بیماری پارکینسون دومین بیماری شایع در بین بیماری های زوال نورونی در اکثرکشورهای جهان است که حدود 1% جمعیت بالای 65 سال را گرفتار می کند. دلیل اصلی به وجود آمدن این بیماری تخریب پیش رونده نورون های دوپامین ساز در ناحیه substantia nigra pars compacta (snpc) در مغز میانی می باشد زیرا این سلول ها دوپامین می سازند و دوپامین یک نوروترانسمیتر شیمیایی است که سیگنال ها را به ناحیه striatumو سپس به نواحی دیگر مغز منتقل می کند و وظیفه آن کنترل حرکات و تعادل بدن است. بنابراین علایم این بیماری شامل ارتعاش دست و پا در حالت استراحت، آرام شدن حرکت، سختی حرکت ( خشک شدن) دست و پا یا بدن و تعادل ضعیف میباشد. همه درمان های دارویی که درحال حاضر برای این بیماری استفاده می شوند بعد از مصرف طولانی مدت اثرات جانبی شدیدی ایجاد می کنند. از طرفی هیچ کدام درمان قطعی بیماری نیستند و فقط علایم بیماری را برای مدتی بهبود می بخشند. یک راه برای درمان این بیماری استفاده از فاکتورهای نوروتروفیک برای جلوگیری از زوال نورون هاست. فاکتورهای نوروتروفیک برای بقای نورونی و تمایز و همچنین برای حفظ عملکرد معمول نورونی دربزرگسالان ضروری هستند. فاکتور رشد نوروتروفیک مشتق شده از گلیا (gdnf) یکی از فاکتورهای مهم حفاظت نورونی برای نورون های دوپامین ساز در ناحیه nigralمی باشد که اثرات حفاظت نورونی دارد. بنابراین یک فاکتور بقای محتمل برای نورون های دوپامین ساز آسیب دیده محسوب می شود . در این پایان نامه لنتی ویروس های نوترکیب را طراحی کرده ایم که cdna مربوط به ژن gdnf را همراه با یک ژن گزارشگر را باخود حمل می کنند. سپس این لنتی ویروس ها را به سلول های آستروسیت انسانی رده 1321n1 منتقل کردیم و بیان ژن هدف را بدست آوردیم. سپس اثرات حفاظتی محیط حاصل از این آستروسیت ها که حاوی پروتئینgdnf است را بر روی نورون ها مشاهده نمودیم.

بیماری هموفیلی b، بصورت مغلوب وابسته به جنس به ارث می رسد و فراوانی آن در جمعیت مردان 30000/1 می باشد. فقدان و یا نقص در عملکرد پروتئین فاکتور9 در پلاسما منجر به این بیماری می گردد. سلولهای کبدی به عنوان جایگاه اصلی تولید فاکتور 9 انعقادی، میزبان مناسبی جهت بررسی بیان فاکتور 9 قلمداد می شوند. جهت بیان اختصاصی در سلولهای کبدی، به توالی های تنظیمی اختصاصی کبدی نیاز است. در این ارتباط تلفیقی از توالی افزاینده آلدولاز b کبدی رت با پروموتر اختصاصی کبدی آلفا-1 آنتی تریپسین و با پروموتر cmv جهت ساخت پلاسمیدهای غیر ویروسی به منظور بیان فاکتور 9 در سلولهای کبدی انجام پذیرفت. سپس کارائی پلاسمیدهای ساخته شده در سلولهای مقاوم hepg2 توسط آزمون الایزا بر روی محیط کشت و درون سلولهای نوترکیب و آزمون نیمه کمی rt-pcr بررسی گردید. توالی افزاینده آلدولازb ، عملکرد هر دو پروموتر اختصاصی کبدی و غیر اختصاصی را به ترتیب 8 و 3 برابر بهبود بخشید. بالاترین بیان فاکتور 9 از تلفیق توالی افزاینده آلدولاز b با پروموتر ویروسی cmv حاصل گردید که بالاترین تجمع فاکتور9 در درون سلول نیز از این سازه ژنی بدست آمد. بنابراین، توالی افزاینده آلدولاز کبدی به عنوان یک توالی تنظیمی سیس مناسب جهت بیان پروتئین های مختلف در هپاتوسیتها پیشنهاد می گردد. با توجه به نقش و عملکرد اینترون ها در مراحل پس از رونویسی، در نسل دوم پلاسمیدهای نوترکیب، اینترون های 1، 2 بتا گلوبین انسانی بطور جداگانه و بطور همزمان در موقعیت مشابه در cdna فاکتور9 قرار داده شدند. همچنین، جهت افزایش کارائی ترجمه، توالی کوزاک قبل از شروع کدون ترجمه در سازه های ژنی ساخته شده قرار داده شد. استفاده از اینترون های بتا گلوبین در cdna فاکتور9 بیان این پروتئین را کاهش داد. این کاهش بیان را می توان با احتمال، به اسپلایسینگ نادرست اینترون های بتا گلوبین در cdna فاکتور9 نسبت داد.

