مقدمه: عصاره شقایق بدلیل وجود آنتی اکسیدان ها دارای اثرات حفاظتی علیه رادیکال های آزاد اکسیژن هستند. دوکسوروبیسین بعنوان داروی شیمی درمانی در درمان طیف وسیعی از انواع سرطان ها بکار می رود. عصاره شقایق می تواند از شوک اکسیداتیو و آپاپتوز القاء شده توسط دوکسوروبیسین در سلول ها، پیشگیری کند. این مطالعه برای بررسی بهبودی عملکرد عصاره شقایق با خاصیت آنتی اکسیدانتی بر اثرات اکسیداتیو و آپاپتوتیک القاء شده از دوکسوروبیسین در بافت تخمدان، طراحی شده است. روش کار: موش های 6-8 هفته ماده در 4 گروه تقسیم شدند: 1) موشهای تیمار شده با نرمال سالین بعنوان گروه کنترل، 2) موشهای تیمار شده با عصاره شقایق (mg/kg200 ، بصورت درون صفاقی، روزانه به مدت 12روز)، 3) موشهای تیمار شده با دوکسوروبیسین (mg/kg 2.5، بصورت درون صفاقی، هر 3روز یکبار برای 4روز: روز دوم، پنجم، هشتم و یازدهم، درکل mg/kg 10)، 4)گروه چهارم شامل تزریق عصاره شقایق و دوکسوروبیسین باهم بودند. اثر عصاره شقایق و دوکسوروبیسین بر تکوین تخمک های موش های تیمار شده، توسط روش های کمک ناباروری ارزیابی شد. به این صورت که تزریق pmsg و 48ساعت بعد hcg در تمام گروه ها انجام شد و موش ها 15روز بعد از شروع تزریق عصاره شقایق، کشته شدند. تخمک های mii از آمپولای اویداکت موشهای nmri خارج شدند. سپس تخمک ها همراه با گرانولوزا، به محیط htf محتوی bsa 15% انتقال یافته و اسپرم های ظرفیت یابی شده به محیط ivf اضافه شدند. بعد از 4-6 ساعت، جنین های حاوی پیش هسته های نر و ماده (2pn) به محیط ksom محتوی bsa 4% انتقال یافته و تکوین جنین ها تا 96 ساعت بررسی شدند. استرس اکسیداتیو در بافت تخمدان می تواند با غلظت های مختلف مالون دی آلدهید ارزیابی شود. برش های هیستولوژی تخمدان با هماتوکسیلین- ائوزین و پرو کاسپاز3، رنگ آمیزی می شوند، سپس فولیکول ها شمارش و طبقه بندی شده و تغییرات آپاپتوتیک ارزیابی می شود. همه داده ها با آنالیز واریانس یک طرفه و تست توکی آنالیز شدند و نتایج در سطح معنی داری p<0/05 ارزیابی شدند. نتایج: ارزیابی هیستولوژی بطور معنی داری کاهش در ذخیره ی فولیکول های پره آنترال طبیعی و افزایش فولیکول های آنترال دژنره را نشان می دهد. فعالیت پروکاسپاز-3 در گروه تیمارشده با دوکسوروبیسین بطور معنی داری افزایش پیدا کرده و باعث استرس اکسیداتیو در تخمدان شده است. در گروه دوکسوروبیسین افزایش معنی داری در سطح مالون دی آلدهید نسبت به سایر گروه ها وجود دارد(p<0/05) و منجر به کاهش نرخ لقاح و تکوین بلاستوسیست ها نسبت به گروهی که با عصاره تیمار شده است، می شود (گروه عصاره و دوکسوروبیسین در مقابل گروه دوکسوروبیسین p<0/05). نتیجه گیری: براساس نتایج ما، به نظر می رسد عملکرد عصاره شقایق ، استرس اکسیداتیو القاء شده از دوکسوروبیسین را در بافت تخمدان، خاموش می کند و تزریق همزمان عصاره در کنار دوکسوروبیسین ممکن است راه حل مناسبی برای جلوگیری از آسیب های ناشی از دوکسوروبیسین بر تکوین جنین ها باشد.

