در این مطالعه ژن کد کننده sox2 در وکتور بیانی paav-mcs کلون شده سپس این سازه به سلول های hek293a ترانسفکت می شود سپس ویروس های تولید شده جمع آوری شده و به سلول های rpe اینفکت خواهد شد و توانایی تولید سلول های پیش ساز عصبی از سلول های اپیتلیالی رنگدانه دار بررسی خواهد شد.

هدف: ارزیابی اثر القایی مایع آمنیوتیک انسانی بر رشد و دگرتمایز سلولهای پوششی رنگدانه دار شبکیه به سلولهای گانگلیونی شبکیه و گیرنده های نوری استوانه ای شکل روشها: سلولهای پوششی رنگدانه دار شبکیه از کره چشم اجساد انسانی جنینی و نوزاد زیر یک سال جدا شده و در محیط کشت غنی شده با ده درصد سرم جنینی گوساله کشت داده شدند. پس از پر شدن ظرف کشت، سلولهای کشت داده شده تریپسینه شده مرتبا پاساژ داده شدند و در دو نوع محیط کشت سرم دار و مایع آمنیوتیک دار مورد آزمایش قرار گرفتند.جهت بررسی تاثیر مایع آمنیوتیک بر رشد سلولهای پوششی رنگدانه دار شبکیه تکثیر و مرگ این سلولها به کمک دو کیت الایزای تشخیص تکثیر سلولی و تشخیص آپوپتوز یا مرگ سلولی مطالعه شد.همچنین دگرتمایز سلولهای پوششی رنگدانه دار شبکیه به سلولهای گانگلیونی شبکیه و گیرنده نوری استوانه ای با استفاده از دو تکنیک ایمونوسیتوشیمی و real time pcr بررسی گردید. نتایج: کشت پرایمری سلولهای پوششی رنگدانه دار شبکیه با خلوص بالا تحت محیط های سرم دار و مایع آمنیوتیک دار انجام گردید و منجر به رشد و تکثیر سریع سلولها شد. پس از انتقال سلولهابه محیط در شیشه سلولها شروع به از دست دادن رنگدانه هایشان کردند و پس از چندین پاساژ سلولی کلنی سلولهای بنیادی/ پروژنیتوری و همچنین سلولهای شبه عصبی از نظر مورفولوژی شناسایی شدند. آنالیزایمونوسیتوشیمی بر روی سلولهای کشت داده شده در محیط 30% مایع آمنیوتیک بیان قابل توجه مارکر رودوپسین (30%) را در این سلولها نشان داد که بیانگر دگرتمایز سلول پوششی رنگدانه دار شبکیه به سلول گیرنده نوری استوانه ای شکل می باشد. همچنین نتایج آنالیز real time pcr تاثیر شگفت انگیز فاکتورهای رشد مایع آمنیوتیک را بر بیان پروتئین ویژه و مارکر سلولهای گانگلیونی (thy-1 ) نشان داد و مشخص ساخت که این تاثیربا نسبت مایع آمنیوتیک در محیط کشت رابطه مستقیم و تنگاتنگی دارد و به موازات افزایش غلظت مایع آمنیوتیک بطور چشمگیری افزایش می یابد. نتیجه گیری : مایع آمنیوتیک انسانی منبع غنی بسیار ارزشمندی از انواع فاکتورهای رشد می باشد که تاثیر چشمگیری بر رشد و تمایز سلولهای پوششی رنگدانه دار شبکیه از خود نشان می دهد و می تواند به عنوان یک جایگزین مناسب سرم در محیط های کشت مورد استفاده در تحقیقات بازتولید سلولهای شبکیه به کار گرفته شود.