چکیده: رسپتور her2 از خانواده تیزوزین کیناز ها می باشد که بیان بیش از حد آن در ایجاد سرطان های مختلف از جمله سرطان سینه ، پروستات ، کلون و تخمدان نقش مهمی دارد.هرسپتین اولین آنتی بادی مونوکلونال مورد تایید برای درمان سرطان سینه بدخیم +her2 است.به منظور تولید این آنتی بادی مونوکلونال ژن آن با استفاده از توالی پروتئینی آن در genebank سفارش وسنتز شد. برای اطمینان از تولید پروتئین با folding صحیح سلول های هدف با توجه به humanized بودن این آنتی بادی سلول های یوکاریوتی رده ی hek 293t انتخاب شدند. ژن زنجیره سبک و سنگین را در بدنه لنتی ویروسی به همراه توالی ires کلون کردیم. به منظور تولید ویروس نوترکیب، وکتور حامل به همراه وکتور های packaging و envelope با روش کلسیم - فسفات ترانسفکت شدند و پس از 48 ساعت محیط کشت این سلول ها تغلیظ و پس از تست تولید هر دو زنجیره باتکنیک rt-pcr سلول های hek 293t را با لنتی ویروس های تغلیظ شده infect کردیم.پس از 72 ساعت تولید هر دوزنجیره دوباره با rt-pcr تست شد.از آنجایی که هرسپتین ترشحی است ، پروتئین های محیط کشت سلول های infect شده را با tca رسوب داده وبیان را با تکنیک sds-page سنجیدیم .با توجه به نتیجه مثبت ، تاخوردگی و اتصال آن را به گیرنده her2 در سطح رده های سلولیmcf-7 وskbr3 با تکنیک ایمونوسیتوشیمی بررسی و نور فلورسنت را در هر دو رده مشاهده نمودیم. mtt assayنیز عملکرد صحیح این پروتئین را در جهت توقف رشد رده ی mcf-7و مرگ سلولی رده ی skbr3 نشان داد.

امروزه، پیوند کبد تنها راه درمان اختلالات و بیماری های حاد و مزمن کبدی در مراحل پیشرفته آنست. با توجه به مشکلات متعدد موجود در مسیر عمل پیوند و با توجه به پتانسیل بالای سلول های بنیادی به عنوان منبع مناسب سلولی قابل پیوند در پزشکی ترمیمی، پژوهشگران به یافتن راهکار های نوین جهت استفاده از این سلول ها در درمان بیماری های کبدی پرداخته اند. از آنجایی که کاربرد بالینی سلول های بنیادی جنینی با وجود قدرت تزاید و تمایز به لحاظ وجود مشکلات ومحدودیت های اخلاقی پیشرفت چندانی نداشته است، در این پروژه امکان استفاده از سلول های بنیادی بالغ مورد توجه قرار گرفت. کلیه روش های مربوط به مرحله اول این تحقیق از جمله جداسازی، کشت، تعیین هویت و تمایز سلول های بنیادی مزانشیم (mesenchymal stem cells) (msc) به سلول های شبه کبدی ابتدا با استفاده از سلول های msc مغز استخوان موش بزرگ آزمایشگاهی راه اندازی و پس از کسب نظر موافق کمیته اخلاق و اهداکنندگان، به نمونه انسانی تعمیم داده شد. روش های مختلف جداسازی سلول ها، بررسی استفاده از محیط های کشت با میزان قند و سرم مختلف و تغییر زمان اولین تعویض از جمله فاکتورهایی بود که در رابطه با بهینه سازی شرایط جداسازی، کشت وتکثیر سلول هایmsc مد نظر قرار گرفت. تعیین هویت سلول های msc با استفاده از آنالیز مارکر های سطحی توسط فلوسیتومتری و بررسی توان تمایزی این سلول ها به سلول های رده استخوانی و سلول های بافت چربی صورت گرفت. القاء تمایز به سلول های کبدی با استفاده از یک پروتکل جدید دو مرحله ای و در سه گروه سلولی انجام شد. با توجه به این که علی رغم نقش مهم فاکتور رشد انسولین (igf-i)، مطالعه مدونی در ارتباط با تاثیر این فاکتور در تمایز سلول های بنیادی به سلول های شبه کبدی گزارش نشده بود، با هدف بررسی و بهبود کشت و تمایز سلول های بنیادی مغز استخوان انسانی به سلول های شبه کبدی از این فاکتور بعنوان یکی از عوامل ضروری القاء تمایز کبدی استفاده کردیم. نتایج حاصل از آزمایشات مختلف در گروه های تحت بررسی نشان داد که درگروه های تحت تیمار با فاکتور igf-i در مقایسه باگروه فاقد این فاکتور از نظر مورفولوژیک و عملکرد (ترشح آلبومین) بطور معنی داری بهبود یافته است (0.05 p?). یافته های حاصل ازمطالعات ایمونوسیتوشیمی و رنگ آمیزی های اختصاصی حاکی از بیان مارکرهای اختصاصی کبدی مانند آلبومین، آلفافیتوپروتئین و ذخیره گلیکوژن در سیتوپلاسم این سلولها بود. ترشح اوره از سلولهای تحت تیمار با فاکتور igf-i نسبت به سلولهای تمایز یافته در محیط فاقد igf-i بیشتر بوده است و در مقایسه با نمونه کنترل افزایش معنی دار نشان داد (p< 0.001) . ضمنا از آنجا که ژن sox17 از دسته فاکتورهای نسخه برداری کلیدی در مراحل تکوین کبد جنین، تشکیل اندودرم، و تمایز سلول های پیش ساز به سلول های کبدی است، در این طرح به مطالعه مولکولی و امکان تهیه و کلون سازی این ژن و دست ورزی ژنتیکی آن به منظور بیان در وکتور های لنتی ویروس نیز پرداختیم. در این مطالعه ضمن تلاش در بهبود بخشیدن روش های موجود در جداسازی و کشت سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان انسانی، برای اولین بار با استفاده از فاکتورigf-i به عنوان یکی از فاکتور های تکمیل کننده محیط تمایزی کبدی به نتایج بهتری از نظر مورفولوژی و عملکرد سلول های تمایز یافته رسیدیم. نهایتا وکتور لنتی ویروس بیانگر ژن sox17 تهیه شد که از فاکتور های مهم رونویسی در تمایز کبدی گزارش شده است.

