مولتیپل اسکلروزیس (ms) یک بیماری عصبی با واسطه ایمنی است که در آن از بین رفتن میلین سلولهای عصبی روی می دهد و بیماری فرساینده دستگاه عصبی مرکزی(cns) است. هیچ آنتی ژن هدف مخصوصی که به وسیله سیستم ایمنی بیماران ms مورد حمله قرار گیرد هنوز شناخته نشده است. علت بیماری ms هنوز شناخته شده نیست. عقیده بر این است که این بیماری با فاکتورهای میکروبی، ژنتیکی و یا محیطی ارتباط دارد. مولتیپل اسکلروزیس به عنوان یک بیماری با واسطه th1 بررسی شده است. این نظریه بر اساس مطالعه آسیب های مغزی و مایع مغزی نخاعی و همچنین بررسی مدلهای حیوانی این بیماری می باشد. ثابت شده است که پاسخ های ایمنی نابجا در ms رخ می دهد و طیف سایتوکاین هایی که تولید می شود قطعاً نتیجه بیماری را تحت تاثیر قرار می دهد. سایتوکاین ها پروتئین های محلول یا گلیکوپروتئین هایی هستند که هم در واکنش های التهابی ایمونولوژیک و هم در واکنش های غیر ایمونولوژیک شرکت می کنند. سایتوکاین ها همه مراحل پاسخ ایمنی را از ابتدا تا انتهای بیماری هماهنگ می کنند. آنها به وسیله انواع سلول ها ترشح می شوند و روی سلولهایی که گیرنده مناسب سایتوکاین را بیان می کنند عمل می کنند. تومور نکروز فاکتور آلفا (tnf-?) یک سایتوکاین تنظیم کننده ایمنی است که در بیماری های التهابی معینی مثل ms و روماتوئید آرتریت (ra) دخیل می باشد. در بررسی افراد مستعد به ms، آلل های tnfکه در منطقه کلاس ? کمپلکس سازگار نسجی (mhc) قرار دارند به عنوان ژنهای کاندید مطالعه می شوند. سلولهای دودمان منوسیت/ ماکروفاژ بزرگترین منبع تولید tnf-? می باشند. یکی از قوی ترین محرکها برای منوسیت ها اندوتوکسین (lps) باکتریایی است که از دیواره سلولی خارجی باکتریهای گرم منفی مشتق شده است. در پاسخ به لیپوپلی ساکارید (lps)، منوسیت ها مقدار زیادی سایتو کاین های پیش التهابی مثل tnf-?، اینترلوکین شش (il-6) و اینترلوکین یک (il-1) را تولید می کنند. سلول هایی که این سایتوکاین را تولید می کنند در آسیب های ms شناسایی شدند و نشان داده شده که بیان تومور نکروز فاکتور آلفا در منوسیت های خون بیماران ms با فعالیت بیماری ارتباط دارد. چندین مطالعه سطوح سایتوکاین ها را در مولتیپل اسکلروزیس بررسی نموده اند که نتایج متفاوتی در بر داشته است. لپتین یک پروتئین غیر گلیکوزیله 16 کیلودالتونی است که به وسیله ژن ob کد می شود که روی کروموزوم 7 انسانی و روی کروموزوم 6 موشی قرار گرفته است. علاوه بر نقش مهم آن در اعمال فیزیولوژیکی، لپتین به عنوان یک هورمون مشابه سایتوکاین با اعمال متفاوت در تنظیم پاسخ های ایمنی شناخته شده است. بعلاوه لپتین می تواند منوسیت ها، سلول های دندریتیک و ماکروفاژها را فعال کند و آنها را برای تولید سایتوکاین نوع th1 تحریک کند. پیشنهاد شده که این هورمون ممکن است نقشی را در تعدادی از بیماری های خود ایمن مانند ms و ra که در آنها عدم تعادل در th1/th2 ایجاد می شود داشته باشد. در این مطالعه، تولید سایتوکاین پیش التهابی تومورنکروزفاکتور آلفا به وسیله منوسیت های بیماران مبتلا به مولتیپل اسکلروزیس و افراد سالم تحریک شده با lps و لپتین مورد بررسی قرار گرفت. سنجش سایتوکاین tnf-? در داخل سلول به روش فلوسایتومتری و و در پلاسما به وسیله الایزا انجام شد. در خصوص سنجش فلوسایتومتری از 17 بیمار مبتلا به ms (14 زن و3 مرد) با میانگین سنی 12/9 ? 35/34 و 17 فرد سالم (14 زن و 3 مرد) با میانگین سنی 68/8 ? 82/31 به عنوان نمونه کنترل، خون محیطی تهیه شد. µl 100 خون محیطی فرد سالم یا بیمار با lps و لپتین برای مدت زمان های متفاوت تحریک گردیدند و سپس سلول ها با پارافرمالدئید 4% تثبیت شدند و با ساپونین 05/0 درصد نفوذپذیر شدند. در پایان، سلول ها با آنتی بادی ضد tnf-? رنگ آمیزی شدند و مورد سنجش فلوسایتومتری قرار گرفتند. با توجه به آنالیز های آماری، میانگین درصد سلول های tnf مثبت در حالت تحریک با لپتین در افراد مبتلا به ms (64/1?53/2) و افراد سالم (14/1?94/2) تفاوت معنی داری نداشت (263/0=p). همچنین شدت فلورسنت سلول ها در دو گروه اختلاف معنی داری نداشت (984/0=p). با مقایسه میانگین درصد سلول های tnf مثبت در حالت تحریک با lps در افراد مبتلا به ms (21/8?80/16) و افراد سالم (23/8?52/16) اختلاف معنی داری مشاهده نشد (850/0=p). شدت فلورسنت مربوط به tnf-? دو گروه بیمار و سالم نیز دارای تفاوت معنی داری نبود (293/0=p). برای سنجش غلظت tnf-? تحریک شده توسط سلول ها در دو گروه بیمار و سالم، پلاسمای 13 بیمار مبتلا به ms و 13 فرد سالم بررسی شد. خون محیطی افراد با lps و لپتین تحریک شده و پلاسمای آنها جدا شدند و به وسیله الایزا مورد سنجش قرار گرفتند. نتایج حاصل نشان دادند که میانگین غلظت tnf-? در حالت تحریک با lps در پلاسمای بیماران (15/12896?27830) و افراد سالم (14/23784?69/40217) معنی دار نبود (191/0=p). در مورد پلاسمای تحریک شده با لپتین میانگین غلظت tnf-? در پلاسمای بیماران ms (23/403?93/479) در مقایسه با افراد سالم (62/511?02/854) به طور ضعیف معنی دار بود (05/0>p). در بخش دیگری از تحقیق آنتی بادی ضد lps اشریشیاکلی در 60 بیمار مبتلا به ms و 60 فرد سالم به روش الایزا بررسی شد. با توجه به مقایسه میانگین ها، میزان جذب نوری مشاهده شده در بین دو گروه بیمار (391/0?722/0) و کنترل (381/0?633/0) دارای اختلاف معنی داری نبود (171/0=p). با توجه به این مشاهدات می توان نتیجه گرفت که lps و لپتین قادر به تحریک منوسیت ها و ترشح سایتوکاین های پیش التهابی می باشند. در مورد بیماریزایی مولتیپل اسکلروزیس نمی توان نقش tnf-? را نادیده گرفت. بررسی نقش سایتوکاین های مختلف در مولتیپل اسکلروزیس نیاز به مطالعات بیشتر و دقیق تری دارد.