هدف این تحقیق بررسی تأثیرات انجماد شیشه ای کمپلکس های تخمک–کومولوس (توده های coc) گوسفند بر بقای توده ها، بلوغ تخمک ها، بیان ژنهای بلوغ و آپوپتوزی، شیوع ناهنجاریهای کروموزومی و تغییرات فراساختاری توده ها بود. توده های coc جدا شده دارای کیفیت خوب به چهار گروه، غیرانجمادی کنترل، انجمادی conventional straw ، cryotop و solid surface تقسیم شدند. در گروههای انجمادی conventional straw وcryotop، توده های منجمد شیشه ای شده به ترتیب در درون نی انجمادی و بر روی نوک نوارcryotop قرار گرفتند و مستقیماً در نیتروژن مایع غوطه ور شدند درحالیکه در گروه انجمادی solid surface، توده های منجمد شیشه ای شده پس از قرار گرفتن بر رویcryotop ، ابتدا سرد و سپس به نیتروژن مایع منتقل شدند. پس از بررسی بقا، توده های coc سالم به همراه توده های تازه گروه کنترل، در شرایط آزمایشگاهی بالغ شده و وضعیت هسته ای تخمک ها ارزیابی شد. علاوه بر آن، بیان نسبی ژنهای بلوغ و آپوپتوزی با روش کمی real-time pcr مورد ارزیابی قرار گرفت و شیوع ناهنجاری کروموزومی نیز با روش کاریوتیپ بررسی شد. در آخر، تغییرات فراساختاری توده های منجمد شده و تخمک های منجمد و بالغ شده نیز بین گروههای مختلف مقایسه شد. نتایج نشان داد که میزان بقای توده های منجمد و ذوب شده در گروههای cryotop و solid surface نسبت به گروه conventional straw بالاتر بود (به ترتیب 2/85 ± 83/84 و 1/72 ± 78/56 در برابر 1/48 ± 63/43% ، 0/05>p)، بعلاوه اگر چه در گروه cryotop، میزان بلوغ تخمک ها شبیه به گروه کنترل بود (3/09 ± 48/81 در برابر 3/01 ± 51/94%) ولی در مقایسه با سایر گروههای انجمادی درصد بالاتری داشت (3/09 ± 48/81 در برابر 1/69 ± 36/60 و 2/51 ± 6/09% ، 0/05>p). با وجود کاهش بیان نسبی ژنهای بلوغ (gdf9 و bmp15) پس از انجماد شیشه ای، گروه cryotop در میان گروههای انجمادی، بیشترین بیان را به خود اختصاص داده بود. بالاترین میزان بیان گیرنده bmprii در گروه کنترل بود، در حالیکه گیرنده alk5 میزان بیان مشابهی را در تمام گروهها داشت. بیان ژنهای پروآپوپتوزی (بجزbax) و ضدآپوپتوزی در گروه cryotop در مقایسه با سایر گروههای انجمادی بیشتر بود. ژن bax در گروه solid surface بیش از حد بیان شده بود. گروه conventional straw نیز پایین ترین میزان بیان ژنهای آپوپتوزی را نشان داد. میزان شیوع ناهنجاری کروموزومی در گروه cryotop نسبت به گروه کنترل بیشتر بود (5/42 در برابر 20% ، 05/0<p). همچنین نتایج بررسی های فراساختاری نشان داد که انجماد شیشه ای با روشهای cryotop و solid surface سازمان دهی کلی اووپلاسم را حفظ کرده در حالیکه انجماد conventional straw این سازمان دهی را بهم ریخته بود. علاوه بر آن پس از انجماد شیشه ای، تعداد واکوئل ها در اووپلاسم افزایش یافت، گروهی از این واکوئل ها به صورت جزیی یا کامل با چربی پر شده و گروهی نیز دارای داربست میکروفیلامنتی بودند. در تمام گروههای انجمادی، توزیع میتوکندریها به حالت گروه گروه در اطراف قطرات چربی در آمده بود و پس از انجماد conventional straw، میتوکندریهای متسع و حتی پاره نیز مشاهده شدند. اتصالات فاصله دار میان تخمک و سلول های کومولوس اطراف و کمپلکس های اتصالی بین سلول های کومولوس در دو گروه انجمادی cryotop و solid surface به خوبی حفظ شده در حالیکه در گروه انجمادی conventional staw، سلول های کومولوس زوایدشان را از منطقه شفاف به عقب کشیده بودند. در تخمک های بالغ نیز از تعداد و تراکم گرانولهای قشری پس از انجماد conventional straw و solid surface کاسته شده بود. در نهایت، انجماد با روش cryotop در مقایسه با دو روش انجمادی دیگر روش مطمئنی بنظر رسیده و می تواند بقا، بلوغ پس از ذوب و میزان بیان ژنهای بلوغ را افزایش دهد و همانند گروه کنترل سبب القای مرگ سلولی از طریق مسیر آپوپتوزی گردد. بعلاوه این روش فراساختار توده های coc را نیز بخوبی حفاظت می کند ولیکن کاستی هایی در زمینه حفظ سازمان دهی کروموزومی تخمک از خود نشان می دهد.