امروزه توجه خاصی به تولید پروتئین های نوترکیب از تریق ایجاد حیوانات تراریخته برای مصارف پزشکی و درمانی می شود. در سیستم های یوکاریوتی به دلیل تولید محصول بسیار مشابه با محصول طبیعی مورد توجه محققان قرار گرفته است. اما پیچیدگی ساختار سلولی در یوکاریوت ها، دستکاری و انتقال ژن در آن را دشوارتر می کند. امروزه پرنده ها به عنوان بیوراکتورهای تولید کننده پروتئین های دارویی مورد توجه خاص محققان قرار گرفته اند، چرا که پرنده ها دارای فاصله نسلی کوتاهتری بوده و تولید طیور تراریخته سریع تر و ارزانتر انجام می پذیرد. همچنین امکان تولید مقدار بیشتری از پروتئین نوترکیب با هزینه کمتر وجود دارد. نکته قابل توجه دیگر، شباهت زیاد سیستم های گلیکولیزاسیون انسان و طیور می باشد.اما به دلیل سیستم تولید مثلی متفاوت در پرندگان یکی از ابزارهای موثر و پرکاربرد برای تولید پرندگان ترانسژن، وکتورهای ویروسی می باشند. وکتورهای ویروسی به دلیل توانایی بالای آنها در الحاق ژن به ژنوم سلول های میزبان مورد توجه دانشمندان بوده. در بین وکتورهای ویروسی، سیستم های لنتی ویروسی یکی از قوی ترین و پرکاربردترین وکتورها می باشند. در این مطالعه، ژن گزارشگر gfp از روی وکتور ناقل برداشته شد و در وکتور بیانی لنتی ویروسی کلون گردید و بعد از تولید ویروس نوترکیب ناقل ژن هدف، کشت سلول های کبدی جوجه با ویروس نوترکیب آلوده شد و بعد 48 ساعت بیان ژن گزارشگر در کشت سلول های کبدی جوجه در زیر میکروسکوپ فلوروسنت مشاهده شد. همچنین، در این تحقیق بیان کنترل شده ژن گزارشگر gfp با استفاده از سیستم های القایی لنتی ویروسی مورد ارزیابی قرار گرفت. این تحقیق می تواند گام مقدماتی در راستای تولید پرنده های ترانس ژن با استفاده از وکتور های ویروسی محسوب گردد و ادامه این تحقیقات و تکرار آن در رده سلول های پایه ای جوجه و در نهایت تیمار بلاستودروم و جنین جوجه با ویروس های نوترکیب می تواند نتایج خوبی را برای رسیدن به هدف تولید پرنده های تراریخته به ارمغان آورد.

ژن درمانی با استفاده از روش هدف گیری ژنی (gene targeting) یکی از بهترین روشهای درمان نقائص ژنتیکی نظیر بتا تالاسمی می باشد. بیماری بتا تالاسمی در اثر کاهش یا فقدان سنتز زنجیره بتا گلوبین به وجود می آید. یکی از روشهای درمان موثر برای این بیماری ژن درمانی توسط حامل های لنتی ویروسی می باشد. ظرفیت حامل های لنتی ویروس حدود 10 کیلو باز است. هدف از این تحقیق طراحی و ساخت حامل لنتی ویروس های نوترکیب فاقد عملکرد اینتگراز و حاوی سازه ژنی مناسب برای هدف گیری ژن بتا گلوبین با روش نوترکیبی همسان به منظور ژن درمانی بتا تالاسمی می باشد. آغازگرهای اختصاصی جهت تکثیر قطعات ژنی tk, ushbg, hyg, hbg, neo و dshbg با نرم افزار gene runner طراحی شد. پس از تکثیر قطعات با pcr و برش آنزیمی، این قطعات با استفاده از روش های کلونینگ در حامل های ptz57rt، plgt و plenti-dest به ترتیب کلون و کلون مجدد شدند. صحت کلونینگ قطعات فوق الذکر با استفاده از روش های تائیدی برش آنزیمی و pcr بررسی شد. با روش جهش زائی هدفمند و بهره گیری از روش overlap extension pcr جهشی در ناحیه کاتالیتیک ژن اینتگراز (d64v) ایجاد کرده و جایگزین قطعه طبیعی در پلاسمید plp1 شد. طی انتقال همزمان پلاسمید نهائی به همراه سه پلاسمید کمکی plp1 (طبیعی و نوترکیب)، plp2 و plp/vsv-g با لیپوفکتامین 2000 به درون رده سلولی 293t، لنتی ویروسهای نوترکیب حاوی سازه ژنی مورد نظر تولید شد. تیتر ویروسهای نوترکیب (اینتگراز جهش یافته) در رده سلولی cos-7 با استفاده از real-time pcr بدست آمد. تیتر لنتی ویروسهای اینتگراز جهش یافته پائین تر از اینتگراز طبیعی بود. سلولهای cos-7 با ویروس نوترکیب تراریخت شده و پس از سه هفته غربال آنتی بیوتیکی (هیگرومایسین b، g-418 و گان سیکلوویر) سلولهای cos-7 تراریخت باقی ماندند. dna کلونی های باقی مانده استخراج و با روش pcr انجام نوترکیبی همسان تائید شد. لنتی ویروسها یکی از مناسبترین سیستم ها برای انتقال سازه ژنی به سلولهای هدف در حال تقسیم و فاقد تقسیم مانند سلولهای بنیادی با هدف ژن درمانی بیماریهای خونی نظیر بتا تالاسمی می باشند. استفاده از حامل های لنتی ویروس دارای نقص در عملکرد اینتگراز همراه با نوترکیبی همسان معایب کارائی پائین هدف گیری ژنی و دخول تصادفی ژنوم لنتی ویروس در ژنوم میزبان را برطرف می کند.