مولتیپل اسکلروزیس نوعی بیماری التهابی تخریب کننده میلین می باشد که عمدتا سیستم اعصاب مرکزی را درگیر می کند واز شایع ترین بیماری های اعصاب در انسان بوده که قریب به یک میلیون نفر را در سرتاسر جهان مبتلا کرده است. مطالعات همه گیر شناسی و علت شناسی در این بیماری مجموعه ای از عوامل ژنتیکی مانند دسته ای از ژنها در ناحیه کمپلکس سازگاری نسجی به همراه عوامل محیطی از قبیل عرض جغرافیایی محل زندگی، مهاجرت و عوامل عفونی را دخیل دانسته است. در میان عوامل عفونی محیطی ویروس ها و به خصوص خانواده هرپس ویروس ها مانند ویروس اپشتاین بار در این بیماری از اهمیت ویژه ای برخوردارند. ویروس اپشتاین بار که شیوع بالایی در بین افراد جامعه دارد از راه دو مکانیسم عمده تقلید مولکولی و فعال سازی رهگذری قادر است در ایجاد و یا توسعه بیماری مولتیپل اسکلروزیس نقش داشته باشد. پژوهش ها مشخص کرده که نزدیک به 100% بیماران مبتلا به مولتیپل اسکلروزیس آنتی بادی ضد آنتی ژنهای ویروسی را در سرم خود دارندو از آنجا که این ویروس سلولهای لنفوسیت b خاطره ای را بصورت نهفته آلوده می کند نقش عمده ای در پاسخ های ایمنی اکتسابی خود ایمن ایفا می کند. لپتین به عنوان یک هورمون با فعالیت چند گانه عمدتا از منابع بافت چربی ترشح شده و نقش عمده ای در تنظیم انرژی و متابولیسم بدن ایفا می کند. علاوه بر تشابه ساختاری این هورمون با سایتوکاین های سیستم ایمنی، گیرنده این هورمون نیز جزء کلاس یک خانواده گیرندههای سایتوکاینی است که بر روی طیف وسیعی از سلولها از جمله سلولهای سیستم ایمنی وجود دارد. اثرات این هورمون به عنوان یک سایتوکاین پیش التهابی اخیرا مشخص شده و بیان شده این هورمون قادر است با بر هم زدن تعادل پاسخهای th1/th2 به سمت th1 سبب کاهش نظارت سلولهای ناظر و افزایش واکنشهای التهابی گردد. این تحقیق به منظور یافتن ارتباط ویروس اپشتاین بار به عنوان یک عامل عفونی محیطی و هورمون لپتین به عنوان شاخصی از وضعیت ایمونوفیزیولوژیک بدن با بیماری مولتیپل اسکلروزیس انجام گرفت.سطح سرمی لپتین در نمونه ها به روش الایزا اندازه گیری شد و داده ها حاکی از میزان بسیار بالاتر این هورمون در سرم گروه بیمار ( 120 نفر) نسبت به گروه کنترل( 114 نفر) بوده و این تفاوت از نظر آماری کاملامعنی دار (p<0.0001) می باشد. پس از جفت نمودن نمونه ها از لحاظ فاکتورهای موثر در غلظت لپتین از جمله سن، جنس و شاخص توده بدنی مشاهده گردید سن تاثیر معنی دار در سطح سرمی لپتین نداشته ولی باز هم در دو گروه جفت شده از نظر جنس و شاخص توده بدنی اختلاف آماری معنی دار (p<0.001) مشاهده می شود. همچنین تفاوت معنی داری بین میانگین سطح سرمی لپتین در فرم های مختلف بیماری در گروه بیماران مشاهده شد(p<0.01). همچنین جهت مطالعه وجود اسید هسته ای ویروس اپشتاین بار در نمونه ها، یکصد نمونه سرم( 50 نمونه از گروه کنترل و 50نمونه از بیماران مولتیپل اسکلروزیس ) توسط روش real-time pcr بررسی شدند که نتایج حاکی از آن بود که هیچکدام از نمونه ها مثبت نبوده و بار ویروسی این ویروس در سرم آنها در حد تشخیص تست قرار نداشت. با توجه به نتایج بدست آمده در این تحقیق چنین به نظر می رسد که هورمون لپتین نقش ویژه ای در پبشبرد حالت التهابی مشاهده شده در بیماری مولتیپل اسکلروزیس به عهده داشته ولی ویروس اپشتاین بار فعالیت لیتیک خاصی در بیماران نداشته لیکن جهت مشخص شدن نقش عفونت های نهفته این ویروس با بیماری مولتیپل اسکلروزیس نیاز به تحقیقات بیشتر می باشد.