هدف: به منظور دستیابی به سلول های پروژنیتوری-عصبی شبکیه، کشت سلول های اپیتلیوم رنگدانه دار شبکیه (rpe) انجام شد و سپس این کشت تحت تاثیر مایع آمنیوتیک انسانی (af) قرار گرفت. روش ها: سلول های rpe جداسازی شده از کره های چشم اجساد انسانی در سنین جنینی تا نوزادی (که بیش از 24 ساعت از زمان مرگ آنها نگذشته بود) از بانک چشم جمهوری اسلامی ایران تهیه شد و در محیط dmem/f12 غنی شده با 10% سرم جنینی گوساله (fbs) کشت شدند. در پاساژهای مشخص، سلول ها تریپسینه شدند و تحت تاثیر محیط حاوی af (گرفته شده از خانم های باردار با سن بارداری حدود ??-?? هفتگی) کشت داده شدند. قدرت تحریک af بر تکثیر و مرگ سلول های rpe در پاساژهای 5-2، با استفاده از تکنیک elisa مورد سنجش قرار گرفت. همچنین بیان هسته ای پروتئین های مارکر پروژنیتوری شبکیه (pax6 , chx10 ) با استفاده از روش ایمونوسیتوشیمی (icc) در سلول های rpe کشت شده در محیط af 30% در مقایسه با محیط های fbs 10% و dmem/f12 بررسی شد. در ادامه، استخراج rna، ساخت cdna و real-time pcr نیز جهت تائید داده های قبلی انجام شد. نتایج: سنجش elisa، افزایش رشد سلول های rpe را در محیط کشت af 30% در مقایسه با محیط بدون af نشان داد، در حالیکه میزان رشد و تقسیم سلول ها در محیط af 30% و محیط fbs 10% تقریبا به یک میزان بود. بررسی های ایمونوسیتوشیمی از مارکرهای پروژنیتوری-عصبی شبکیه نشان داد که پروتئین های پروژنیتوری در سلول های تحت تاثیر محیط af30%، نسبت به سلول های کشت شده در محیط fbs 10% تا ? برابر افزایش یافته اند. بررسی کمی بیان ژن های پروژنیتوری با استفاده از آزمون real-time pcr نیز نتایج قبلی را مورد تائید قرار داد و توانایی af را برای افزایش سلول های پروژنیتوری در کشت rpe به اثبات رساند. نتیجه گیری: داده های ارائه شده در این تحقیق، نشان داد که af توانایی خوبی برای تحریک تکثیر سلول های rpe و جهت دهی آنها به مسیر تولید سلول های پروژنیتوری-عصبی شبکیه دارد. سلول های پروژنیتوری-عصبی شبکیه بدست آمده از این طریق می توانند یک مدل مناسب جهت انجام مطالعات پایه ای و حتی یک منبع سلولی مناسب برای درمان های جایگزینی سلولی در بیماری های شبکیه باشند.

سلول های rpe جداسازی شده از کره های چشم اجساد انسانی در سنین جنینی تا نوزادی که بیش از ?? ساعت از زمان مرگ آنها نگذشته بود از بانک چشم جمهوری اسلامی ایران تهیه شد و در محیط dmem/f12 غنی شده با %10 سرم جنین گوساله (fbs ) کشت شدند. در پاساژهای مشخص سلول ها تحت تاثیر محیط حاوی غلظت های مختلف anti-ctgf و avastin( anti-vegf antibody) قرار گرفته و غلظت های مورد نظر انتخاب و در مرحله پایانی اثر ترکیبی از هر دو بر روی سلول های rpe مورد بررسی قرار گرفت. در سطح رونویسی تغییرات میزان بیان vegfa ، vegfr-1 ، mmp-2، mmp-9، timp-1 ، timp-2، cathepsin d، ?-sma مورد بررسی قرار گرفت ، مقدار پروتئین های mmp-2 و mmp-9توسطwestern blot و slot blot ارزیابی شده و میزان فعالیت mmp-2 و mmp-9 تحت تاثیر تیمار های مختلف توسط zymography مورد سنجش قرار گرفت و همچنین تکثیر و مرگ سلول های rpe تیمار شده با استفاده از تکنیک elisa بررسی شد. نتایج: توسط تست ایمونوسیتوشیمی بیان مارکرهای rpe65 و 8/18cytokeratin هویت سلول ها مورد تایید قرار گرفت. سنجش elisa برای تکثیر و مرگ سلولی در غلظت های مختلف ,avastin (0.25, 