ماهیان خاویاری به دلیل توانایی آنها در تولید خاویار (مروارید سیاه) از اهمیت ویژه ای در صنعت شیلات و آبزی پروری برخوردارند و از جمله با ارزش ترین ذخایر شیلاتی دریای خزر محسوب می شوند. در این مطالعه توالی کامل ژن کد کننده هورمون رشد (gh) فیل ماهی استروژن huso huso بعنوان یکی از مهمترین گونه های ماهیان خاویاری ایران، که با استفاده از rna استخراج شده از غده هیپوفیز سنتز شده بود، در یک وکتور غیر ویروسی (پلاسمید کلونینگ) ptz57r/t کلون گردید. سپس بر اساس سایتهای آنزیمی مشخص، این قطعه ژنی از این وکتور برش داده شده و به بدنه سازه لنتی ویروسیpnl-egfp/cmv-wpre پیوند زده شد. این سازه قادر به تولید تیترهای بالایی از ویروسهای نوترکیب بالغ و فعال حامل ژنgh فیل ماهی بوده و می تواند به نحوی بسیار کارآمد رده سلولهای جنینی انسانی hek-293t را آلوده ساخته، ژن هورمون رشد را به این سلولها منتقل کرده و منجر به بیان پروتئین در آنها گردد. در ساختار این وکتور ژن نشانگر egfp، بواسطه قطعه ires در فرودست ژن gh قرار داده شده است، لذا بیان ژن را در مراحل ترانسفکشن و ترانسدوکشن بسهولت می توان پیگیری نمود. به منظور انتقال ژن، سلولهای جنینی انسانی hek-293t با بهره گیری از ناقل ترانسفر لنتی ویروسی حامل ژنgh و ناقلین بسته بندی و غشایی ویروسی، به روش کمپلکس dna- لیپوفکتامین ترانسفکت شدند. 48 ساعت بعد سوپرناتانت ویروسی را با ستونهای پروتئینی amicon تغلیظ کرده تا استوک غلیظی از ویروسهای نوترکیب بدست آید. در حدود (یک پنجم کل استوک) به کشت جدیدی از سلولهای hek-293t اضافه شد و در حدود هفتاد دو ساعت بعد، بیان ژن egfp در نور فلورسنت پدیدار گشت. سپس سلولها برای آنالیزهای بعدی جمع آوری شدند. در مراحل بعدی rna این سلولها را استخراج کرده و با تکنیک rt-pcr، بیان ژن gh در آنها به اثبات رسید. نتایج این تحقیق می تواند از دیدگاه مولکولی در جداسازی و انتقال ژن به دیگر گونه های ماهیان خاویاری و افزایش رشد و تولید خاویار و نهایتاً تولید ماهیان ترنس ژنیک، نقش بسیار موثری داشته باشد.