هورمون رشد انسانی یا سوماتوتروپین یک پروتئین تک رشته دارای 191 اسیدآمینه به صورت یک ساختار با 4 هلیکس دارای دو پل دی‎سولفیدی و وزن مولکولی حدود 22 کیلودالتون می‎باشد که توسط سلول‎های سوماتوتروف غده هیپوفیز ساخته شده و به جریان خون آزاد می‎شود. به علت فعالیت‎های بیولوژیکی مهم ومتنوع هورمون رشد، این هورمون دارای کاربردهای گسترده‎ای در پزشکی و بیوتکنولوژی می‎باشد. coli escherichia یکی از میزبان های اصلی برای تولید پروتئین خارجی است و از آنجایی که فرم فعال هورمون رشد به صورت غیرگلیکوزیله است، سیستم های بیان پروکاریوتی برای بیان این نوع پروتئین ها ترجیح دارد. از طرفی سلول‎های کشت شده پستانداران به خاطر تواناییشان در ایجاد ساختار صحیح پروتئین، تجمع و اصلاحات پس از ترجمه‎ای، سیستم مطلوب برای تولید پروتئین‎های نوترکیب با کاربردهای کلینیکی هستند. بنابراین زمانیکه یک پروتئین در سلول‎های پستانداران بیان می‎شود کیفیت واثر بهتری دارد در مقایسه با زمانیکه در سایر میزبان‎ها از جمله باکتری‎ها، گیاهان و مخمر بیان می‎شود. سیستم های گزارشگر ژنتیکی به عنوان ابزاری برای مطالعه ی تنظیم و بیان ژن ها در سلول های یوکاریوتی می باشند. ژن های گزارشگر دارای کاربردهای ویژه ای هستند و اغلب به عنوان شاخصی برای فعالیت رونویسی در سلول ها به کار می روند. در این تحقیق ابتدا هورمون رشد انسانی نوترکیب دارای توالی his-tag در سه سویه پروکاریوت (e.coli) شامل top10 ، xl1-blue وjm109 و در دو محیط کشت lb و4yt تولید و بهترین سویه تولید کننده rhgh با روش های dot blot،elisa ، sds-page وwestern blot تعیین شد. در ادامه طی یک فرایند کلونینگ توالی his-tag از وکتور حذف و مجدداً subclone تولید شده در سویه ی top10 بیان شد. و در نهایت هر دو نوع هورمون نوترکیب تولید شده در سلول پروکاریوتی به روش کروماتوگرافی ستون نیکل (برای نوع دارای توالی هیستیدین) و ژل فیلتراسیون (برای نوع طبیعی) خالص شدند. در ادمه تولید یوکاریوت هورمون رشد نوترکیب توسط یک کلون پایدار از سلول های cho ترانسفورم شده با وکتور pseqtaq انجام و با روش هایی مانند elisa، تولید آن اثبات گردید. سپس فعالیت زیستی هر دو نوع rhgh پروکاریوت و یوکاریوت به روش سیستم گزارشگر ژنی (سیستم گزارشگر lhre-tk-luc) بررسی شد. این سیستم شامل lhre (عامل اتصال یابنده به مولکول stat5) مشتق شده از پروموتور ژن بتاکازئین، پروموتور tk و ژن تحت کنترل آن، luc کدکننده برای آنزیم فایرفلای لوسیفراز می باشد و امکان بررسی و اندازه گیری انتقال پیام ایجاد شده توسط gh در سلول های ترانسفورم شده با ژن ghr را فراهم می کند. برای این منظور از سلول های hek293 ترانسفکت شده با گیرنده هورمون رشد استفاده شده و فرایند انتقال پیام درون سلولی القا شده توسط rhgh و در نتیجه آن بیان آنزیم لوسیفراز و به دنبال آن تولید نور توسط دستگاه لومینومتر اندازه‎گیری شد. نتایج حاصل از سیستم بررسی فعالیت زیستی نشان دادند که هر دونوع rhgh پروکاریوت و یوکاریوت به خوبی فرایند سیگنالینگ درون سلولی را القا می کنند اما در مقایسه با یکدیگر، نوع یوکاریوت دارای فعالیت زیستی بهتری می باشد.

بروسلوز یک بیماری باکتریایی مشترک بین انسان و دام (زئونوز) است، که دارای اهمیت فراوان جهانی می باشد. این بیماری طیف وسیعی از پستانداران شامل انسان، گاو، گوسفند، شتر، بز، خوک، جوندگان و پستانداران دریایی را درگیر می کند. بروسلوز هم از جنبه بهداشت عمومی و هم از لحاظ اقتصادی حائز اهمیت است. خسارات اقتصادی ناشی از بروسلا در گله الوده، علاوه بر حذف دام شامل مواردی چون کاهش تولید شیر و سقط جنین در حیوانات حساس می باشد. شتر یکی از گونه های حساس به بروسلوز است و بیماری در آن به شکل سقط جنین و به میزان کمتری تورم بیضه و عفونت غدد جنسی ضمیمه است. شتر به وسیله یکی از گونه های اصلی بروسلا یعنی بروسلا آبورتوس یا بروسلا ملی تنسیس آلوده می شود. اساس تشخیص بیماری در برنامه های مبارزه و ریشه کنی شامل آزمایشات سرم شناسی می باشد. اگرچه این آزمایشات آسان و سریع هستند، ولی دارای معایبی از جمله وجود واکنش های متقاطع سرمی، عدم وجود پادتن در آغاز بیماری و وجود آنتی بادی های ناقص و بلوکان می باشند. جداسازی و تشخیص باکتری توسط تکنیک های میکروبیولوژی مطمئن ترین روش و استاندارد طلائی تشخیصی بروسلوز می باشد، ولی این روش اکثراً موفقیت آمیز نبوده، دارای مشکلاتی از قبیل زمانبر بودن، لزوم مهارت بالای فرد آزمایش کننده، ریسک بالای آلودگی و... می باشد. در حالیکه در برنامه های مبارزه و ریشه کنی، مجهز شدن به ابزاری دقیق و کارآمد جهت تشخیص بیماری ضروری می باشد، زیرا یکی از اساسی ترین مراحل، شناسایی دقیق و سریع دام های رآکتور و حذف آنها از گله می باشد. در این تحقیق 310 نمونه خون از شترهای در حال ذبح کشتارگاه نجف آباد تهیه شد و روی تمامی آنها آزمایشات سرم شناسی صورت گرفت. dna از 100 نمونه خون و سرم، از جمله موارد مثبت در آزمایش رزبنگال (39 مورد) استخراج و روی تمامی آنها nested-pcr اختصاصی جنس، با بکارگیری دو جفت پرایمر داخلی و خارجی بر روی ژن s rrna16 انجام و طی دو مرحله قطعه bp958 تکثیر شد. 100 عقده لنفاوی نیز روی محیط انتخابی بروسلا آگار حاوی سرم غیرفعال شده اسب (5%) و مکمل آنتی بیوتیکی کشت و در گرمخانه 37 درجه حاوی 10-5 درصد دی اکسیدکربن به مدت 14 روز نگهداری شد. در این تحقیق آزمایشات سرم شناسی بروسلوز 94/1% (6مورد) نمونه ها را مثبت تشخیص داد، در حالیکه از هیچکدام از عقده های لنفاوی کشت داده شده، باکتری بروسلا جدا نشد. نتایج nested-pcr بترتیب 9/1 (6 مورد) و 9/2 (9 مورد) درصد را در سرم و خون مثبت ارزیابی کرد، که به ترتیب 1 و 3 مورد از این موارد را آزمایشات سرم شناسی منفی ارزیابی کرده بود. نتایج این تحقیق حساسیت بالاتر nested-pcr را نسبت به آزمایشات سرم شناسی نشان می دهد. هرچند آزمایشات سرم شناسی و مولکولی جایگزین مناسبی برای آزمایشات باکتریولوژی به شمار می آورد. همچنین این تحقیق تأکید می کند که با توجه به داخل سلولی بودن بروسلا، خون نسبت به سرم نمونه بهتری جهت انجام pcr می باشد. کلمات کلیدی: بروسلوز، شتر، سرم شناسی، باکتری شناسی، pcr

