازه گیری شد. در نهایت آنزیم تولید شده از باکتری نوترکیب با آمونیم سولفات رسوب داده شد و پس از حل شدن در بافر مناسب برای تخمین فعالیت آنزیم و بررسی اثر ضد قارچی پروتئین نوترکیب بر روی برخی قارچ های بیماریزای گیاهی مورد بررسی قرار گرفت. اثر ضد قارچی باسیلوس سوبتیلیس نوترکیب روی ایزوله های قارچی نیز آزمون شد. نتایج نشان داد آنزیم بیان شده در باسیلوس سوبتیلیس توانست جلوی رشد ریزوکتونیا سولانی، اسکلروتینیا اسکلروتیوروم، فوزاریوم گرامیناروم را بگیرد و این نشان می دهد علاوه بر بیان پروتئین در سیستم باسیلوس سوبتیلیس، پروتئین دارای فعالیت کیتینازی بر روی دیواره ی این قارچ ها می باشد. از طرف دیگر بررسی اثر ضد قارچی باکتری باسیلوس سوبتیلیس upchi در برابر این سه قارچ نشان داد که این باکتری تنوانست از رشد این قارچ ها جلوگیری کند.

فعالیت ضد قارچی کیتیناز های ترشح شده از bacillus pumilus sg2 پس از کلون کردن در e. coli، خالص سازی با ستون نیکل و سنجش فعالیت کیتینازی، روی قارچ ها و باکتری های مهم بیماریزای گیاهی مورد ارزیابی قرار گرفت و اثرات بازدارندگی این کیتینازها اثبات شد.

تحقیق حاضر، بیان سطحی1 آنزیم کیتیناز باکتری bacillus pumilus2 بر روی اسپور باکتری bacillus subtilis3را مورد مطالعه قرار داده است. همچنین تاثیر احتمالی این سیستم بیانی بر روی فعالیت آنزیمی در شرایط بهینه مدنظر بوده است. نتایج این پژوهش به دلیل جدید بودن این نوع از سیستم بیان سطحی و نیز بیان یک پروتئین دارای فعالیت (یک آنزیم) حائز اهمیت است. تا کنون موردی مبنی بر استفاده از cotb و cotc(از پروتئین های لایه خارجی اسپور به عنوان حامل)، در بیان سطحی یک پروتئین هترولوگ با نقش آنزیمی گزارش نشده است. ژن کیتیناز کلون شده در یک پلازمید با واکنش زنجیره پلیمرازی (pcr) تکثیر شد و در شاتل وکتور های pkh36، pkh40 و pkh41 کلون گردید. پس از تایید کلونینگ ، وکتورهای نوترکیب، توسط هضم آنزیمی به صورت خطی درآمده و پلازمید خطی شده به باکتری bacillus subtilis منتقل شدند. قطعه ژنی هدف طی فرایند نوترکیبی همولوگ4 در محل ژن آمیلاز، که یک ژن غیر ضروری برای باکتری است، وارد شد. پس از تولید و تخلیص اسپور، بیان پروتئین بر روی سطح اسپور توسط آنتی بادی بر ضد کیتیناز و از طریق آنالیز وسترن بلات تایید شد. به منظور بررسی فعالیت آنزیم بیان شده بر روی سطح اسپور، سنجش آنزیمی به روش میلر انجام گرفت. نتایج حاکی از بیان موفقیت آمیز آنزیم کیتیناز بر روی سطح اسپور بود. به علاوه نتایج حاصل از سنجش آنزیمی نشان دهنده تفاوت محسوس بین شرایط بهینه فعالیت آنزیم آزاد و آنزیم تثبیت شده بر روی اسپور بودند. فعالیت بهینه این آنزیم ها به ترتیب در دمای 45°c و ph6، 35°cوph6 و 45°c وph11 برای کیتیناز متصل به cotb ، cotc و cotg بدست آمد.