بیماری پارکینسون دومین بیماری شایع در بین بیماریهای زوال نورونی در انسان است که حدود 1% جمعیت بالای 65 سال را گرفتار می کند که دلیل اصلی به وجود آمدن این بیماری تخریب پیشرونده نورونهای دوپامینساز در ناحیه substantia nigra pars compacta (snpc) در مغز میانی می باشد. به دلیل عوارض جانبی شدیدی که درمانهای دارویی مرسوم در طولانی مدت ایجاد می کنند و همچنین عدم قطعیت درمان این بیماری توسط این روشها، تحقیقات تمرکز نسبتا بالایی بر روی درمانهای مطمئنتر مانند پیوند نورونهای دوپامینرژیک پیدا کردهاند. این در حالی است که پیوند نورونهای دوپامینرژیک می تواند به میزان نسبتا بالایی موجب بهبود نشانههای کلینیکی بیماری پارکینسون شود. تولید نامحدود و با بازده بالا یکی از اهدافی است که برای درمان این بیماری مورد بررسی قرار می گیرد. هدف از انجام این پایان نامه تمایز نورونی سلولهای پرتوان nt2 می باشد. برای رسیدن به این هدف ابتدا بر اساس سازه های plv-pitx3 و plv-gdnf ویروسهای نو ترکیب ساخته شد. پس از آن استوک های غلیظی از این ویروسها ساخته شد و برای ترانسدوکسیون سلولهای هدف به کار برده شد: ویروس plv-pitx3 برای آلوده ساختن سلولهای nt2 و ویروس plv-gdnf برای آلوده ساختن سلولهای آستروسیت رده 1321n1 مورد استفاده قرار گرفت. به دنبال این کارافزایش بیان ژنهای هدف در سلولهای مزبور با روش rt-pcr به اثبات رسید. سپس مراحل تمایز سلولهای nt2 به ترتیب زیر انجام گرفت: ابتدا با کشت این سلولها در محیط حاوی اسید رتینوییک و سرم جایگزین (sr) اجسام شبه جنینی (embroid like bodies) ساخته شد. پس از آن این اجسام به صورت تک سلول درآمده در محیط حاوی رتینوییک اسید و محیط مشروط سلولهای آستروسیت آلوده به ویروس gdnf و در غیاب fbs کشت داده شدند. پس از 4 تا 6 روز که سلولها فرصت تمایز بدست آوردند، بیان ژنهای هدف توسط آزمایشات rt-pcr و یا ایمونوسیتوشیمی مورد بررسی قرار گرفت تا تاثیر محیطهای مزبور و افرایش بیان pitx3 بر فرایند تمایزنورونی روشن شود. افزون بر تمایز نورونی، هدایت سلولهای پرتوان nt2 به سمت نورونهای دوپامین ساز نیز توسط دو فاکتور دوپامینی یعنی pitx3 و gdnf با شیوه های مزبور مورد بررسی قرار گرفت. نتایج ما نشان می دهد که فاکتور نوروتروفیک gdnf و فاکتور رونویسی pitx3 می توانند با هم اثر هم افزایی بر تمایز نورونی داشته و حتی بر تمایز دوپامینی سلولهای nt2 تاثیرگذار باشند. روش ما در صورت بهینه شدن راه را برای تبدیل سلولهای nt2 به منبعی مطمئن برای تولید نورونهای دوپامین ساز هموار خواهد کرد. واژگان کلیدی: بیماری پارکینسون،ژن gdnf، ژن pitx3 ، لنتی ویروس،آستروسیت رده 1321n1، تکوین نورونی ، رده سلولی ntera2

پارکینسون رایج ترین بیماری نورودژنراتیو بعد از آلزایمر است که دارای شیوع 1 تا 2 درصد در افراد بالای 50 سال می باشد. نشانه های کلینیکی پارکینسون وقتی که سطح دوپامین مغز از 60% سطح طبیعی آن پائین تر بیاید بروز می کنند. علت مرگ نورون های دوپامینرژیک در این بیماری هنوز مشخص نشده است اما در 2 دهه اخیر استرس اکسیداتیو و نقص عملکرد میتوکندریایی به عنوان عاملان اصلی در نورودژنراسیون این نورونها شناخته شده اند. هدف از این مطالعه بررسی تاثیر آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز-1 و شیکونین بر افزایش بقاء نورونهای دوپامین ساز در برابر مسمومیت پارکینسونی ناشی از 6-ohda می باشد. برای افزایش دادن بیان ژن گلوتاتیون پراکسیداز-1??(gpx-1) در نورون های دوپامین ساز، لنتی ویروس های نوترکیب ناقل این ژن همراه با ژن گزارشگر gfp ساخته شد و برای آلوده سازی سلول های هدف استفاده گردید. سپس میزان بقاء این نورونها در حضور و غیاب شیکونین، در برابر سم پارکینسونی 6-ohda باروش mtt اندازه گیری شد. آغاز بیان ژن gfp و افزایش بیان ژن gpx-1 به ترتیب در زیر میکروسکوپ فلورسنت و تکنیک rt-pcr مشخص شدند. نتایج حاکی از آن بود که افزایش بیان ژن gpx-1 در نورونهای دوپامین ساز و همچنین تیمار این سلول ها با شیکونین باعث افزایش معنی داری در بقاء این سلولها در برابر مسمومیت پارکینسونی نسبت به سلولهای کنترل می شود. درصد بقاء پس از افزایش بیان gpx-1 در حدود 14% و پس از افزایش شیکونین 11% برآورد شد، در حالیکه حضور توام این دو عامل درصد بقا را تا 29% افزایش داده و به 83% رساند. این نتایج نشان میدهند که احتمالا یک رابطه سینرژیک بین این دو عامل وجود دارد. کلید واژگان: پارکینسون، لنتی ویروس، شیکونین، گلوتاتیون پراکسیداز-1

