چکیده لیپازها (تری آسیل گلیسرول آسیل هیدرولاز (ec 3.1.1.3 از مهم ترین آنزیم های صنعتی هستند که در صنایع مختلف از جمله صنایع غذایی، شوینده ها، تولیدات دارویی، چرم، پارچه، لوازم آرایشی و کاغذ کاربرد دارند. لیپازهای باکتریایی عضوی از خانواده ?/? هیدرولاز هستند که تری آسیل گلیسیرول ها را در فاز بین آب- چربی هیدرولیز می کنند. مقایسه ساختار لیپازهای bacillus با ?/? هیدرولازها نشان می دهد که مارپیچ ?5 طی تکامل وارد ساختار لیپازهای bacillus شده است. بهبود ویژگی سوبسترایی و فعالیت کاتالیتیک لیپازها با استفاده از روش های مهندسی پروتئین در کاربردهای تجاری اهمیت دارد. در این تحقیق پس از مطالعات بیوانفورماتیک، مارپیچ ?5 از ژن btl2 باکتری bacillus thermocatenulatus با روش soe-pcr حذف و ژن جهش یافته در ta وکتور همسانه سازی و سپس درون باکتری e.coli ترانسفورم شد. پس از تایید همسانه سازی، ژن btl2 جهش یافته برای انتقال به مخمر pichia pastoris درون وکتور بیانی ppicz?b همسانه سازی شد. پس از تایید بیان، فعالیت آنزیمی پروتئین خالص شده با رزین de52 با دستگاه ph-stat سنجیده شد. پس از آن اثر سوبستراها، دما، پایداری دمایی، ph، یون فلزی، دترجنت و حلال های آلی متفاوت بر آنزیم طبیعی و جهش یافته بررسی شد. نتایج نشان داد که لیپاز جهش یافته فعالیت بالاتر در طیف وسیعتری از ph نسبت به لیپاز طبیعی دارد. همچنین افزایش فعالیت آنزیم جهش یافته در مقابل اکثر سوبستراها و به ویژه سوبسترای هشت کربنه، مشاهده شد. لیپاز جهش یافته دماهای 45 تا 60 درجه سانتیگراد را بهتر تحمل می کند که این ویژگی ها منجر به کاربردهای مختلف در صنایع شوینده، غذایی و اولئوکمیکال می گردد. به علاوه نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی در مقابل حلال های آلی و دترجنت های مختلف و نیز برخی یون ها از خود کاهش نشان داد. پایداری دمایی آنزیم جهش یافته نسبت به آنزیم طبیعی تغییر محسوسی نداشت. احتمال می رود که در اثر حذف مارپیچ ?5، مولکول های هیدروفوبیک کمتر در معرض سطح قرار گرفته باشند و آنزیم در مواردی افزایش فعالیت از خود نشان داده است. به علاوه حدس زده می شود که جهش، جایگاه فعال آنزیم جهش یافته را تغییر داده باشد و توانایی هیدرولیز سوبستراهای با طول زنجیر هیدروکربنی بیشتر را ایجاد کرده باشد. در کل نتایج آزمایشات ثابت کرد که مارپیچ ?5 در ساختار لیپاز bacillus thermocatenulatus ضروری نبوده و حذف آن تاخوردگی کلی آنزیم را از بین نمی برد، به علاوه در مواردی باعث افزایش فعالیت نیز می-گردد که منجر به کاربردهای بیشتر این آنزیم در صنایع مختلف می شود. واژگان کلیدی: لیپاز، مهندسی پروتئین، مارپیچ ?5، ?/? هیدرولازها، bacilus thermocatenulatus، pichia pastoris