مزایای چشمگیر آنزیم های تثبیت شده از قبیل پایداری بیشتر آنزیم ،امکان استفاده چند باره از یک منبع آنزیمی و جداسازی آسان آن از مخلوط واکنش، سبب جلب توجه محققان در جهت گسترش روشهای تثبیت و استفاده از آنزیم های تثبیت شده گشته است. آنزیم آلفا آمیلاز یکی از پر کاربردترین آنزیم های صنعتی است که در صنایع مختلف، از جمله صنایع غذایی، نساجی،کاغذ سازی و تخمیری کاربرد دارد و تا کنون بر روی سطوح مختلف و با روش های متفاوت تثبیت شده است که هر یک از آنها مزایا و معایبی را به همراه داشته است. در پژوهش حاضر، آنزیم آلفا آمیلاز برای اولین بار به صورت غیر ژنتیکی و به دو روش برگشت پذیر و برگشت ناپذیر بر روی سطح اسپور باسیلوس سوبتیلیس تثبیت شده است. در روش برگشت پذیر آنزیم آلفا-آمیلاز از طریق میانکنش های الکترواستاتیک و هیدروفوبیک به صورت جذب سطحی بر روی سطح اسپور تثبیت شد و در روش برگشت ناپذیر، آنزیم با استفاده از n هیدروکسی سوکسین آمید و اتیل دی متیل آمینو پروپیل به صورت کوالان به سطح اسپور تثبیت شد. سپس ویژگی های کاتالیتیک آنزیم آزاد با آنزیم های تثبیت شده مورد بررسی و مقایسه قرار گرفت. میزان آنزیم تثبیت شده به روش جذب سطحی 22/21 درصد و برای آنزیم تثبیت شده به روش کوالان 5/94 درصد مشاهده شد. ph بهینه فعالیت آنزیم آزاد برابر با 6 و ph بهینه فعالیت آنزیم تثبیت شده برابر با 8 بود. فعالیت آنزیم آزاد u/l 5/6073 و فعالیت آنزیم تثبیت شده به روش جذب سطحی و کوالان به ترتیب u/l 1728 و u/l 2134 به دست آمد. دمای بهینه فعالیت آنها بدون تغییر و در هر دو حالت 60 درجه سانتی گراد است اما آنزیم تثبیت شده به روش کوالان فعالیت بهتری نشان می دهد. آنزیم تثبیت شده به روش کوالان پس از 10 سیکل استفاده 68% فعالیت خود را حفظ می کند. واژه های کلیدی: آنزیم آلفا-آمیلاز، تثبیت اسپور، جذب سطحی، پیوند کوالان، nhs و edc

در این تحقیق شناسائی اپیتوپ های غالب تحریک کننده سیستم ایمنی اختصاصی سلول های t و بواسطه آن طراحی کاست ژنی وابسته به پنج پروتئین اکینوکوکوس گرانولوزوس شامل eggst, ega31, eg95, egtrp, p14-3-3 و بررسی پاسخ ایمنی آن انجام گرفت. اپیتوپ ها با نرم افزار های propred و iedbبا بهترین قدرت اتصال به مولکول های mhc پیش بینی شدند. پس از سنتز dna، قطعه مورد نظر داخل وکتور بیانی pet41a+ کلون شد به منظور فهم بهتر اثر تجمعی اپیتوپها قطعه دربرگیرنده اپیتوپ های آنتی ژن ega31 با pcr تکثیر وجداگانه در دو وکتورpgex4t1 وpegfp-n1 کلون شد. پروتئینهای کایمریک در سلولe. coli فیوژن با gst بیان شدند. بیان gfp-chega31 در سلول های cho با فلورسنت میکروسکوپی و rt-pcr تائید شد. بیان پروتئینهای کایمریک با وسترن بلاتینگ تائید شد، سپس با روش افینیتی خالص سازی و به موش های c57bl/6 همراه با اجوانت فروند تزریق شدند. سلول های splenocyte طحال به مدت 72 ساعت در محیط dmem در حضور آنتی ژن، کشت داده شدند. نتایج الایزا نشان داد کهifn-? در سلول های طحال موشهای ایمن شده با آنتی ژن gst-chegmea حدودا 1300 پیکوگرم و در گروه gst-chega31 حدودا 634-1300 پیکوگرم و در گروه gfp-chega31 نیز 1300پیکوگرم در میلی لیتر بیان شد، که نشان داد پروتئین کایمریک چند اپیتوپی بخوبی سیستم ایمنی سلولی را تحریک کرده است. از طرفی افزایشی در میزان il4, il10مشاهده نشد. موشهای ایمن شده، با تعداد پانصد پروتواسکولکس زنده چالنج شدند که بعد از سه ماه کیست ها شمارش شدند. مشاهدات نشان داد که آنتی ژن gst-chega31 50% و در گروه تزریق شده با pegfp-chega31 حدودا 60 % مصونیت ایجاد نمودند، در حالیکه آنتی ژن کایمریک gst-chmeaمصونیت 6/99-100% علیه پروتواسکولکس ایجاد نمود. نتایج گواه این مطلب است که پیش بینی اپیتوپ ها بر اساس متد بیوانفورماتیک جهت طراحی آنتی ژن بر علیه اکینوکوکوس گرانولوزوس مفید بوده است