پاسخ ایمنی، عدم ماندگاری بلند مدت سلول های پیوند شده و نیز مهاجرت سلولی از محل پیوند به بافت های غیر هدف از جمله چالش های اساسی پیش روی درمان های مبتنی بر سلول های بنیادی بالغ می باشند. این مشکلات ممکن است با استفاده همزمان از سلول ها و بافت ها مصون از پاسخ ایمنی در حضور داربست سلولی مناسب تعدیل یابد. لذا در این تحقیق در ابتدا سلول های بنیادی مزانشیمی بافت چربی انسانی، به منظور ردیابی آسان پس از پیوند به اندام های هدف، به ژن های گزارشگر gfp و jred تجهیز شدند. سلول های تراریخت شده به طور جداگانه به اندام های مختلف شامل: مغز، چشم و همچنین بیضه، کبد و پوست به طور مستقل و توامان با داربست سلولی مشتق از کیتوزان پیوند و در ادامه بقاء، نفوذ پذیری و مهاجرت آن ها در طول 6 ماه پس از پیوند مورد بررسی قرار گرفتند. همچنین سرنوشت سلول های پیوند شده به چشم شامل تمایز و تمایز زدایی آن ها مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از بررسی ها مبین عدم عوارض جانبی، از جمله واکنش های ایمنی در حیوان های مورد آزمون و زنده ماندن آن ها پس از پیوند بود. سلول های پیوند شده در تمامی گروه های مورد آزمون شامل مغز، چشم، بیضه، کبد و پوست تا 6 ماه پس از جراحی، مبتنی بر مشاهدات میکروسکوپی و آزمون های مولکولی، در محل پیوند قابل ردیابی بودند. با وجود قابلیت بقاء و ماندگاری سلول ها در محل پیوند، با گذر زمان بعضی از آن ها از اندام های هدف خارج و ردیابی تجمعی آن ها در طحال امکان پذیر شد. این نتایج مبین قابلیت سلول های پیوندی در عبور از سدهای خونی و نیز فرار از داربست سلولی کیتوزان بود؛ با این وجود، تعداد سلول های ردیابی شده در طحال گروه های وابسته به داربست سلولی نسبت به گروه های مستقل از داربست بسیار کمتر بود. علاوه بر این، ردیابی سلول های پیوند شده در محیط زجاجیه چشم تا 90 روز پس از پیوند امکان پذیر شد. با این وجود تعداد، قابلیت اتصال و نیز توان گسترش آن ها در شرایط in-vitro با گذر زمان و پس از بازیافت کاهش یافت و تمایز این سلول ها به سمت سلول های پیش ساز چشمی و اندوتلیالی نشان داده شد. به طور کلی، نتایج حاصل از این تحقیق مبین بقاء و توان تمایزی مطلوب سلول های بنیادی مزانشیمی بافت چربی انسانی از یک سو و نیز توان داربست سلولی کیتوزان در محبوس نمودن سلول های پیوندی از سوی دیگر بود. لذا، با وجود آنکه این نتایج می تواند مرتفع کننده برخی چالش های اساسی استفاده از سلول های بنیادی بالغ در درمان های نوین باشد، تمایل فرار این سلول ها از اندام هدف باید بیشتر مورد آزمون قرار گیرد.

بیماری پارکینسون دومین بیماری شایع تحلیل رونده عصبی است که جمعیت بالایی از افراد مسن جامعه را درگیر خود نموده است. در این بیماری، نورونهای دوپامینرژیک (dan) ناحیه نیگرواستریاتال به طور انتخابی از بین می روند. در حال حاضر علت اصلی بیماری پارکینسون ناشناخته است، ولی استرس های اکسیداتیو در ایجاد و پیشرفت بیماری نقش مهمی دارند. تا کنون دارو درمانی، درمان اصلی برای این بیماری بوده است، ولی عوارض جانبی این داروها و درمان موقتی علائم بیماری، از اصلی ترین ایرادهای این شیوه درمانی است. همچنین یکی از داروها با منشأ گیاهی برای بیمارهای تحلیل رونده عصبی در طب سنتی ایرانی و هندی، استفاده از عصاره کندر (محتوی بتا-بوسولیک اسیدbba) است. اخیراً نشان داده شده است که bba با اثر بر روی سلول های عصبی باعث افزایش طول و تعداد انشعابات نورونی می گردد. سلول درمانی به عنوان یک راه درمانی برای جایگزینی نورونهای از دست رفته، می تواند درمان دائم و موثر برای این بیماری باشد. در پژوهش حاضر، با استفاده از تکنیک انتقال ژن مبتنی بر ناقلین لنتی ویروسی، ژن های nurr1(یک فاکتور رونویسی دخیل در تکوین dan) و gpx1 (یک آنزیم آنتی اکسیدانت) به سلول های بنیادی جنینی موشی r1 انتقال داده شد و بیان دائمی این ژن ها در این سلول ها تایید گردید. سلول های بنیادی فوق، تحت پروتکل پنج مرحله ای با تیمار فاکتورهای رشد و مولکول های معین، بر روی ماتریژل همراه پلی-ال-لایزین کشت داده شدند و در هر یک از مراحل تمایز، بیان کمی مارکرهای اختصاصی هر مرحله، با استفاده از تکنیک real time pcr و ایمونوسیتوشیمی مورد بررسی قرار گرفتند. در مرحله آخر نیز عملکرد نورونهای دوپامینرژیک در سنتز دوپامین با hplc مورد بررسی و تایید قرار گرفت. نتایج نشان داد که بیان همزمان nurr1 و gpx1 همراه با تیمار bba با غلظت 30nm ، بیشترین تأثیر را در جهت افزایش مارکرهای عصبی و نورونی و در نهایت بیان مارکرهای اختصاصی نورورنهای دوپامینرژیک دارد. نتایج این پژوهش می تواند در جهت اهداف پیش بالینی سلول درمانی بیماری پارکینسون و پیوند به مدل حیوانی بکار برده شود و مطالعات مشابه را برای سلول های بنیادی القاء شده (ips cells) را به دنبال داشته باشد.