پروتئین سبز فلورسنت green fluorescent protein (gfp)، پروتئینی با وزن مولکولی kda 27 شامل 238 اسیدآمینه و دارای ساختار فضایی بشکه ی ? می باشد که برای اولین بار در سال 1962 از ستاره ی دریاییaequorea victoria جداسازی شد. این پروتئین به دنبال تحریک با نور آبی، فلورسنس سبز ساطع کرده و این ویژگی باعث شده تا gfp به عنوان نشانگر برای بیان پروتئین های نوترکیب، گزارشگر برای بیان ژن و به عنوان برچسب برای مشخص کردن جایگاه پروتئین ها در سلول های زنده استفاده شود.gfp به طور ژنتیکی با پروتئین های بسیاری در گونه های مختلف برای تولید مولکول های پایدار که هم فعالیت بیولوژیک اولیه ی خود و هم ویژگی های فلورسنت gfp را حفظ می کنند، ادغام شده است. egfp نوع جهش یافته ای از gfp است که دارای فلورسنسی 35 برابر شدیدتر نسبت به نوع وحشی می باشد. یکی از معمول ترین فرم های آنتی بادی نوترکیب، قطعه ی تک زنجیره ای ناحیه ی متغیر (scfv) می باشد. یک آنتی بادی در فرمت scfv شامل نواحی متغیر زنجیره های سبک و سنگین (vh) و (vl) می باشد که به وسیله ی یک توالی اتصال دهنده به یکدیگر متصل می شوند.scfv می تواند به آسانی در escherichia coli بیان شود. از مزایای scfv نسبت به آنتی بادی کامل نفوذ بهتر به بافت ها به دلیل اندازه ی کوچک تر و امکان پاک سازی سریع تر کمپلکس های ایمنی تشکیل شده می باشد. در مقایسه با آنتی بادی طبیعی scfv به گلیکوزیلاسیون نیاز ندارد و می تواند به طور فعال در باکتری که فاقد سیستم تغییرات پس ترجمه است، تولید شود. cd4گلیکوپروتئین غشایی با وزن مولکولی تقریبیkda 55 است که در سطح زیر گروه های خاصی از لنفوسیت هایt بروز می یابد. cd4 یک کمک گیرنده بوده که با گیرنده های سلول t همکاری می کند. علاوه بر این، cd4 گیرنده ای برای ویروس نقص ایمنی انسان (hiv) نیز می باشد. در پژوهش حاضر یک ساختار ژنتیکی برای تولید کارامد یک آنتی بادی فلورسنت به صورت یک پروتئین نوترکیب در e.coli با ادغام egfp به scfv آنتی بادی ضد cd4 طراحی و ساخته شد. ژن egfp پس از تکثیر به وسیله ی pcr و برش با آنزیم های محدود کننده ی خاص، در انتهای n مولکول scfv کلون شد. صحت کلونینگ با کلنی-pcr و هضم آنزیمی تأیید شد. سپس تعیین توالی به منظور اطمینان از عدم وقوع جهش در ساختار و نیز صحیح بودن قالب خواندن egfp-scfv انجام گرفت. در نهایت بیان فلوبادی بعد از ترانسفورم کردن e.coli hb2151 و القای پلاسمید با iptg به وسیله ی تکنیک dot blotting وwestern blotting با استفاده از آنتی بادی ضدegfp انجام شد.

صفات تولید مثــلی یکـی از مهمتـریـن پارامتــرهای تعیین کننده در صنعت پرورش گاو شیری میباشند. لذا توجه به مکانیسمهای تولید مثلی و شناخت هورمونهای تأثیرگذار امری مهم محسوب میشوند. فعالیت دستگاه تولید مثل نیازمند همکاری هورمونهای اولیه و ثانویه تولید مثلی میباشد. عوامل رشد و هورمونهای متابولیکی مثل انسولین و igf-i در تنظیم تخمدان تأثیر بسزایی دارند. انسولین و igf-i به عنوان میانجیگرهای مهم توسعه فولیکولی، استروئیدوژنز، بلوغ اووسیت و نهایتاً رشد و توسعه جنین عمل میکنند. هورمون انسولین علاوه بر بحث انتقال گلوکز به داخل سلول دارای نقش میتوژنیک میباشدکه در حیات و باروری تخمک بسیار مهم و حیاتی است. igf-i در افزایش حساسیت فولیکولها به گنادوتروپینها نقش داشته و باعث رشد فولیکول و به دنبال آن تخمک گذاری میشود. جدا از غلظت انسولین و igf خون، بیـان ژن گیرنده های igf وانسولین و تراکم آنها در سلولهای گرانولوزا در رشد و عملکرد فولیکولها و تولید استروئیدها موثر است. در سلولهای گرانولوزا و تکا بیان mrna گیرنده انسولین در طی مرحله پری آنترال به مرحله قبل از تخمک اندازی به طور قابل ملاحظه ای تغییر میکند. بیان گیرنده igf نیز به طور مشابه در سلولهای تکا وگرانولوزا در طی مراحل پایانی تکامل فولیکول افزایش یافته و با شروع آترزیا کاهش می یابد. بنا بر آنچه گفته شد مشاهده و تخمین تعداد گیرنده های igf و انسولین توسط روشهایی مانند ایمونوهیستوشیمی میتواند به درک بهتر از نقش این دو هورمون در تولید مثل کمک کند. در آزمایش حاضر، 30 عدد تخمدان گاو شیری از کشتارگاه های محلی در سطح استان اصفهان جمع آوری شده که 20 عدد از آنها مربوط به گاوهای نابارور و 10 عدد دیگـر متعلق به گاوهـای بارور در محدوده سنی 2 الی 7 سال بودند. تخمــدانها در فرمـالین 10% فیکس شده و سپس به منظور انجام رنگ آمیــزی h&e و ایمـونوهیستوشیـمی به روش envision ، از هر نمونه بلوکهای پارافینی مناسب تهیه گردید. رنگ آمیزی با استفاده از آنتی بادی منوکلونال خرگوش برای گیرنده igf-i و سوبسترای کروموژن انجام شد. آنتـی بـادی به کار رفته یک آنتی خرگوش منوکلونال محصول شرکت abcam® با کد شناسایی ab39675 بوده که در درجه اول با گیرنده igf-i و نیز با گیرنده انسولین و پروتئینهای مرتبط با گیرندهانسولین واکنش متقابل دارد. نتایج مطابق سیستم اسکوربندی هشت واحدی allred و براساس شدت و وسعت رنگ آمیزی تفسیر شدند. این نتایج نشان دهنده اختلاف معنی دار آماری هم به لحاظ شدت رنگ پذیری و هم از نظر وسعت رنگ پذیری بین میزان گیرنده ها در بافت تخمدان گاوهای بارور و نابارور بودند (0001/0> p ). وسعت رنگ آمیزی در سلولهای تکا به مراتب بیشتر از سلولهای گرانولوزا بود. شدت رنگ آمیزی در سلولهای استـروما خیلی ضعیف تر از سلولهای تکـا و گرانـولوزا بود. شدت رنگ آمیـزی از فولیکولهای پری آنترال تا آنترال تشدید شد. حضور گیرنده ها در سلولهای جسم زرد و رگها تأیید شد. میزان رنگ پذیری جسم سفید در حد صفر بود. در پایان میتوان نتیجه گرفت حضور گیرنده هورمونهای انسولین و igf-i در سلولهای تخمدان بیانگر تأثیر شرایط متابولیکی دام بر عملکرد تخمدان است؛ بنابراین میزان گیـرنده های موجود از این هورمونها در بافت تخمـدان و اطراف اووسیت یکی از شـاخصهای باروری و ناباروری به شمار می آید.