از آنجایی که آنتی بادی ها، عوامل درمانی موثری برای بیماری های عفونی، التهابی و سرطان ها هستند؛ خالص سازی آن ها مورد توجه بسیاری از بیوشیمیست ها و شیمیست ها قرار گرفته است، که این کار معمولاً با استفاده از ستون های کروماتوگرافی پرهزینه انجام می گیرد. در برخی از روش های خالص سازی پروتئین ها، برهم کنش های پروتئین-پروتئین دارای نقش اساسی هستند. هدف از این پروژه اصلاح سطح بیدهای کیتوسان جهت خالص سازی ایمونوگلوبین های g از مخلوط پروتئین های سرم خونی می باشد. در این پروژه،اصلاح کیتوسان با افزایش گروه آلدهیدی به سطح آن انجام گرفت، در ادامه کیتوسان اصلاح شده برای تثبیت کووالانسی پروتئین a بر روی سطح بیدهای کیتوسان استفاده گردید. نتایج حاصل نمایان گر تأثیر نوع و ph بافر در میزان تثبیت پروتئینa بر روی سطح کیتوسان می باشد. برای بررسی نحوه برهم کنش سطح بیدهای کیتوسان با پروتئین a و افزایش میزان پروتئین تثبیت شده، خانواده جدیدی از بیدهای کیتوسانی تهیه گردید. نتایج حاصل نشانگر افزایش بهره وری خالص سازی گزینشی igg از سرم خونی توسط بیدهای اصلاح شده ی کیتوسان بود.

ترکیبات ارگانوفسفره به وفور در آفت کش ها و عوامل عصبی شیمیایی مورد استفاده قرار گرفته و خطرات زیادی را برای انسان و محیط زیست ایجاد نموده اند. گزارشات زیادی از سم زدایی این ترکیبات با روش های مختلف وجود دارد که از میان این روش ها، هیدرولیز آنزیمی این ترکیبات با آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز، بیشتر مورد توجه محققین واقع شده است. آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز یک پروتئین همو دایمر است که اولین بار از باکتری سودوموناس دیمینوتا و فلاوباکتریوم جدا شده که قادر به تجزیه گستره وسیعی از ترکیبات ارگانوفسفره سمی می باشد. استفاده از فرم تثبیت شده این آنزیم در مقابل فرم آزاد آن باعث افزایش پایداری آنزیم شده و هزینه ها را به واسطه امکان بازیافت و استفاده مجدد از آن کاهش می دهد. همچنین، با تثبیت آنزیم امکان جداسازی آسان و سریع آن از محیط واکنش نیز فراهم می گردد. در این مطالعه ژن کد کننده آنزیم نوترکیب ارگانوفسفر هیدرولاز در ناقل بیانی pet-26b (+) کلون شد و در میزبان e. coli bl21 (de3) plyss بیان و به محیط کشت باکتری ترشح گردید. سپس آنزیم بعد از خالص سازی، بر روی سطح اسپورهای باکتری باسیلوس سوبتیلیس به عنوان یک حامل جدید، به روش جذب سطحی و پیوند کووالان، برای اولین بار تثبیت گردید. تثبیت آنزیم بر روی سطح اسپور با روش های مختلفی مانند سنجش فعالیت آنزیمی اسپورها، وسترن بلات، فلوسایتومتری و میکروسکوپ فلورسنت تأیید گردید. نتایج این مطالعه نشان داد که در فرم تثبیت شده آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز به روش جذب سطحی، تقریباً حدود 42 تا 45 درصد از فعالیت آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز در ارتباط با اسپور ها حفظ شد و در ph و دمای بهینه فعالیت آنزیم با جذب بر روی اسپور، تغییری حاصل نشد، اما پایداری آنزیم متصل به اسپور در دما و ph های بالا بیشتر از فرم آزاد آنزیم بود. در تثبیت آنزیم به صورت کووالان، درصد تثبیت آنزیم بر روی سطح اسپورها، حدود 55 تا 60 درصد بود. تثبیت کووالان آنزیم بر روی سطح اسپور با روش های طیف سنجی ft-ir و میکروسکوپ الکترونی نگاره، بررسی و تأیید گردید. آنزیم تثبیت شده به صورت کووالان، بعد از 6 بار استفاده در واکنش های آنزیمی متعدد توانست، سوبسترای ارگانوفسفره پارااُکسون را بدون کاهش قابل توجه در فعالیت، تجزیه نماید. پایداری آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز تثبیت شده بر روی اسپور به صورت کووالان، در دما و ph های مختلف نسبت به فرم آزاد آنزیم بهبود یافت. با توجه به امنیت اسپور باکتری باسیلوس سوبتیلیس برای انسان و محیط زیست و همچنین هزینه پایین تولید و تخلیص اسپور، آنزیم تثبیت شده بر روی سطح اسپور، پتانسیل استفاده به عنوان یک بیوکاتالیست، برای تجزیه آلودگی های ارگانوفسفره در محیط و بیوراکتور ها را با کارایی بالا دارا می باشد.