مقدمه : فراگمنتاسیون پدیده ی شایعی است که در بیش از ??% جنین های انسانی که در محیط کشت آزمایشگاهی رشد می کنند مشاهده می شود. یکی از مکانیسم های فراگمنتاسیون، آپوپتوز می باشد. در این مطالعه به منظور دستیابی به ارتباط میان آپوپتوز و فراگمنتاسیون، نقش متیلاسیون dna را در مهار بیان ژن های آنتی و پرو آپوپتوز بررسی می کنیم. روش ها: با استفاده از میکروسکوپ معکوس و بر اساس درجه فراگمنتاسیون، جنین های انسانی در مرحله هشت سلولی به چهار گروه تقسیم شدند: گروه i جنین های با کم ترین میران فراگمنتاسیون، گروه ii جنین هایی با ??%> فراگمنتاسیون، گروه iii جنین هایی با ??%< فراگمنتاسیون، گروهiv جنین هایی که توسط ماده ی القاگر آپوپتوز به نام اکتینومایسین d به صورت آپوپتوزی درآمدند. در ابتدا رنگ آمیزی tunel برای تأیید وقوع آپوپتوز در جنین ها انجام شد. سپس به منظور بررسی بیان کمی ژن های bag1، bax و bcl2 و نیز بررسی وضعیت الگوی متیلاسیون dna نواحی تنظیمی ژن های مورد مطالعه به ترتیب از روش rt-pcr وreal-time pcr و تکنیک بی سولفیت استفاده شد. یافته ها: نتایج رنگ آمیزی tunel نشان داد که جنین هایی با میزان فراگمنتاسیون بالا، دارای اجسام آپوپتوتیک بیشتر می باشند. نتایج بررسی rt-pcr و q-pcr آشکار کرد که بیشترین میزان بیان bag1 در گروه i و کم ترین آن در گروه iv با اختلاف معنی دار می باشد. وضعیت متیلاسیون ناحیه ی تنظیمی این ژن نیز در گروه iv نسبت به گروه i با افزایش معنی دار سطح متیلاسیون (هایپرمتیلاسیون) همراه بود. رونوشت ژن bcl2 در هیچ یک از گروه های آزمایشی مشاهده نشد و توالی های cpg ناحیه ی تنظیمی آن در هر چهار گروه تقریباً به یک میزان متیله بود. بالاترین میزان بیان ژن bax در گروه ii مشاهده شد و داده های حاصل از تعیین توالی بی سولفیتی ژن bax نشان داد که ناحیه ی تنظیمی این ژن در هر چهار گروه به میزان کم متیله (هایپومتیله) می باشد. همچنین تاثیر اکتینومایسین d بر میزان بیان رونوشت ژن های مورد مطالعه در گروه iv نسبت به گروه i با کاهش معنی دار همراه بود. نتیجه گیری: سطح متیلاسیون dna ژن bag1 سبب کاهش بیان این ژن می گردد. بنابراین بیان رونوشت bag1 می تواند به عنوان یک مارکر مناسب جهت تشخیص آپوپتوز در جنین های انسانی به کار رود، در حالیکه رونوشت ژن bcl-2 در جنین های انسانی مرحله ی هشت سلولی نقشی در شناسایی آپوپتوز نداشته و الگوی متیلاسیون dna ناحیه تنظیمی این ژن با عدم بیان رونوشت آن مرتبط است. همچنین وضعیت متیلاسیون ناحیه ی تنظیمی مورد مطالعه ژن bax ارتباطی با میزان بیان mrna این ژن ندارد.