آنتی بادی ها یا ایمنوگلوبولین ها، گلیکوپروتئین هایی هستند که بطور اختصاصی مولکول های آنتی ژن را شناسایی می کنند. بعد از ابداع فناوری تولید آنتی بادی های تک دودمانی توسط kohler و milstein در سال ????، تهیه و جداسازی انواع مختلفی از آنتی بادی ها بدست آمد. سپس این مولکول های منحصر به فرد به آرامی به حیطه پزشکی وارد شد ولی استفاده از آن در درمان و تحقیقات به سرعت رو به افزایش گذاشت. یکی از کاربردهای آنتی بادی ها استفاده از آن ها در ردیابی آنتی ژن ها می باشد. به این منظور آنتی بادی ها را می توان با انواع مختلفی از مواد نشاندار متصل کرد و پس از اتصال آن ها به آنتی ژن موردنظر از آن ها عکسبرداری کرد. مواد نشاندار متعددی برای اتصال به آنتی بادی ها و نشاندار کردن آن ها وجود دارد که از جمله می توان از مواد رادیو اکتیو، فلوروکروم، کوانتوم دات ها و آنزیم های متعدد نام برد. در بین تمام مواد نشاندار استفاده از آنزیم ها با توجه به قابلیت دستورزی زیاد و افزایش بازدهی مورد توجه قرار گرفته است. آنزیم های متعددی برای نشاندار کردن آنتی بادی ها بکار می رود که از جمله می توان به آنزیم های لوسیفراز اشاره کرد. آنزیم های لوسیفراز آنزیم های نورافشانی هستند که در پدیده بیولومینسانس نقش دارند. با در اختیار گذاشتن سوبسترای اختصاصی آن ها، لوسیفرین، این آنزیم ها آن را اکسید کرده و تولید نور می کند. انواع متعددی از این آنزیم ها در طبیعت یافت شده است. یکی از معروف ترین آن ها که کاربرد وسیعی در عکسبرداری برداری زیستی دارد، آنزیم لوسیفراز بنفشه دریایی می باشدکه به عنوان گزارشگر درزمینه های متعددی مورد استفاده قرار گرفته است. هدف از این تحقیق طراحی و کلون-سازی توالی یک گزارشگر لوسیفرازی از لوسیفراز گونه renilla reniformis می باشد که بتواند به آنتی بادی متصل شود و در تشخیص سریع آنتی ژن ها بکار برده شود. توالی کدکننده پپتید متصل شونده به fc آنتی بادی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و روش pcr به توالی orf آنزیم لوسیفراز بنفشه دریایی متصل شد و به درون ناقل pet21a کلون شد. سپس ساختار حاصل به درون باکتری e.coli bl21 ترانسفورم شد و سپس بیان انجام گرفت. در نهایت فعالیت آنزیمی پروتئین بدست آمده سنجیده شد. نتایج بدست آمده نشان دهنده آنست که توالی bp???? کلون شده قادر به کد کردن گزارشگر ?? کیلودالتونی مبتنی بر لوسیفراز بنفشه دریایی می باشد و این گزارشگر تولید شده دارای فعالیت می باشد. انتظار می رود که این گزارشگر بتواند به آنتی بادی متصل شود و در تشخیص های اختصاصی مبتنی بر بیولومینسانس آنتی ژن ها بکار برده شود.

آنتی بادی های مونو کلونال که به وسیله تکنیک هیبریدوما و یا روش نوترکیبی ساخته می شوند؛ یکی از ابزار های مهم تشخیصی در پزشکی و زیست فناوری محسوب می شوند. این ترکیبات قدرت شناسایی بالایی دارند و به طور اختصاصی می توانند به جایگاه هدف خود متصل شوند. نانوذرات مغناطیسی حامل های مناسبی برای بیو مولکول هایی مانند پپتید ها, آنز یم ها و آنتی بادی ها. این ذرات سمیت پایینی دارند و می توانند تحت میدان خارجی از ترکیب جداسازی شوند. به منظور هدف گیری اختصاصی نانوذرات به سلول های هدف، سطح خارجی نانوذرات با استفاده از آنتی بادی ها پوشانده می شود. با اتصال آنتی بادی های مونوکلونال به نانو ذرات به طور کارامدی می توان سلول های مورد نظر را در جمعیت متفاوتی از سلول ها شناسایی کرد. در این پژوهش ابتدا نانو ذرات مغناطیسی آهن به روش همرسوبی سنتز شد. سپس برای اینکه نانوذرات مستعد اتصال کوالانسی با آنتی بادی شوند, سطح نانوذرات اصلاح گردید. برای این کار ابتدا آن ها را سیلیس دار نموده و در مرحله بعدی مولکول آمینو پروپیل بر سطح سیلیسی نشانده در پایان مولکول سیانوریک کلراید به آمینو پروپیل وصل شد. سیانوریک کلراید با داشتن سه اتم کلر قابل جانشینی می تواند با گروه آمینی آنتی بادی واکنش دهد و پیوند کوالانسی بین آنتی بادی و نانو ذره ایجاد می گردد. پس از اطمینان از اتصال آنتی بادی با نانو ذره با استفاده از روش های طیف سنجی و زیستی، میزان تثبیت آنتی بادی با استفاده از روش بردفورد و الایزا انجام شد. قدرت تشخیصی آنتی بادی پس از اتصال به نانو ذره با استفاده از آزمون های رنگ آمیزی، فلورسانس و آگلوتیناسیون بررسی شد. پس از انجام هر مرحله از سنتز و همچنین پس از اتصال آنتی بادی به نانوذره طیف مربوط به نانوذره برای تایید اتصال گروه های عاملی انجام گرفت که نتایج طیف سنجی نشان دهنده تایید اتصال صورت گرفته می باشد. تصاویر تهیه شده از کشت و اسمیر سلول های لنفوسیتی می تواند به روشنی حضور نانوذرات را در سطح آن ها نشان دهد. علاوه بر این نتایج حاصل از تست آگلوتیناسیون نشان دهنده فعال بودن آنتی بادی پس از اتصال به نانوذره است. در بخش آخر این پژوهش, از آنتی بادی منوکلونال ضد cd4 انسانی که به نانوذرات مغناطیسی متصل شد برای نشان دار کردن سلول های لنفوسیت t استفاده گردید. این سلول ها با داشتن گیرنده cd4 بر سطح خود توسط این نانوذرات فعال شده با آنتی بادی قابل شناسایی هستند. با اتصال آنتی بادی ضد مولکول cd4 انسان به نانو ذرات فلزی می توان این سلول ها را از سایر سلول های خونی با خلوص بالا جدا و سپس شمارش نمود و از این داده ها در تحقیقات مربوط به بیماری های سیستم ایمنی و خصوصأ ایدز استفاده کرد.