0.5 and 0.8 mg/ml) و anti-ctgf (10 µg/ml) و ترکیب هر دو دارو0.8 mg/ml (avastin)/ 10 µg/ml (anti-ctgf) نشان داد که تیمار های انجام شده هیچ تاثیری از لحاظ تکثیر و مرگ سلولی بر کشت های انجام شده نداشته است. تیمارهای مربوط به (0.25, 0.5 and 0.8 mg/ml) avastin حاکی از اثر افزایشی غلظت های مختلف دارو بر میزان ترشح پروتئین mmp-2 و mmp-9 بود. در نمونه های تیماری 10 µg/ml))anti-ctgf میزان ترشح پروتئین mmp-2 کاهش یافت ولیکن دارو برمیزان ترشح mmp-9 اثر افزایشی نشان داد. در مورد ترکیب هر دو آنتی بادی0.8 mg/ml (avastin) ، 10 µg/ml (anti-ctgf) اثر کاهشی میزان ترشح mmp-2 و mmp-9 مشاهده گردید. زایموگرافی نشان داد که به ترتیب با افزایش غلظت داروی avastin فعالیت آنزیم mmp-2 افزایش می یابد اما در مورد آنتی بادی anti-ctgf شاهد اثر کاهشی آن بر روی فعالیت mmp-2 بودیم. با ترکیب هر دو آنتی بادی اثر کاهشی بسیار کمی بر روی میزان فعالیت آنزیم mmp-2 مشاهده گردید. در مورد mmp-9 باند قابل مقایسه ای در تیمارهای avastin مشاهده نشد اما اثر افزایشی anti-ctgf بر میزان افزایش فعالیت mmp-9 مشهود بود و در ترکیب هر دو آنتی بادی نیز باندها قابل مقایسه نبودند. با افزایش غلظت داروی avastin میزان بیان ژن های mmp-2, cathepsin d و vegfr-1 افزایش نشان داد اما این دارو بر روی میزان بیان ژن های ?-sma , timp-2 و vegfa اثر کاهشی داشت. در مورد ژن timp-1 هیچ اثر قابل توجه معنی داری از این دارو دیده نشد. با بررسی تیمارهای مربوط به anti-ctgf و مقایسه آنها با نمونه های کنترل اثر کاهشی آنتی بادی بر روی میزان بیان vegfa، vegfr-1 و mmp-2 و تاثیر افزایشی آن بر روی timp-1 و timp-2 مشاهده شد اما تاثیر معنی داری نسبت به ?-sma و cathepsin d ایجاد نگردید. با بررسی ترکیب هر دو آنتی بادی بر روی سلول های rpe اثر معنی داری بر روی میزان بیان mmp-2 و ?-sma مشخص نشد اما اثر افزایشی این ترکیب بر روی timp-1، timp-2، vegfr-1، cathepsin d و vegfa معنی دار بود. نتیجه گیری: داروی avastin باعث افزایش فعالیت، ترشح و بیان عوامل موثر و شناخته شده در رگزایی می گردد به طوری که با افزایش غلظت دارو این اثر افزایشی تشدید می شود و منجر به تقویت پیام های مربوط به فرآیند رگزایی گشته و انتظار میرود در in vivo شاهد افزایش رگزایی باشیم درتحقیقات انجام شده این مطلب نشان داده شد که وضعیت سلول های rpe در نحوه پاسخ دهی به avastin نقش تعیین کننده ای داشته و ممکن است پاسخ های نامناسبی و غیر منتظره ای را در مقابل avastin در فرآیند رگزایی نشان دهند. ctgfبدلیل نقش هایی که در تکثیر سلولی، مهاجرت، چسبندگی سلولی و تشکیل ماتریکس خارج سلولی ایفا می نماید به هدفی بسیار مهم برای درمان بیماری هایی که در آنها رگزایی و فرآیند فیبروز مشکل ساز می باشد تبدیل شده است. anti-ctgf با تاثیر افزایشی که بر روی timp-1 و timp-2 دارد باعث کاهش فعالیت mmp-2 ،که نقش مهمی در فرآیند رگزایی دارد، میشود و با کاهش بیان vegfa و vegfr-1 در سلول های rpe تاثیر منفی بر روی فرآیند رگزایی اعمال می نماید اما با ترکیب avastin و anti-ctgf فاکتورهای vegfa، vegfr-1 و cathepsin d که عوامل اصلی رگزایی می باشند، افزایش پیدا می کنند. اما مزیتی که استفاده از هر دو تیمار دارد این است که timp-1 و timp-2 نسبت به کنترل به میزان بسیار بیشتری بیان می شوند.