مقدمه: امروزه انجماد شیشه ای به منظور حفظ جنین های اضافی در art، در حال تبدیل شدن به یک روش رایج است، اما تأثیرات ژنتیکی این روش مورد ابهام است. هنوز مشخص نیست که جنین های ذوب شده ای که به لحاظ مورفولوژی طبیعی هستند، از نظر ژنتیکی هم طبیعی باشند. از آن جایی که متیلاسیونdnaی نواحی تنظیمی ژن می تواند بیان ژن را مهار سازد، دراین مطالعه اثر انجماد شیشه ای با کرایوتاپ بر متیلاسیون dna و سطح بیان دو ژن تکوینی oct4و mest در بلاستوسیست های موش، مورد بررسی قرارگرفته است. روش ها: جنین های دو سلولی با روش فلاشینگ لوله ی رحم ازموش سوپراووله جمع آوری شده و به دو گروه کنترل و آزمون تقسیم شدند. جنین های دوسلولی گروه کنترل مستقیماً تا مرحله ی بلاستوسیست کشت داده شدند، در حالیکه جنینهای دوسلولی گروه آزمون ابتدا تا رسیدن به مرحله ی چهار تا هشت سلولی کشت شده و سپس با روش انجماد شیشه ای با استفاده از کرایوتاپ، منجمد و پس از دو تا شش ماه ذوب شدند و تا رسیدن به مرحله ی بلاستوسیست کشت داده شدند. بلاستوسیست هایی که از نظر مورفولوژی طبیعی بودند، انتخاب و dna و rnaی آن ها استخراج شد. برای بررسی وضعیت متیلاسیون dna و بیان کمّی این ژن ها به ترتیب، روش تعیین توالی بی سولفیت و real-time rt-pcr مورداستفاده قرارگرفت. یافته ها: نتایج حاصل از آنالیز کمّی pcr نشان داد که سطح بیان هر دو ژن oct4 و mest در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل کاهش یافته است. همچنین بررسی متیلاسیون dna نشان داد که وضعیت ایمپرینت ژن mest در گروه آزمون نسبت به گروه کنترل از نظم یکسانی برخوردار نیست همچنین در این گروه یک دی نوکلئوتید cpg در ناحیه ی پروموتور oct4 به صورت هایپرمتیله دیده می شود. نتیجه گیری: این مطالعه نشان داد که روش انجماد شیشه ای با کرایوتاپ اثری منفی بر سطح بیان ژن های oct4 و mest در این جنین ها دارد و به نظر می رسد که این روش انجمادی می تواند الگوی متیلاسیونdnaی ناحیه ی پروموتور این دو ژن را تغییر دهد. احتمالاً کاهش سطح بیان ژن oct4 با هایپرمتیله شدن دی نوکلئوتید cpgی ذکر شده در این ژن مرتبط است.

روشهای شیمی درمانی و رادیوتراپی رایج در درمان بیماری سرطان اغلب باعث از دست رفتن قدرت باروری وآسیبهای جدی به بافت تخمدان می شود.ازجمله اقدامات بالینی دردرمان بیماران سرطانی (سرطان تخمدان ، سینه یا رحم)،و بیمارانی که دچار مشکل تولیدمثلی می باشند پیوند بافت تخمدان درون عضله یا قسمتی از کپسول کلیه و یا زیر صفاق،برای بازگشت باروری آنها می باشد. از بحثهای بسیار مهم و اساسی مطرح در این روش،ایســکمی اولیه در بافت پیوندی وآسیب حاصله به بافت در اثر عدم خونرسانی کافی در اطراف بافت می باشد.هدف اصلی در این مطالعه استفاده از فاکتور رشد اندوتلیال عروق(vegf) برای افزایش میزان رگزایی و خونرسانی در اطراف بافت پیوندی و پس از آن بررسی، میزان کیفیت و بلوغ اووسیت های بدست آمده از بافت پیوندی می باشد. روش کار: بدین منظور کار به دو بخش تقسیم شد ، در مرحله اول تعداد (30=n) سر موش21 روزه ماده مورد جراحی پیوند یکطرفه تخمدان قرار گرفتند.تخمدانها درون عضله سرینی سمت چپ گذاشته شدند در مرحله دوم تعداد (40=n) سرموش ماده 21 روزه به چهار گروه تقیسم شده و در هر گروه 10= nبا دوزهای( 0.5،1،2،4میکرو گرم/ میلی لیتر ( از فاکتور رشد رگزایی vegf در حین پیوند به بافت تخمدان گذاشته شده درون عضله تزریق شد.پس از سپری شدن 21 روز از پیوند در هر دو گروه، موشها توسط فاکتورهای القاکننده pmsg و hcg القا شده و تخمدان آنها از درون عضله جدا شده از تخمدان های پیوندی برشهای بافتی تهیه و برای رنگ آمیزی h&e و تست tunel و ایمونوهیستوشیمی مورد استفاده قرار گرفتند.تا به اپتیمم دوز فاکتور vegfدست یابیم پس ازتشریح تخمدان (چه پیوندی و چه تخمدان مقابل) تعداد تخمک های حاصله شمارش شد و برای(in-vitro maturation) ivmو (ivf(in-vitro fertilization از آنها استفاده شد . همچنین تعدادی از فولیکولهای حاصله از بافت پیوندی کشت داده شدند. نتایج : افزودن فاکتور رگزایی vegf به تخمدان پیوندی با توجه به داده های هیستولوژی و تصاویر ایمونوهیستوشیمی بر روند رشد فولیکولها و نیز افزایش تعداد آنها پس از پیوند تأثیرداشته و در بهبود ایسکمی نیز نقش ایفا کرده است، اما نسبت به گروه کنترل این اختلاف معنی دار نبوده است. بحث : رگزایی انجام شده در اطراف بافت پیوندی توسط فاکتور vegfمنجر به افزایش میزان خونرسانی به پیوند، افزایش دسترسی بافت به اکسیژن و مواد مغذی ودر نتیجه کاهش اثر ایسکمی بر روی بافت پیوندی بوده که خونرسانی بهتر بر روند رشد فولیکولها و اووسیتهاو نیز افزایش تعداد آنها پس از پیوند تأثیرمستقیم داشته است.