آنزیم های محدودکننده توالی خاصی از dna را شناسایی می کنند و اسکلت قند-فسفات dna را در آن یا نزدیکی آن برش می زنند. این آنزیم ها اکثرا منشا باکتریایی دارند و در سامانه ی اصلاح و برش باکتری ایفای نقش می کنند. آنزیم های محدودکننده در همسانه سازی ژن-ها و مهندسی ژنتیک نقش اصلی را ایفا می کنند و بسیاری تکنیک-های مولکولی دیگر نیز بر پایه ی توانایی آن ها در برش دادن توالی های اختصاصی از dna تعریف شده است. در این مطالعه آنزیم محدودکننده ی xcm(i) از باکتری xanthomonas campestris در باکتری e. coli همسانه سازی و بیان شد. آنزیم xcmi جایگاه اختصاصی ggtnnnnnnnnnacc راشناسایی کرده و برش می زند و انتهای چسبنده ی t تولید می کند، توانایی آنزیم محدودکننده ی xcmi در تولید انتهای چسبنده یt بعد از برش dna، موجب ظهور تکنولوژی ta-کلونینگ شده است. برای تولید آنزیم محدودکننده ی xcmi ژن کدکننده ی آنزیم محدودکننده ی xcmi سنتز شد و در وکتور pet26b(+) قرار گرفت، حاملpet26b در باکتری میزبان e. coli بیان و آنزیم xcmi در e. coli تولید شد. بیان در سیستم بیانی pet26b تماما به صورت جسم توده ای بود، برای حصول پروتئین محلول با فولدینگ صحیح سیگنال ترشحی پروتئینa با تکنیک overlapping pcr به ژن کدکننده ی آنزیم اتصال یافت که در این قسمت پروتئین بیان نشد در مرحله ی بعد ژن آنزیم محدودکننده ی xcmi با همسانه سازی شدن در حامل pgex-4t-2 به پروتئین فوق العاده محلول gstمتصل شد و بخشی از پروتئین به صورت محلول بیان شد. آنزیم محلول متصل به gst به کمک bead های گلوتاتیون خالص سازی شد. در ادامه آنزیم به کمک پروتئاز از پروتئین gst جدا شد و فعالیت آن بررسی شد که فاقد فعالیت بود. در ادامه ی کار برای حصول پروتئین محلول از آنزیم همسانه سازی شده در pet26b به باکتری میزبان حامل pet26b شوک حرارتی داده شد. با بهره گیری از این روش مقداری از پروتئین به صورت محلول بیان شد و با bead های نیکل خالص سازی شد و پس از تعیین غلظت با نانودراپ فعالیت آن مورد بررسی قرار گرفت که تنها فعالیتی جزئی از آنزیم مشاهده شد. آنزیم xcmi توانایی دایمریزه شدن نداشت و به صورت مونومر عمل کرد و تنها در پلاسمید سوبسترا ایجاد nick کرد.