وجود اسکلت سلولی طبیعی و کارآمد برای رشد طبیعی سلول ها ضروری بوده و هرگونه تغییر در آن می تواند در روند سرطانزایی تاثیرگذار باشد. در این رابطه خانواده پروتئینی تروپومیوزین به عنوان پروتئین های متصل شونده به اکتین نقشی اساسی در پایداری و ثبات ساختار اسکلت سلولی دارند. تغییرات بیان ایزوفرم های تروپومیوزین در برخی سرطان ها مشاهده شده، اما مکانیسم مولکولی آن به خوبی شناخته نشده است. از سوی دیگر سرطان سلول سنگفرشی مری به عنوان یک بدخیمی شایع و کشنده، دارای بالاترین میزان شیوع در کشور ایران می باشد و بررسی عوامل ژنتیکی دخیل در این بیماری برای یافتن راههای تشخیص سریع تر و درمان دقیق تر جایگاه ویژه ای دارد. البته، مطالعاتی که تاکنون بر روی این سرطان صورت گرفته، به دلیل در دسترس نبودن کشت سلولی و رده های سلولی ایرانی، اساسا بر روی نمونه های بافتی بوده است. در این مطالعه کشت سلولی اولیه از بافت های نرمال و توموری مری تهیه شده و تغییرات بیان ایزوفرم های سنگین تروپومیوزین در این سلول ها مورد بررسی قرار گرفته است. همچنین به منظور تعیین مکانیسم مولکولی موثر در این تغییرات، نقش مسیر انتقال پیام rasو پدیده اپی-ژنتیکی متیلاسیون dna با استفاده از مهارکننده های آنزیم متیلاز، فاکتور mek و نیز فاکتور pi3k بررسی گردید. انجام این مطالعه، ایجاد اولین رده سلولی کارسینومای سلول سنگفرشی مری با منشا ایرانی را به دنبال داشته است که مدل مناسبی را برای مطالعه بیشتر سرطان مری در ایران مهیا می کند. نتایج حاصله نشان می دهد که در کارسینومای سلول سنگفرشی مری بیان ایزوفرم های tm1، tm2 و tm3 نسبت به سلول های نرمال به شدت کاهش می یابد. بررسی در سطح رونویسی نیز کاهش بیان ژن های tpm1 و tpm2 را نشان داده است. بعلاوه مهار مسیرهای افکتوری mek و pi3k و نیز مهار آنزیم متیلاز در سرطان سلول سنگفرشی مری افزایش بیان ایزوفرم tm1 و رونوشت ژن های tpm1 و tpm2 را به دنبال دارد. بنابراین به نظر می رسد کاهش بیان ایزوفرم-های سنگین تروپومیوزین به عنوان پدیده ای مهم در روند سرطانزایی مری بوده و در این رابطه فعال بودن مسیر انتقال پیام ras و مسیرهای افکتوری پایین دستی آن اعم از mek/mapk و pi3k/akt به همراه هایپرمتیلاسیون ناحیه پروموتری ژن tpm2 در مهار بیان tm1 در سرطان مری موثرند.

چکیده از آنجا که محتوای ملانین در سلول های rpe افراد بالغ و نوزاد و همچنین بین پاساژهای مختلف سلولی در شرایط معمولی محیط کشت متفاوت می باشد در این مطالعه ژن های اصلی در مسیر سنتز ملانین، mitf-a، mitf-h، mitf-d و otx2 به عنوان فاکتورهای مهم رونویسی و تیروزیناز (tyr) و دوپاکروم تاتومراز (dct) به عنوان آنزیم های موثر در مسیر سنتز ملانین بررسی شدند. در ابتدا سلول های rpe از گلوب های چشم انسان های بالغ و نوزاد جدا شده و سپس در محیط dmem: f12 (1:1) حاوی%10 fbs کشت داده شدند. توسط آزمایش ایمونوسیتوشیمی (icc) بیان مارکر های rpe65 و cytokeratin 8/18 در سلول های جدا شده مورد تأیید قرار گرفت. بیان ژن های mitf-a، mitf-h، mitf-d ، otx2، tyr و dct در پاساژ های 7-1 سلول های rpe کشت داده شده با استفاده از روش real-time rt-pcr مورد ارزیابی قرار گرفت. با توجه به نتایج real-time rt-pcr بیان ژن های mitf-h، otx2، tyr و dct در سلول های rpe افراد نوزاد نسبت به افراد بالغ افزایش معنا داری را نشان داد همچنین با افزایش پاساژ سلول های rpe بیان ژن های mitf-h، otx2، tyr و dct کاهش معنا داری را نشان می داد. به نظر می رسد کاهش در بیان فاکتورهای رونویسی otx2 و mitf-h باعث کاهش در بیان ژن های tyr و dct می شود. با توجه به نقش آنزیم های تیروزیناز و دوپاکروم تاتومراز در فرآیند سنتز ملانین، می توان پیشنهاد نمود که کاهش بیان این ژن ها باعث کاهش سنتز ملانین در سلول های rpe می گردد.