پیشگویی این نکته که بدن به یک داروی خاص چه پاسخی خواهد داد کار آسانی نمی باشد. تفاوت در ژنوم افراد یکی از مهمترین فاکتورهایی است که می تواند پاسخ های متفاوتی از متابولیسم دارو را ایجاد کند. چرا که پلی مورفیسم های متفاوت در بیومولکول های دخیل در مسیر متابولیسم داروها (رسپتورها- آنزیم های فعال کننده- مولکول های هدف و غیره) موجب پاسخ متفاوت در فرد به دارویی خاص می گردد. سندرم تخمدانی پلی کیستیک(pcos) یک بیماری هتروژن می باشد که علت اصلی آن شناخته نشده است. اساس این سندرم بدین گونه است که بلوغ فولیکول ها کامل نشده و در هر سیکل تخمک گذاری رخ نمی دهد، که این پدیده به تنهایی موجب بروز ناباروری در زنان می شود. هورمون حیاتی برای بلوغ تخمک ها استروژن می باشد که تحت عملکرد آنزیم آروماتاز از آندروژن حاصل می شود. ژن این آنزیم با نام cyp19a1 که روی کروموزوم شماره ی 15 واقع شده می تواند دستخوش جهش ها و پلی مورفیسم های متفاوتی قرار بگیرد. البته لازم به ذکر است که در بعضی بیمارانpco مقاوم به درمان های اولیه، داروی مهار کننده ی آروماتاز می تواند به این بیماران کمک کند. هدف از این طرح مطالعه جایگاه فعال و چند پلی مورفیسم ژنcyp19 در ژنوتیپ افراد دارای سندرم پلی کیستیک و یافتن ارتباط بین آنها با میزان پاسخ دهی به روش های درمانی می باشد. علاوه بر این ارتباط بین پارامتر های ملکولی (snp) و میزان بیان mrna و پروتئین cyp19 در سلول گرانولوزا در بیماران مبتلا به pcos بررسی می شود. (البته لازم به ذکر است که این مورد با follow up بیمار و به صورت کامل در طرح های تکمیلی بررسی خواهد شد.) این کار به منظور بهینه سازی پروتکل درمانی بیماران مراجعه کننده به مراکز art می باشد. در این طرح سه گروه pco (55 بیمار)، کنترل دارویی (45 بیمار) تحت درمان به روش iui و کنترل بارور (40 فرد) مورد بررسی قرار گرفت. مطالعه جایگاه فعال و پلی مورفیسم های مورد نظر با تهیه ی پرایمر، انجام pcr و بررسی نتایجrflp و sequencing انجام شد. از طرف دیگر برای بررسی میزان بیان ژن و پروتئین حاصله در سلول های گرانولوزای بیمارانی که پس از چندین سیکل iui تحت درمان ivf (5 بیمار pco و 5 بیمار کنترل دارویی) قرار گرفتند ، به ترتیب از روش های real time pcr و western blot استفاده شد. در اگزون های 9 و 10 هیچ پلی مورفیسمی مشاهده نشد. علاوه بر این هیچ تغییر نوکلئوتیدی در اسیدهای آمینه جایگاه فعال این پروتئین در اگزون 8 نیز دیده نشد. لازم به ذکر است که با وجود مشاهده پلی مورفیسم در اگزون 7 و تنوع در تکرارهای پلی مورفیک ttta و ins/del tct در اینترون 4 در بین سه گروه مورد مطالعه، این اختلافات معنی دار نبوده است. البته رابطه ی معنی داری بین افراد دارای هتروزیگوتsnp اگزون 7 و پاسخ به درمان (follicular diameter) در مقایسه با افراد دارای آلل نرمال مشاهده شد. به این صورت که افراد wild type برای این پلی مورفیسم نسبت به حالت هتروزیگوت به درمان بهتر پاسخ می دهند. در نهایت نیز در مورد بیان در سطح پروتئین و mrna ی آروماتاز در سلول های گرانولوزا (به دلیل تعداد کم نمونه ها و همخوانی نداشتن داده ها در این دو سطح) تحقیقات بیشتری باید صورت بگیرد.