چکیده پروبیوتیک ها میکروارگانیسم های زنده ایی هستند که تأثیرات مفیدی روی سلامتی انسان و حیوان دارند. باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس، عضو مشخص شده ی باکتری های اسید لاکتیک می باشد که ویژگی های آن به طور کامل بررسی شده اند. این باکتری ارگانیسم مدل این گروه در نظر گرفته شده است. l. lactis برای تولید پروتئین های زیستی مفید و برای انتقال dna پلاسمیدی به سلولهای یوکاریوتی مناسب می باشد. اخیراً از l. lactisبه عنوان اولین ارگانیسم تغییر یافته ی ژنتیکی زنده برای درمان بیماری های انسانی استفاده شده است. هورمون رشد انسانی یا سوماتوتروپین یک پروتئین تک رشته دارای 191 اسید آمینه به صورت یک ساختار با 4 مارپیچ و دارای دو پل دی سولفیدی و وزن مولکولی حدود 22 کیلو دالتون می باشد. که توسط سلول های سوماتوتروف غده هیپوفیز ساخته شده و به جریان خون آزاد می شود. به علت فعالیت های بیولوژیکی مهم و متنوع هورمون رشد، این هورمون دارای کاربردهای گسترده ایی در پزشکی و بیوتکنولوژی می باشد. از آنجایی که فرم فعال هورمون رشد به صورت غیرگلیکوزیله است، سیستم های بیان پروکاریوتی برای بیان این نوع پروتئین ها ترجیح دارد. سیستم بیان ژن کنترل شده با نیسین یکی از موفق ترین و گسترده ترین ابزار استفاده شده برای تنظیم بیان ژن در باکتری های گرم مثبت می باشد. این سیستم بیان اطمینان می دهد که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک و آنتی بیوتیک در پروتئین به دست آمده حضور ندارند. هدف از این مطالعه تولید هورمون رشد انسانی به عنوان یک پروتئین دارویی در l. lactis می باشد. ژن هورمون رشد انسانی نوترکیب با روش pcr تکثیر و با آنزیم های ncoi و saciهضم شد و در وکتور pnz8149 کلون شد. سپس وکتور نوترکیب با روش الکتروپوریشن به داخل l. lactis nz3900 منتقل شد و کلنی های حاوی پلاسمید انتخاب شدند. غربالگری براساس توانایی رشد بر روی لاکتوز می باشد. حذف ژن lacf باعث عدم رشد این سویه بر روی لاکتوز می شود مگر اینکه این ژن از طریق پلاسمید فراهم شود. باکتری های ترانسفورم شده با pcr،آزمایش هضم و تعیین توالی dna شناسایی شدند. سلول های l. lactis nz3900 در محیط m17با 5/0% لاکتوز رشد داده شدند. القاء با ng/ml5 نیسین در تراکم سلولی یاod600 برابر با 4/0 انجام شد. بعد از 5 ساعت سلول ها از محیط جدا شدند و عصاره بدون سلول آماده شد. تولید پروتئین هورمون رشد انسانی نوترکیب با استفاده از روش های الایزا، دات بلات، sds-page و وسترن بلات تأیید شد. ژن هورمون رشد انسانی با موفقیت در وکتور pnz8149 کلون و به باکتری l. lactis nz3900 منتقل شد. پروتئین هورمون رشد به میزان ?g/ml 59/1 تولید شد.