هدف: سلول های اپی تلیالی رنگدانه دار شبکیه (rpe ) یک لایه سلول رنگدانه دار در درونی ترین لایه شبکیه تشکیل می دهند. این سلول ها توانایی باز برنامه نویسی و در نتیجه تولید سلول های پیش ساز شبکیه را دارند. sox2 یک فاکتور رونیسی و یک مارکر مهم برای سلول های پیش ساز عصبی و سلول های بنیادی می باشد و سبب حفظ خاصیت پر توانی سلول های بنیادی می شود. هدف از این مطالعه تولید سلول های پیش ساز عصبی به وسیله بیش بیان ژن sox2 در سلول های rpe بوده است. مواد و روش ها: سلول های rpe از کره چشم انسان جدا شده و در محیط dmem/f12 همراه با 20% از fbs کشت داده شدند، در پاساژهای بعدی این سلول ها در محیط dmem/f12 همراه با 10% fbs کشت داده می شدند. ژن sox2 در وکتور لنتی ویروسی plex-mcs کلون گردید و به وسیله هضم آنزیمی، pcr و تعیین توالی، صحت کلونینگ مورد تایید قرار گرفت. وکتور plex-mcs sox2 به همراه وکتورهای کمکی با روش کلسیم فسفات به سلول های hek293t ترنسفکت گردید. این سلول ها ویروس را به محیط آزاد کرده و ویرس ها از محیط جمع آوری گردیدند. سلول های rpe با این ویروس ها آلوده گشته و پس از 96 ساعت با آنتی بیوتیک پرومایسین با غلظت µg/ml 7/0 مورد تیمار قرار گرفتند. پس از 72 ساعت سلول های آلوده گشته زنده مانند. بیان مارکرهای سلول های پروژنیتور مانند pax6، chx10، sox2، nestin و هم چنین مارکرهای سلول های عصبی شبکیه مانند rhodopsin و thy1 توسط روش های icc و real time pcr مورد بررسی قرار گرفتند. نتیجه گیری: بیان قوی مارکرهای pax6، chx10، sox2، nestin به عنوان مارکرهای پروژنیتوری و هم چنین بیان مارکرهای rhodopsin و thy1 به عنوان مارکرهای سلول های عصبی شبکیه مشاهده گردید. این نتایج نشان می دهد که بیش بیان ژن sox2 موجب باز برنامه نویسی و دگر تمایز سلول های rpe به سمت سولهای بنیادین و پروژنیتوری شبکیه می گردد. کلید واژه: سلول های rpe، sox2، باز برنامه نویسی، دگر تمایز

مقدمه: شبکه آندوپلاسمی به واسطه وجود چاپرون هایی نظیر grp78 نقش مهمی در بلوغ و تاخوردگی پروتئینها بازی میکند. تجمع پروتئین های تا نخورده در شبکه آندوپلاسمی منجر به فرایند استرس شبکه آندوپلاسمی میشود که پاسخ به این فرایند با کاهش کلی سنتز پروتئین و افزایش بیان چاپرون هایی نظیر grp78 همراه میباشد. در سلولهای رنگدانه دار شبکیه چشم افراد بالغ طولانی شدن فرایند er stress باعث مرگ برنامه ریزی شده این سلولهاو آسیب های شبکیه و بنابراین بیماری های شبکیه نظیر amdو rp میشود. هدف از این مطالعه بررسی کاهش بیان grp78 در سلولهای rpe و اثر آن برروی برخی از فاکتورهای مهم التهابی ونیز اثر آن برروی آپوپتوز و تکثیر سلولی بود. متد سلولهای rpe از کره های چشم افراد بالغ جدا شد وسلول های rpe جدا شده در محیط dmem/f12 حاوی 20 درصد fbs کشت داده شد و سپس در محیط dmem/f12 حاوی 10 درصد fbs زیرکشت های سلولی بعدی انجام شد. هویت آنها به وسیله ی مارکرهای اختصاصی rpe65 و سیتوکراتین 18/8 اثبات شد. در آزمایشات بعدی کشت های سلولی بین پاساژهای 2-7 توسط sirna مخصوص grp78 مورد تیمار قرار گرفتند. سلولهای تیمار شده با sc sirna ، transfection reagent و سلولهای rpe بدون تیمار به عنوان کنترل های آزمایش مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج real time pcr کاهش قابل ملاحظه ای دربیان grp78 نشان داد. بیان caspase4 کاهش یافته و بیان crp افزایش یافته بود. مقدار رونوشت های mcp1، cfh، c5، c3، cd59و cd55بدون تغییر باقی مانده بود. تیمارهای rnai هیچ اثر ناخواسته ایی برروی مرگ برنامه ریزی شده و تکثیر سلولی در سلولهای ترانسفکت شده در مقایسه با کنترلها نداشت. بحث براساس مشاهدات به نظر میرسد که مقدار رونوشت caspase4 در ارتباط نزدیک با بیان grp78 میباشد و از آنجایی که caspase4 به عنوان یکی از عوامل مهم در آپوپتوز شناخته شده است میتوان نتیجه گرفت که کاهش grp78 میتواند مانع از آپوپتوزدر سلول های تیمار شده گردد.