ژن dj-1 از فعالیت ضد اکسیدانی، ضد آپوپتوزی و ضد التهاب عصبی برخوردار است. در این پایان نامه نقش dj-1 در حفاظت نورونهای دوپامین ساز در برابر مسمومیت پارکینسونی توسط سم 6-ohda که موجب افزایش استرس اکسیداتیو و آپوپتوز میشود، و هم در برابر التهاب عصبی ناشی از تحریک سلولهای میکروگلیا بررسی میشود. برای انجام پایان نامه، لنتی ویروسهای نوترکیب ناقل ژن dj-1 و ژن گزارشگر jred در سلولهای رده ی hek-293t تولید شد. با تولید استوک غلیظی از لنتی ویروسها، رقت های متفاوتی از آن به سلول های دوپامین ساز رده pc12 اضافه شد. پس از مشاهده بیان jred در نور فلورسنت، آزمایشات rt-pcr افزایش بیان dj-1 را در سلولهای ترانسدوکت شده به اثبات رسانید. در گام بعدی با افزودن سم 6-ohda به سلولهای pc12 ترانسدوکت شده، مسمومیت پارکینسونی در این سلولها القا گردید. نهایتا آزمایشات mtt assay نشان داد dj-1 در ایجاد مقاومت سلولهای دوپامین ساز در برابر استرس اکسیداتیو و مرگ سلولی ناشی از این مسمومیت فعالانه شرکت کرده و رقتهای فزاینده ویروس dj-1 باعث افزایش این مقاومت میگردد.. در بخش دوم این پایان نامه، ابتدا سلول های میکروگلیا از مغز نوزاد rat استخراج و در پلیت 24 خانه کشت داده شد. سپس دوزهای متفاوت لیپوپلی ساکارید (lps) به این میکروگلیاها اضافه گردید تا التهاب عصبی در آنها القا شود. جهت اطمینان از انجام موفقیت آمیز میکروگلیاها، rna آنها استخراج شده و با تکنیک rt-pcr از افزایش بیان tnf-? بعنوان یکی از مهمترین شاخصهای التهاب عصبی اطمینان حاصل شد. در مرحله بعدی، 48 ساعت پس از تحریک میکروگلیاها، محیط کشت آنها جمع آوری و رقتهای سریالی آن به سلولهای pc12 ترانسدوکت شده افزوده شد. پس از 30 ساعت، آزمایش mtt assay انجام شد و آنالیز اعداد نشان داد که سلول های pc12 حاوی ژن dj-1 در مقایسه با سلول های فاقد این ژن مقاومت بیشتری از خود نشان داده اند. این نتایج نیز نشان داد که dj-1 میتواند سلولهای pc12 را در برابر مرگ ناشی از التهاب عصبی مقاوم نماید. پس در مجموع، dj-1 مولکولی است که قادر به محافظت چند جانبه نورونهای دوپامین ساز میباشد.

گیرنده های تیروزین کینازی نقش برجسته ای در شکل گیری و پیشرفت سرطان پستان ایفا می کنند. گیرنده ی her2 یکی از این گیرنده ها می باشد که بیان بیش از حد آن در 25% بیماران مبتلا به سرطان پستان دیده می شود. ret نیز یکی دیگر از گیرنده های تیروزین کینازی غشایی بشمار می رود که لیگاند آن gdnf است. سوئیچ های مولکولی بین گیرنده های تیروزین کینازی نیز نقش مهمی در میانجیگری این گیرنده ها در سلول های توموری ایفا می کنند. srcدر اصل یک تیروزین کیناز غیر غشایی است که با سوئیچ مولکولی بین گیرنده های تیروزین کینازی نقش جبرانی را در فعال سازی مسیرهای رشد سلولی رده سلولی بازی می کند و بدین ترتیب در ایجاد مقاومت به آنتی بادی درمانی و هورمون درمانی نقش اساسی دارد. این پایان نامه بر هم کنش بین دو گیرنده ret و her2 با میانجیگری src و تاثیر این بر هم کنش بر سرنوشت نهایی سلول توموری را بررسی می کند. بدین منظور سه بیمار مبتلا به سرطان پستان انتخاب شدند و از بافت توموری آن ها مدل های زنوگرافت ایجاد شد. موش های زنوگرافت با هرسپتین و gdnf تیمار شدند و پس از تائید اثرات آنتاگونیستی gdnf در مقابل هرسپتین، رده های سلولی از مدل های زنوگرافت ایجاد شد. در مرحله اول از مطالعه، این رده ها به همراه 2 رده ی سلولی skbr3 و mcf7 با هرسپتین و gdnf به صورت جداگانه و همزمان تیمار شدند. سپس تغییرات بیانی در سه گروه مولکول کلیدی زیر، هم در سطح mrna و هم در سطح پروتئین مورد بررسی قرار گرفت: 1) گیرنده های ret, her2 و src، 2) مولکولهای مسیر رشد