درشبیه سازی به روش انتقال هسته ی سلول سوماتیکی، هسته ی انتقالی باید از حالت تمایز یافته به حالت جنینی باز برنامه-ریزی شود. آنالیز های مولکولی نشان می دهند که باز برنامه ریزی در هسته ی انتقالی ناکامل بوده و جنین های شبیه سازی شده مدیفیکاسیون های اپی ژنتیکی غیر طبیعی مثل سطح بالای متیلاسیون dna دارند. از آن جا که متیلاسیون در تکوین جنین در دوره ی قبل از لانه گزینی جایگاه مهم و حیاتی دارد، هایپر متیله بودن و یا هر اختلال در فرایند متیلاسیون می تواند بیان ژن های مربوط به تکوین را تغییر دهد که این تغییرات در مراحل بعدی تکوین جنین، به صورت توقف تکوین ظاهر می شود. بنابراین در این مطالعه برای ارائه ی راهکار ی در جهت اصلاح خطای اپی ژنتیکی، اثر rg108 (n-phthalyl-l-tryptophan) به عنوان مهارکننده ی آنزیم dna متیل ترانسفراز 1 روی میزان موفقیت تکوین و شدت متیلاسون بررسی شد. ما بحث خواهیم کرد که آیا rg108 می تواند شدت متیلاسیون را در جنین های حاصل از شبیه سازی کاهش و کارایی شبیه سازی را افزایش دهد؟ جنین های حاصل از شبیه سازی از مرحله ی دو سلولی تا مورولا با 5 و 10 میکرومول rg108 تیمار شدند و رنگ آمیزی فلورسانس غیر مستقیم بر اساس استفاده از آنتی بادی اولیه علیه 5 متیل سیتوزین در گروه جنین های مرحله مورولا حاصل از لقاح طبیعی و گروه جنین های مرحله مورولا حاصل از شبیه سازی تحت تیمار و بدون تیمار انجام شد. سطح کلی متیلاسیون dna در آنها اندازه گیری و سپس از لحاظ کمی آنالیز شد. همچنین از طریق رنگ آمیزی هسته ها، میانگین تعداد سلول ها در گروه های مذکور نیز محاسبه شد و بر اساس شمارش جنین ها که تا مرحله ی مورولا تکوین پیدا کرده بودند، درصد موفقیت تکوین تا این مرحله نیز در همه گروه ها ارزیابی شد.میزان درصد تکوین تا مرحله ی مورولا در گروهی که با 10 میکرومول rg108 تیمار شده بود (3/3 ± 9/6) به طور معنی-داری پایین تر از میزان تکوین در گروه شبیه سازی شده بدون تیمار (9/3 ± 2/35) مشاهده شد. همچنین در میزان درصد تکوین گروه تیمار شده با 5 میکرومول rg108(9/2 ± 9/17) نیز اختلاف معنی داری با میزان درصد تکوین در گروه شبیه-سازی شده بدون تیمار (99/3 ± 82/34) دیده شد. اختلاف درصد روند تکوین در دو گروه تحت تیمار با 5 و 10 میکرومول rg108 معنی دار بود. مقایسه ی شدت متیلاسیون بین جنین های شبیه سازی شده بدون تیمار (99/5 ± 57/42) و تحت تیمار با 5 میکرومول rg108 (19/3 ± 55/34) تفاوت معنی داری نشان داد و این اختلاف بین شدت متیلاسیون در جنین-های حاصل از لقاح طبیعی (24/9 ± 53/36) و جنین های حاصل از شبیه سازی بدون تیمار معنی دار درحالی که با جنین-های حاصل از شبیه سازی تحت تیمار با 5 میکرومول rg108 معنی دار نبود. اختلاف بین میانگین تعداد سلول ها در جنین های شبیه سازی شده بدون تیمار (09/2 ± 73/11) و تحت تیمار (59/2 ± 1/11) معنی دار نبود اما این میانگین در بین گروه های شبیه سازی و حاصل از لقاح طبیعی (0/0 ± 16) اختلاف معنی داری نشان داد. یافته ها در این مطالعه نشان داد که تیمار جنین های موشی حاصل از شبیه سازی از مرحله ی 2 سلولی تا مرحله ی مورولا با 5 میکرومول rg108 گر چه نمی تواند باعث افزایش درصد تکوین تا مرحله ی مورولا نسبت به گروه شبیه سازی بدون تیمار شود اما به عنوان مهارکننده ی آنزیم dna متیل ترانسفراز 1 احتمالاً می تواند اثر مثبتی بر اصلاح هایپرمتیلاسیون در جنین های حاصل از شبیه سازی داشته باشد و شدت متیلاسیون را تا حد گروه کنترل کاهش دهد. اما باعث افزایش تعداد سلول ها نمی شود.