از طرف دیگر مقدار افزایش یافته ی crp پاسخ های ضد التهابی را تقویت میکند. نتایج این تحقیق نشان داد از آنجا که در بیماری amdعلت اصلی آسیب به سلول های فتورسپتوری التهاب و تخریب سلولهای rpe می باشد کنترل بیان grp78می تواند اثرات مطلوبی در کنترل پیشرفت و توسعه ی بیماری داشته باشد. واژه های کلیدی : سلولهای rpe، استرس شبکه آندوپلاسمی، grp78، sirna، فاکتورهای التهابی، آپوپتوز،تکثیر سلولی

بافت پوششی رنگدانه دار، یک تک لایه سلولی در خارجی ترین بخش شبکیه است که وظایف متعددی در حفظ و نگهداری عملکرد سلول های شبکیه به ویژه فوتورسپتورها(گیرنده های نوری) دارد. اختلال در هر یک از این عملکردها سبب بروز بیماری های شبکیه می شود.امروزه شناخت خواص منحصر به فرد وابسته به اندازه نانو ذرات آنها را در بسیاری از زمینه های زیست شناسی از جمله مهندسی بافت برتر و ضروری کرده است. در این پژوهش اثر نانو ذرات پوشش دار طلا، به عنوان بستر، بر رشد و تمایز سلول های اپیتلیالی پیگمانه شبکیه چشم انسان مورد بررسی قرار گرفت.از آمینواسیدهای مختلف برای تهیه نانو ذرات و پوشش دار کردن همزمان آن ها استفاده شد. پوشش هایی که به نسبت آب دوست و سازگار با محیط کشت هستند.ریخت شناسی سلول های rpe در وقفه های زمانی منظم در حین کشت توسط میکروسکوپ فاز کنتراست بررسی شد. قدرت تکثیر و مرگ سلول های rpe با استفاده از روش ه elisa و تعداد سلول های زنده با آزمون mtt مورد سنجش قرار گرفت. استخراج rna و سنتز cdna جهت بررسی بیان تعدادی از ژن های سلول های پروژنیتوری شبکیه، نورون های شبکیه و سلول های rpe با روش real-time pcr انجام شد. نتایج بررسی نشان داد که بستر نانو ذرات هیج اثر سمیت بر کشت سلول های rpe نداشته، سلول ها روی بستر نانو ذرات رشد کرده و تمایل به تغییر هویت به سمت سلول های پیش ساز شبکیه را داشتند.

نانو ذره های طلا پایدارترین نانو ذره های فلزی می باشند. نانو ذره های طلا به عنوان بستری مناسب جهت کشت سلولی مورد توجه بوده است. سلول های rpe بافت های بسیار تخصص یافته ای هستند که بین لایه کرویید و شبکیه عصبی واقع شده اند. سلو های rpe مواد مغذی را برای گیرنده های نوری حساس فراهم می کنند. از آمینو اسید های آسپارژین، تریپتوفان (آمینو اسیدهای خنثی)و آرژنین و لیزین (آمینو اسیدهای بازی) برای کاهش یون طلا استفاده شد. در ابتدا سلول های rpe روی بستر سنتز شده از نانو ذره های طلا کشت داده شد. محیط کشت مورد نیاز شامل dmem/f12, fbs10% بود. از کشت سلول های rpe روی پلی استیرن به عنوان نمونه کنترل استفاده شد. مورفولوژی سلول های rpe مورد بررسی قرار گرفت. سرعت رشد و مرگ سلولی توسط تکنیک الایزا بررسی شد. اثر نانو ذره های پوشش دار طلا روی تعداد سلول های زنده توسط تست mtt صورت گرفت. به منظور بررسی بیان ژن ها، پس از استخراج rna از نمونه های کشت شده سنتز cdna و به دنبال آن تکنیکreal -time pcr انجام شد. نانو ذره های پوشش دار طلا محیط های بازی و اسیدی را برای سلول های rpe فراهم می کنند. سلول های rpe روی سطح نانو ذره های طلای پوشش دار رشد کردند. نانو ذره های طلا عاملی برای القای مرگ سلولی نبودند. سلول های روی سطح نانو ذره های طلا زنده ماندند و توانستند رشد و تکثیر پیدا کنند. بیان بالای ژن pax6 نشان داد سلول های rpe تمایل دارند به سمت سلول های اولیه و بنیادین شبکیه بروند.