چکیده هورمون رشد انسانی یا سوماتوتروپین یک پروتئین تک رشته دارای 191 اسید آمینه به صورت یک ساختار با 4 هلیکس و دارای 2 پل دی سولفیدی و وزن مولکولی حدود 22 کیلودالتون می باشد. که توسط سلول های سوماتوتروف غده هیپوفیز ساخته شده و به جریان خون آزاد می شود. به علت فعالیت های بیولوژیکی مهم و متنوع هورمون رشد، این هورمون دارای کاربردهای گسترده ایی در پزشکی و بیوتکنولوژی می باشد. هورمون رشد به عنوان یک داروی تجویزی در پزشکی برای درمان اختلال در رشد کودکان، کمبود هورمون رشد بزرگسالان ، سندرم ترنر، سندرم پرادر ویلی، نارسایی مزمن کلیه و سندرم روده کوتاه استفاده می شود. منبع اصلی هورمون رشد انسانی برای استفاده های انسانی هورمون رشد نوترکیب تولید شده توسط باکتری است. استفاده از بیان ژن نوترکیب برای تولید پروتئین های صنعتی از اواخر سال 1970 تبدیل به یک صنعت چند میلیاردی شده است. یکی از محبوب ترین ارگانیسم های تولید باکتری های گرم منفی اشرشیاکلی است که برای تولید در سطح بالا از هر دو پروتئین های پروکاریوتی و یوکاریوتی استفاده می شود. یکی از اهداف مهم بیان پروتئین تولید پروتئین با تاخوردگی صحیح در اشرشیاکلی است که اغلب به دلیل تجمع پروتئین در تجمعاتی به نام اینکلوژن بادی انجام نمی شود. در این مطالعه با به کار بردن فاکتورهای مختلف محیط کشت، سویه، درجه حرارت، زمان القاء و غلظت-های مختلف iptg سعی بر آن داشتیم که تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب به فرم محلول را افزایش دهیم. به همین منظور با نرم افزار تاگوچی 32 آزمایش با شرایط مختلف طراحی گردید.از طرفی برای انتخاب روشی مناسب برای استخراج پروتئین محلول از باکتری، سه روش اولتراسونیک، انجماد و ذوب آهسته و انجماد و ذوب سریع انجام شد که پس از بررسی جنبه های مختلف، روش انجماد وذوب آهسته انتخاب گردید. پس از انجام 32 آزمایش و استخراج پروتئین محلول، میزان پروتئین محلول تولید شده با الایزا dot blot, sds-page و western blotting سنجیده و با تاگوچی بررسی شد که نتایج حاصل نشان دهنده اثر معنی دار محیط کشت، سویه، درجه حرارت و زمان القاء بر تولید محلول هورمون رشد می باشد به نحوی که بهترین فاکتورها محیط کشت tb حاوی 3% اتانول، دمای oc25، سویه اوریگامی و زمان القاء 10 ساعت بوده است. کلمات کلیدی: هورمون رشد انسانی، پروتئین محلول، نرم افزار تاگوچی

پادتن ها ابزارهای قدرتمندی برای مطالعه ی عملکرد، مکان یابی و میان کنش پروتئین ها هستند. هم چنین این مولکول ها به طور گسترده برای اهداف تشخیصی و درمانی نیز به کار می روند. پادتن ها معمولاً برای اهداف تحقیقاتی و تشخیصی با مولکول های فلورسنت نشان دار می گردند. اگر مولکول فلورسنت مورد نظر یک پروتئین نوترکیب باشد در این حالت مولکول حاصل فلوبادی نامیده می شود. در این پژوهش، ابتدا قطعه ی تک زنجیره ای ناحیه ی متغیر پادتن ضد گیرنده ی cd4 انسانی که به پروتئین فلورسنت سبز متصل شده است، توسط دو آنزیم ecor? و nco? از ناقل pab1 استخراج گردید. سپس قطعه ی مورد نظر به منظور یافتن ناقل بیانی مناسب، در ناقل های pet26b و pcantab5e همسانه سازی شد و ناقل های نوترکیب ایجاد شده به منظور یافتن سویه بیانی مناسب در چندین سویه از باکتری اشرشیا کلی ترانسفورم گردیدند. ورود قطعه ی مذکور به داخل هر دو ناقل به وسیله ی واکنش کلنی-pcr و هضم آنزیمی دوگانه تأیید شد. سپس بیان اولیه ی فلوبادی با روش فلوسیتومتری بررسی گردید و بر اساس نتایج به دست آمده باکتری اشرشیا کلی سویه ی bl21 حاوی ناقل pet26b نوترکیب برای بهینه سازی تولید فلوبادی انتخاب شد. هم چنین بیان فلوبادی مذکور توسط تکنیک های sds-page، وسترن بلات، دات بلات و الیزا تأیید شد. به منظور بهینه سازی تولید فلوبادی 6 پارامتر شامل دما در سطوح 14، 18، 24 و ?c30 ، زمان های پس از القا در سطوح 6، 12، 18 و 24 ساعت، غلظت iptg در سطوح 0، 75/0، 1 و mm5/1، محیط کشت های lb و tb، درصد های مختلف اتانول و گلیسرول انتخاب شد. برای طراحی آزمایش های بهینه سازی از روش تاگوچی استفاده شد. میزان بیان فلوبادی در هر آزمایش به صورت سه بار تکرار و با روش فلوسیتومتری اندازه گیری شد. نتایج نشان داد که. غلظت mm1 iptg، دمای ?c18 و زمان پس از القای 18 ساعت بیشترین تاثیر را در تولید فلوبادی داشته اند. سپس فلوبادی حاصل با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل خاص سازی شد. هم چنین در این پژوهش تولید پروتئین egfp نیز بهینه سازی شد، که بر اساس نتایج به دست آمده دمای ?c30، غلظت mm5/0 از iptg و محیط کشت lb بیشترین تاثیر را در تولید پروتئین egfp داشتند. کلمات کلیدی: فلوبادی، بهینه سازی، اشرشیا کلی، ناقل

هورمون رشد انسانی (hgh) یک زنجیره پلی پپتیدی منفرد شامل 191 اسیدآمینه است و توسط سلول های سوماتوتروف غده هیپوفیز تولید و ترشح می شود. سلول های پستانداران در مقایسه با سایر میزبان ها از جمله باکتری ها، به خاطر توانایی شان در ایجاد ساختار صحیح پروتئین، تجمع و اصلاحات پس از ترجمه ای، سیستم مطلوب برای تولید پروتئین های نوترکیب با کاربردهای کلینیکی هستند. امروزه با وجود در دسترس بودن رده های سلولی فراوان، نزدیک به 70% پروتئین های نوترکیب درمانی در سلول های تخمدان همستر چینی (cho) تولید می شوند. با این وجود، میزان تولید در سلول های پستانداران در مقایسه با میزبان های پروکاریوتی پایین است. افزایش تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در سلول های cho برای توسعه یک فرایند زیستی کارامد در مقیاس وسیع ضرور ی است. در محیط های مرسوم کشت سلول های پستانداران از سرم به عنوان مکمل استفاده می شود؛ با این وجود استفاده از سرم نگرانی هایی از قبیل هزینه بالا، مداخله در خالص سازی محصولات نوترکیب و امکان آلودگی های ویروسی را در پی دارد. بنابراین