پرتوانی به عنوان ظرفیت سلول ها در تمایز به همه ی لایه های جنینی تعریف شده و سلول های بنیادی جنینی، سلول های پرتوانی هستند که از توده سلولِ درونیِ (icm) بلاستوسیست تولید می شوند. سلول های بنیادی جنینی موشی بطور متعارف روی فیبروبلاست های جنین موشی (mef) و در حضور سرمِ گاوی (fbs) کِشت می شدند. مطالعات نشان داده که با مهار دو مسیر پیام رسانیِ mapk و gsk3 ، سلول های بنیادی جنینی از نژادهای مختلف موشی تولید شدندکه این محیط کشت را“2i” نامیدند. با هدف کشف مسیرهای جایگزین و بهینه کردن محیط کشت سلول های بنیادی، تاثیر تعداد زیادی از ریز مولکول ها مطالعه شده است. به تازگی پژوهشگران پژوهشگاه رویان محیط کشت “r2i” را معرفی کرده اند که با بکارگیری دو کوچک مولکول sb431542 و pd0325901 (مهارکننده های مسیر tgfβ و mapk) نه تنها قادر به تولید سلول های بنیادی جنینی با کارایی حدود 100% هستند، بلکه در مقایسه با محیط کشت شناخته شده ی “2i” ، قدرت حفظ پایداری ژنومی بیشتری دارد. در مطالعه پیش رو، بررسی مکانیسم عملکردی تولید و حفظ پرتوانی سلول ها در حضور r2i انجام شده است. بدین منظور در فاز اول، پروفایل بیان ژن در دو رده سلول بنیادی جنینیِ کشت شده در محیط r2i و 2i بررسی شد که ضرورت فعال بودن مسیر پیام رسانی bmp4 در محیط کشت r2i نتیجه گیری شد. ضرورت نقش مسیر آبشاری bmp4 در حفظ وضعیت پایه پرتوانی در محیط کشت r2i با مهار گیرنده bmp4 اثبات شد که باعث تمایز و مرگ سلولی می شود کارایی بالای محیط r2i در تولید رده سلول بنیادی جنینی، این امکان را فراهم می کند که به بررسی مکانیسم این فرایند پرداخته شود. بنابراین در فاز دوم، پروفایل بیان ژنی و متیلاسیون dna در نمونه های جنینِ کشت شده در روند تولید سلول های بنیادی بررسی شد. ما الگوی بیان متفاوتی را در شبکه تنظیمی ژن های مرتبط به پرتوانی، متابولیسم انرژی، و تنظیم کننده های مورفولوژی سلولی از قبیل آبشار اتصالات اپی تلیالی مشاهده کردیم. نتایج متیلاسیون dna ، وضعیت هیپرمتیلاسیون را در سلول های icm به نسبت سلول های es نشان می دهد. در این آزمایش متیلاسیون dna بخصوص در نواحی line1، msat و iap بررسی شده است. این مطاله درک بهتری از مکانیسم مولکولی و مدار تنظیمی تولید سلول های پرتوان جنینی ارائه می دهد. مطالعات مراحل اولیه ی جنینی نشان می دهد که سلول های icm اپی تلیالی شکل بوده و در روند تکوین و تمایز، به سلول های مزانشیمی تبدیل می شوند. بیشتر بافت ها و ارگان ها از تبدیل سلول های اپی تلیالی به مزانشیمی بوجود می آیند. این فرایند تکوینی را emt و تبدیل سلول مزانشیمی به اپی تلیالی را met می نامند. در طرح حاضر، فرضیه ای مطرح شد که انسداد فرایند emt را برای تولید سلول بنیادی جنینی موشی لازم می دانست. به منظور اثبات این فرضیه، بیان ژن های cdh1، snail، و klf4 در روند تولید سلول های es مورد ارزیابی قرار گرفتند. همچنین با القاء emt با tgf-β1 و activin در دو محیط کشت 2i و r2i این فرضیه ارزیابی شد که در نهایت منجر به تایید فرضیه "لزوم انسداد فرایند emt" در روند تولید سلول های بنیادی جنینی موشی شد.استفاده از سلول های بنیادی به دلیل توانایی نامحدود در تمایز به سلول های جدید، از مهمترین چشم اندازهای طب ترمیمی تلقی می شود. بنابراین بالا بردن کارایی تولید و کشف مکانیسم های مولکولی درگیر در سلول های بنیادی جنینی موشی، راه کاری برای افزایش دانش تولید و نگهداری سلول های بنیادی انسانی (hescs) نیز خواهد بود.