سلولهای بنیادی مزانشیمی علاوه بر دخالت در بازسازی اندام های مختلف در بدن و نقشی که در داخل بدن در این زمینه بازی می کنند، به دلیل توان تمایزشان به انواع مختلف سلولی نظیر سلولهای کندروسیت، میوسیت، استئوسیت، فیبروبلاست، آستروسیت و غیره و همچنین به این دلیل که می توان آنها را از خود شخص بزرگسال بدست آورد در بحث مهندسی بافت مورد توجه فراوان قرار گرفته اند. در مهندسی بافت یکی از چالشهای همیشگی ایجاد رگزایی مناسب در سازه ی بافتی می باشد. این در حالی است که توان سلولهای بنیادی مزانشیمی در تولید فاکتورهای رگزا نظیر vegf نشان داده شده است. همچنین مطالعات نشان دهنده ی کمک سلولهای بنیادی مزانشیمی به رگزایی تومورها می باشد. به گونه ای که جذب این سلولها به منطقه ی توموری و ترشح فاکتورهای رگزایی توسط این سلولها می تواند باعث تسریع روند رگزایی در تومورها شود. در نتیجه عوامل تنظیم کننده ی تولید فاکتورهای رگزایی در سلولهای بنیادی مزانشیمی می توانند هم در مهندسی بافت و هم در بحث سرطان ها حائز اهمیت باشند. آراشیدونیک اسید یکی از اسیدهای چرب طبیعی موجود در بدن انسان است که به این دلیل که نمی تواند از پایه در سلولهای انسانی سنتز شود، بیشترین مقدار آن از لینولئیک اسید مشتق می شود که لینولئیک اسید هم تنها از منابع غذایی بدست می آید. مطالعات متعدد بیانگر تا?ثیر آراشیدونیک اسید و متابولیت های آن بر افزایش تولید فاکتورهای رگزایی در انواع مختلف سلولها نظیر سلولهای سرطانی ، سلولهای اندوتلیال انسان و سلولهای بنیادی جنینی موش می باشد. در این مطالعه اثر آراشیدونیک اسید بر میزان فاکتورهای رگزایی در سلولهای بنیادی مزانشیمی انسان بررسی شده است. برای این منظور سلولهای بنیادی مزانشیمی از بافت چربی انسانی از طریق هضم بافت چربی توسط آنزیم کلاژناز تیپ یک و انجام سانتریفیوژ جدا گشته و در محیط dmem حاوی 20% از fbs کشت داده شدند. خلوص کشت ها توسط ایمونوسیتوشیمی و با استفاده از آنتی بادی monoclonal mouse anti-human vimentin بررسی شد و خلوص سلولهای 99% برآورد گردید. سلولهای بنیادی مزانشیمی با آراشیدونیک اسید (غلظت های 1?m, 2.5?m, 5?m, 25?m, 100?m) در محیط جدید حاوی 10% از fbs و بسته به نوع تست در زمان های 24 و 48 ساعت تیمار شدند. با استفاده از تست های real-time rt-pcr و vegf elisa نشان داده شد که بطور کلی غلظت 25?m آراشیدونیک اسید بهترین تا?ثیر را بر روی افزایش فاکتورهای رگزا شامل vegf-a، flk-1 و mmp-9 دارد. همچنین با استفاده از تست scratching تا?ثیر مثبت 25?m آراشیدونیک اسید بر تکثیر این سلولها نشان داده شد. هرچند که تست mtt بیانگر چنین اثر گذاری نبود اما به هر حال نتایج تست mtt نشان دهنده ی عدم سمیت غلظت های مورد استفاده بود. چراکه کاهش قابل توجهی نیز در تعداد سلولهای نمونه های تیمار نسبت به نمونه ی کنترل دیده نشد. در نتیجه این پژوهش نشان داد که آراشیدونیک اسید با افزایش فاکتورهای رگزا در سلولهای بنیادی مزانشیمی می تواند به عنوان عاملی مفید در بحث رگزایی در مهندسی بافت و به عنوان عاملی مضر در بحث رگزایی تومورهای سرطانی ایفای نقش کند.

اپیتلیوم رنگدانه¬دار شبکیه چشم(rpe) یک تک لایه شامل سلول¬هایی است که نورون¬های شبکیه را محافظت می¬کنند. در طول تکوین، rpe و نورون¬های شبکیه از یک پیش¬ساز مشترک به¬نام حباب بینایی منشا می-گیرند. sox2 یک فاکتور رونویسی است که حاوی جعبه hmg است و از ژن¬های مهم در تکوین چشم می¬باشد که دیده شده در شرایط مناسب، تمایززدایی سلول¬های rpe را القا می¬کند. هدف از این مطالعه سنجش توانایی sox2 انتقال¬یافته توسط ویروس وابسته به¬آدنو(aav) در ایجاد تغییرات تمایزی سلول¬های rpe انسان بالغ می¬باشد. مواد و روش¬ها: توالی کدکننده ژن sox2 در وکتور paav-mcs همسانه¬سازی و توسط روش¬های colony pcr، هضم آنزیمی و تعیین توالی، تایید شد. جهت