akt/pi3k و 3) مولکولهای دخیل در القا و یا مهار آپوپتوز. در مرحله دوم مطالعه، مولکول src با استفاده از آنتی بادی ساراکاتینیب در رده های سلولی مشتق شده از مدل های زنوگرافت مهار گردید و بدین ترتیب راه برای بررسی مهار سوئیچ مولکولی بین گیرنده ret و her2 هموار شد. بدین منظور تغییرات بیانی مولکول های گروه دوم (مسیر رشد) و سوم (مسیر آپوپتوزی) در سطح mrna و پروتئین بررسی گردید. بموازات بررسی بیان ژنهای هدف، میزان رشد و مرگ سلولی و همچنین آپوپتوز سلولی نیز با روش های mtt assay و رنگ آمیزی اکریدین اورنج- اتیدیوم بروماید و پروپیدیوم یدید انجام شد. نتایج بدست آمده نشان داد مهار her2 به تنهایی باعث توقف کامل هیچ یک از مسیرهای پیام رسانی رشد سلول نمی شود. از طرفی حضور فاکتورهای رشد همانند gdnf با فعال ساختن تیروزین کینازهای واسطه گر مانند src می تواند مولکول های پایین دست را در مسیر پیام رسانی فعال کرده و بدین ترتیب از توقف مسیرهای فوق جلوگیری نماید. در این راستا، اضافه کردن gdnf به محیط رشد سلول های تیمار شده با هرسپتین، مهار رشد سلولی را خنثی نموده و با القاء این رشد تا بیش از به طور میانگین 35 درصد مقاومت به هرسپتین را شکل میدهد. سرانجام آنکه، مهار همزمان her2 و src در عدم حضور gdnf سبب ماکزیمم مهار رشد سلولی در بین تیمارهای مختلف انجام شده گردید. بنابراین مهار همزمان و سه جانبه ret, her2 و src در سلول های سرطانی پستان می تواند راهکاری برای غلبه بر مقاومت درمانی بوجود آمده در این سرطان باشد.

حفاظت نورونها در برابر سیگنالهای مرگ یکی از استراتژی های مهم برای مقابله با بروز و پیشرفت بیماری های نورودژنراتیو از جمله پارکینسون به شمار می رود. دو پدیده ی التهاب عصبی و استرس اکسیداتیو از منابع اصلی ایجاد سیگنالهای مرگ هستند. در این تحقیق دو فاکتور nurr1 و gdnf، به ترتیب به دلیل اثرات ضدالتهابی و ترمیمی که برای آنها گزارش شده است، به منظور حفاظت نورونهای دوپامین ساز sh-sy5y در مقابل التهاب عصبی حاصل از میکروگلیای فعال و نیز مسمومیت ناشی از توکسین 6-ohda کاندید شدند. بدین منظور در بدو امر لنتی ویروسهای نوترکیب حامل ژنهای nurr1 و gdnf تهیه و به ترتیب سلول های دوپامین ساز sh-sy5y و رده ی سلولی آستروسیتوما (1321n1) با لنتی ویروسهای مزبور آلوده شدند. همچنین برای تولید بهینه و انبوه فاکتور gdnf، سلولهای hek-293t با ناقل پلاسمیدی مربوطه ترانسفکت شدند و سپس محیط مشروط سلول های آستروسیتوما و hek-293t، که فاکتور gdnf در هر دو نوع سلول بیش بیان شده بود، جمع آوری شد. در ادامه افزایش بیان هر یک از ژنهای مزبور در سلولهای مربوطه با تکنیک rt-pcr به اثبات رسید. در مرحله ی بعد، سلولهای میکروگلیا از مغز نوزادان موش صحرایی جداسازی و کشت گردید و متعاقبا التهاب عصبی بوسیله تیمار با lps در سلولهای مزبور القا و صحت آن از طریق بیان ژنهای tnf-? و inos با تست گریس و تکنیک rt-pcr به اثبات رسید. سپس محیط مشروط این سلولها جمع آوری و به همراه محیط مشروط سلولهای آستروسیتوما /hek-293t (حاوی فاکتور gdnf) به سلولهای sh-sy5y افزوده شد. همچنین سلولهای sh-sy5y به صورت جداگانه با توکسین 6-ohda و محیط مشروط سلولهای آستروسیتوما / hek- 293t تیمار شدند. سرانجام آنالیز mtt نشان داد که سلولهای sh-sy5y با بیان فزاینده ی فاکتور nurr1 و یا در حضور مقادیر انبوه فاکتور gdnf، مقاومت بیشتری را نسبت به سلولهای کنترل در برابر التهاب عصبی و 6-ohda نشان می دهند. همچنین دو فاکتور gdnf و nurr1 با هم به صورت هم افزایی عمل کرده و مقاومت بیشتری را نسبت به حالت تنها در برابر التهاب عصبی و مسمومیت پارکینسونی به سلولهای دوپامین ساز اعطا می کنند.