سطح استیلاسیون هیستونی در هسته ی جنین های شبیه سازی شده نسبت به جنین هایی با تکوین طبیعی پایین تر است. مهارکننده های هیستون داستیلاز با بهبود سطح استیلاسیون در این جنین ها می توانند بر روی کیفیت جنین ها در مرحله ی قبل از لانه گزینی و همچنین سطح بیان ژن های گوناگون به خصوص ژن های تکوینی تأثیر گذار باشند. در این تحقیق suberoylanilide hydroxamic acid (saha) به عنوان مهارکننده هیستون داستیلاز برای تیمار جنین های شبیه سازی شده استفاده شده است. این جنین ها به مدت 10 ساعت از شروع فعال سازی با 5 میکرومولار saha تیمار شده اند. سپس تکوین تا مرحله ی بلاستوسیست (آزمون mann-whitney)، شمارش تعداد کل سلول ها (آزمون tukey hsd) و میزان آپوپتوز (آزمون dunnett t3) در مرحله ی بلاستوسیست توسط تست tunel مورد بررسی قرار گرفت و همچنین سطح بیان ژن های oct4، cdx2، nanog، hspc117، و igf2 با روش real time pcr اندازه گیری شد (آزمون mann-whitney). میانگین تعداد کل سلول های جنین های شبیه سازی شده و تیمار شده در مرحله ی بلاستوسیست در مقایسه با گروه بدون تیمار افزایش پیدا کرده (p< 0.05). میزان آپوپتوز در جنین های شبیه سازی شده در مرحله ی بلاستوسیست نسبت به جنین های in vivo افزایش معنی داری را نشان می دهد (p< 0.05) در حالیکه با تیمار saha میزان آپوپتوز در جنین های شبیه سازی شده کاهش پیدا کرده و تفاوت معنی داری با گروه in vivo مشاهده نمی شود. سطح بیان ژن های ذکر شده در گروه شبیه سازی بدون تیمار کاهش معنی داری را نسبت به گروه in vivo نشان می داد که تیمار saha باعث افزایش معنی دار بیان این ژن ها نسبت به گروه بدون تیمار شد (p< 0.05). تکوین قبل از لانه گزینی تا مرحله ی بلاستوسیست در گروه با تیمار نسبت به گروه بدون تیمار افزایش معنی داری را نشان نداد. با وجوداینکه saha باعث افزایش تکوین قبل از لانه گزینی نشد اما با افزایش تعداد کل سلول ها و کاهش میزان آپوپتوز تا سطح جنین های حاصل از in vivo باعث بهبود کیفیت بلاستوسیست های بدست آمده از شبیه سازی شد. بهبود بیان ژن های ذکر شده بخصوص دو ژن nanog و igf2 که به حد نرمال در جنین های طبیعی رسید نیز ممکن است باعث افزایش پتانسیل تکوینی و شانس بقاء جنین ها در تکوین بعد از لانه-گزینی شود.

سندرم تخمدان پلی کیستیک (pcos)، با دلایل متعددی از جمله اختلالات هورمونی، تغییرات اپی ژنتیک و تأثیرات محیطی از علل شایع ناباروری می باشد. حدود 25-6 % از زنان در سراسر جهان در طول سال های باروری شان از این بیماری رنج می برند. ژن های خانواده ی hox به عنوان فاکتورهای رونویسی در شکل گیری دستگاه تولید مثلی زنان و عملکرد صحیح آن نقش مهمی دارند. تغییرات اپی ژنتیک بر الگوی بیان ژن ها تأثیر گذار است. در مطالعه ی فعلی، سلول های کومولوس که نقشی حیاتی در بلوغ تخمک، تخمک گذاری و فرآیند لقاح دارند؛ با هدف بررسی تغییرات بیان و الگوی اپی ژنتیکی مارک های هیستونی استیلاسیون و متیلاسیون در ناحیه ی تنظیمی ژن های خانواده ی hoxa-d مورد مطالعه قرار گرفتند.