استفاده از محیط فاقد سرم مزایای زیادی برای محصولات ترشحی از قبیل هورمون رشد دارد. سنجش گزارشگر ژنی مثل سیستم گزارشگر لوسیفراز به طور وسیعی برای مطالعه ی بیان و تنظیم ژن های یوکاریوتی به کار می رود. اگرچه ژن های گزارشگر کاربردهای زیادی دارند اما اغلب به عنوان شاخص فعالیت رونویسی در سلول ها بکار می روند، بنابراین سیستم -های گزارشگر برای تعیین فعالیت زیستی مولکول ها از قبیل هورمون رشد کاربرد دارند. در مطالعه ی حاضر، ابتدا rhgh در سلول-های یوکاریوتی cho در محیط حاوی سرم تولید شد و تولید rhgh توسط الایزا، دات بلات و وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفت. سلول های cho تولید کننده rhgh برای رشد در محیط فاقد سرم با استفاده از روش های سازگاری مستقیم و تدریجی تطابق پیدا کردند. سپس، تأثیر تیمارهای مختلف شامل غلظت های مختلف گلیسرول، دی متیل سولفوکساید (dmso)، سدیم بوتیرات (nabu)، سولفات روی (znso4) و تأثیر دما در تولید rhgh در سلول های cho مورد بررسی قرار گرفتند و تولید gh توسط تکنیک الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت. در نهایت فعالیت زیستی rhgh با استفاده از ترانسفکشن همزمان سیستم ژن گزارشگر lhre-tk-luciferase با وکتور حاوی cdna رسپتور gh انسانی در سلول های hek-293 مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مطالعه تولید rhgh در سلول های cho از طریق کنترل شرایط کشت افزایش پیدا کرد. سلول های cho در محیط فاقد سرم رشد کردند و rhgh در این محیط تولید شد. در ادامه سلول های cho توانایی رشد به حالت سوسپانسیون به جای کشت چسبنده را یافتند. تولید rhgh در سلول های cho در حالت سوسپانسیون با تولید در محیط های کامل حاوی سرم قابل مقایسه است. نتایج بیواسی نشان داد rhgh تولید شده توسط سلول های cho قادر است مسیر سیگنالینگ سلولی هورموی رشد را القا کند و فعالیت زیستی بالاتری نسبت به gh پروکاریوت و مشابه نمونه تجاری gh است. این یافته ها نشان دادند که کنترل شرایط کشت سلولی از قبیل اضافه کردن ترکیبات شیمیایی و کنترل دما به توسعه یک فرایند صنعتی و در مقیاس وسیع به تولید rhgh کمک می کند. همچنین کشت سوسپانسیون سلول های cho در محیط فاقد سرم را می توان با موفقیت بدست آورد که این امر تأثیر مهمی بر فرایندهای خالص سازی دارد. rhgh در رده سلولی پستانداران با فعالیت زیستی بالا می تواند تولید شود. سیستم گزارشگر ژنی یک روش بسیار حساس، کارا، دقیق و ایمن برای بررسی فعالیت زیستی پروتئین های نوترکیب مثل rhgh می باشد.

باکتری کلستریدیوم دیفیسیل عامل ایجاد عفونت بیمارستانی و کولیت کاذب است که در حال گسترش بوده و در آمریکا و اتحادیه اروپا سالانه بالغ بر هفت میلیارد دلار هزینه در بر دارد. تاکنون واکسن اثبات شده-ای برای جلوگیری از اثر این باکتری معرفی نشده است. با توجه به نقش توکسین¬ها در بیماری¬زایی این باکتری اطلاعات زیادی در زمینه توکسین¬هایی که توسط این باکتری تولید می¬شود حاصل شده است. دو توکسین اصلی tcda و tcdb از زمانیکه به عنوان عامل اصلی حدت کلستریدیوم دیفیسیل مورد شناسایی قرار گرفتند مورد مطالعه گسترده¬ای قرار گرفتند. بیماری¬های مرتبط با باکتری کلستریدیوم دیفیسیل زمانی رخ می دهد که فلور طبیعی روده دچار دگرگونی شده و به باکتری کلستریدیوم دیفیسیل اجازه رشد و نمو در روده داده شود. که در ادامه باکتری توکسین تولید کرده و باعث ایجاد اسهال آبکی می¬شود. مصرف بی¬رویه آنتی¬بیوتیک-ها نظیر پنی¬سیلین (آمپی¬سیلین)، کلیندامایسین و سفالوسپورین¬ها ممکن است که باعث بهم خوردن باکتری¬های طبیعی روده شده و خطر تکوین اسهال ناشی از کلستریدیوم دیفیسیل را افزایش دهد. پروبیوتیک¬ها میکروارگانیسم¬های زنده¬ای هستند که تأثیرات مفیدی روی سلامتی انسان و حیوان دارند. باکتری لاکتوکوکوس لاکتیس، عضو شاخص باکتری¬های اسید لاکتیک می¬باشد که ویژگی¬های آن به طور کامل بررسی شده¬ است. l. lactis برای تولید پروتئین¬های زیستی مفید و برای انتقال dna پلاسمیدی به سلول-های یوکاریوتی مناسب می¬باشد. اخیراً l. lactisبه عنوان اولین ارگانیسم تغییر یافته¬ی ژنتیکی زنده برای درمان بیماری¬های انسانی استفاده شده است. توکسین b از طریق ناحیه اتصالی پذیرنده (rbd) به گیرنده خود در روده متصل می¬شود و این ناحیه قسمت ایمنی¬زای توکسین شناخته می¬شود ولی در عین حال قسمت بیماری¬زای آن محسوب نمی¬شود. به همین منظور در این تحقیق سعی بر کلون کردن این قسمت از توکسین(rbd) در باکتری l. lactis شد تا از این باکتری پروبیوتیک بتوان برای تولید این قطعه بهره گرفت. با کلون کردن و بیان این قطعه (rbd) می¬توان استفاده از باکتری را به عنوان یک واکسن خوراکی مورد بررسی قرار داد. برای کلون کردن این قطعه ابتدا با استخراج dna از باکتری کلستریدیوم دیفیسیل و با پرایمرهای طراحی شده، قطعه rbdبا استفاده از pcr تکثیر شد. در ادامه این قطعه تکثیر شده توسط کیت استخراج dna از ژل استخراج شد. سپس در پلاسمید ptz57r/t الحاق شده و در باکتری e.coli توسط شوک حرارتی ترانسفورم شد. با استخراج پلاسمید ptz57r/t حاوی قطعه از باکتری، با برش آنزیمی توسط آنزیم¬های ncoi و saci قطعه rbd از پلاسمید خارج شده و توسط کیت استخراج dna از ژل قطعه خالص سازی شد. قطعه خارج شده در مجاورت پلاسمید pnz8149 که با آنزیم¬های مشابه برش خورده تحت شرایط مناسب جهت الحاق قرار داده شد. بعد از عمل الحاق، پلاسمید حاوی قطعه با روش الکتروپوریشن وارد سلولهای مستعد از پیش آماده شده l. lactisشد. در ادامه این باکتری¬های الکتروپوریشن شده در محیط مغذی رشد داده شد. باکتری از روی محیط الیکر با توجه به تولید رنگ زرد که شاخصه وجود پلاسمید است غربالگری شد و در مرحله بعد پس از استخراج پلاسمید، با انجام هضم آنزیمی، pcr و تعیین توالی صحت کلونینگ تایید شد.