رهگیری بیان ژن در سلول¬های جانوری، قطعه ires-egfp نیز در وکتور بیانی همسانه¬سازی شد. محصول واکنش اتصال به باکتری e.coli منتقل و باکتری¬های تراریخت توسط آزمون استخراج quick check مشخص و با روش¬های هضم آنزیمی، واکنش زنجیره¬ای پلیمراز و تعیین توالی وکتور بیانی نهایی تایید شد. با استفاده از وکتور گزارشگر paav-lacz ترنسفکشن سلول¬های hek293t به روش کلسیم فسفات بهینه شد و این سلول¬ها توسط وکتور نوترکیب حاوی sox2-ires-egfp، paav-rc و phelper ترنسفکت همزمان شدند. ویروس¬های نوترکیب پس از 72 ساعت جمع¬آوری شدند. از سه روش رنگ¬آمیزی x-gal، فلوسایتومتری و absolute quantification real-time pcr جهت تعیین تیتر ویروس¬های مختلف تولیدشده استفاده شد. کره¬های چشم انسان بالغ از بانک چشم جمهوری اسلامی ایران فراهم و سلول¬های rpe جداسازی و کشت داده¬شدند. این سلول¬ها توسط ویروس-های نوترکیب به روش¬های مختلفی آلوده¬شدند. جهت بررسی تغییرات بیان sox2 و پیامدهای حاصل از آن، آزمون¬های real-time pcr و ایمنوسیتوشیمی استفاده شدند. نتایج: داده¬های حاصل از تعیین تیتر ویروس نشان داد استوک اولیه ویروس¬های aav-sox2 جمع¬آوری شده دارای106×8/1 ویروس با توانایی آلوده¬سازی بود. روش آلوده¬سازی سلول¬های شناور به عنوان بهترین روش آلوده¬سازی سلول¬های rpe انتخاب شد. تجزیه تحلیل داده¬های حاصل از real-time pcr نشان داد پس از مهار تکثیر سلولی، به¬دنبال افزایش بیان sox2، نستین به عنوان نشانگر سلول¬های پیش¬ساز عصبی، در سلول¬های آلوده¬شده با ویروس نوترکیب حاوی sox2 افزایش بیان پیدا می¬کند. همچنین ژن pax6 نیز تغییرات بیان معنادار باسطح اطمینان 99% نشان داد. در آزمون ایمنوسیتوشیمی بروز سلول¬های مثبت برای نشانگرهای تمایزی مانند thy1 که نشانگر سلول¬های گانگلیونی است مشاهده شد. همچنین برای اولین بار نتایج ایمنوسیتوشیمی این تحقیق تغییرات rpe به سمت سلول گیرنده نور استوانه¬ای را تحت تاثیر sox2 نشان داد. در نهایت نتایج این تحقیق نشان داد که افزایش بیان sox2 سبب القا تغییرات تمایزی سلول¬های rpe انسان بالغ می¬شود.

عملکرد سلول های اپیتلیوم رنگدانه دار شبکیه (rpe) در حمایت و حفظ کارکرد سلول های گیرنده ی نوری ضروری است. ایجاد اختلال در عملکرد صحیح سلول های rpe می تواند موجب بیماری هایی نظیر رتینیت پیگمنتوزا (rp) یا تخریب وابسته به سن ماکولا (amd) شود. یکی از راه کارهای درمانی این دو بیماری پیوند سلول های rpe سالم در فضای آسیب دیده است. به منظور افزایش قدرت اتصال و بقا سلول ها، پیوندزدن سلول ها به همراه یک داربست ضروری است تا شرایط رشد و بقای سلول ها را فراهم کند. در این تحقیق، رشد سلول های rpe انسانی بر روی اشکال فیبریل های آمیلوئیدی پروتئین لیزوزیم بررسی شده است. پروتئین لیزوزیم به عنوان یک پروتئین مدل در مطالعات روند فیبریلاسیون به شمار می رود از این رو فیبریلاسیون پروتئین لیزوزیم در بافر اسیدی انجام شد و ویژگی های اشکال فیبریلی توسط رنگ های اختصاصی تیوفلاوین تی و کنگوی قرمز، میکروسکوپ فلورسنس، انتقال فوریه ی فروسرخ، طیف سنجی دورنگ نمایی دورانی، تصویربرداری میکروسکوپ نیروی اتمی و تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی نگاره ارزیابی شد. فیبریل های آمیلوئیدی ساخته شده قطری بین 23 تا 50 نانومتر داشتند و برای ساخت بستر نانوفیبریلی استفاده شدند. در نهایت سلول های rpe بر روی بستر کشت داده شدند و آنالیز های سلولی شامل سنجش میزان سمیت، میزان رشد سلولی، میزان ros سلولی و ریخت شناسی سلولی انجام شد. نتایج نشان داد رشد سلول ها در بستر نانوفیبریلی نسبت به پلیت کشت سلول مشابه است. از این رو بستر فیبریل های آمیلوئیدی با ریخت شناسی ارائه شده می تواند به عنوان یک کاندید مناسب در بررسی میانکنش های سلول-ماتریکس و کاربرد های پزشکی در آینده مطرح باشد.

چکیده ندارد.