لیپازها یا تری آسیل گلیسرول هیدرولازها (ec. 3.1.1.3)، آنزیمهایی هستند که در صنایع گوناگون مانند غذا، دارو، تولید شوینده ها، و غیره کاربرد دارند. لیپازهای تولید شده توسط میکروارگانیسم های گرما دوست به دلیل پایداری در دماهای بالا، حلال های آلی و نیز phهای قلیایی, برای استفاده در صنعت مناسبترند. لیپاز btl2 مربوط به باکتری گرما دوست باسیلوس ترموکاتنولاتوس علی رغم این ویژگیهای مطلوب، دارای محدودیتهایی است که از آن جمله می توان به عدم توانایی در تجزیه سوبستراهای بزرگ اشاره کرد. افزایش فضا و کاهش ممانعت فضایی در جایگاه فعال، احتمالاً سبب تسهیل ورود سوبستراهای بزرگتر و در نتیجه باعث تغییر ویژگی سوبسترایی آنزیم خواهد شد. به این منظور، آمینواسید فنیل آلانین 17 که به سمت جایگاه فعال قرار گرفته و به دلیل زنجیره جانبی بزرگ خود، باعث کاهش فضا و افزایش ممانعت فضایی در جایگاه فعال شده است با آمینواسید کوچکتر آلانین جایگزین شد. سپس فعالیت آنزیم جهش یافته در حضور سوبستراهای مختلف و نیز اثر عوامل گوناگون مثل دما، ph، حلال های آلی، دترجنت ها و یون های فلزی بر فعالیت آنزیم بررسی شد. نتایج نشان داد که جهش اعمال شده، فعالیت آنزیم را در حضور همه سوبستراها به جز سوبسترای 14 کربنه، نسبت به آنزیم طبیعی افزایش داد ولی تغییر قابل ملاحظه ای در ویژگی سوبسترایی آنزیم ایجاد نشد. نتایج همچنین نشان داد که در حضور عوامل گوناگون، لیپاز جهش یافته در مقایسه با لیپاز طبیعی فعالیت بالاتری دارد ولی با این حال، مقایسه فعالیت لیپازهای طبیعی و جهش یافته نسبت به نمونه کنترل نشان داد که جهش تنها باعث افزایش پایداری حرارتی لیپاز شده است و در حضور عوامل دیگر، لیپاز جهش یافته پایداری کمتری در مقایسه با لیپاز طبیعی نشان می دهد. این نتایج نشان می دهد که با جایگزین شدن فنیل آلانین 17 با آلانین، ممانعت فضایی کاهش و به دنبال آن فضای جایگاه فعال افزایش یافته است که این امر احتمالاً سبب تسهیل ورود سوبسترا به جایگاه فعال شده است.

لیپازها خصوصاً لیپازهای با منشأ میکروبی، گسترده ترین گروه آنزیم هایی هستند که کاربردهای زیست -فناوری و شیمی آلی همچون کاربرد در صنایع غذایی، شوینده ها، صنایع دارویی، کشاورزی و... دارند. لیپازهای باکتریایی عضو خانواده ?/? هیدرولازها هستند که هیدرولیز و سنتز اسیل گلیسرول ها در حدفاصل آب-چربی را کاتالیز می کنند. بهبود ویژگی ها و فعالیت کاتالیتیک لیپازها به عنوان سومین آنزیم صنعتی دنیا جهت کاربردهای تجاری اهمیت زیادی دارد. مقایسه ساختار ?/? هیدرولازها و لیپازهای ژئوباسیلوسی نشان می دهد که جایگاه اتصال فلز zn2+ (?3 ،b1 و b2) تا کنون در تاخوردگی متعارف ?/? هیدرولازها دیده نشده است. این پژوهش به بررسی اثر حذف مارپیچ ?3 بر فعالیت لیپاز geobacillus thermocatenulatus (btl2) که لیپازی ترموآلکالوفیل است می پردازد. بدین منظور ابتدا مطالعات بیوانفورماتیکی و پیشگویی ساختمان جهت بررسی اثر حذف مارپیچ ?3 بر ساختمان و عملکرد لیپاز انجام شد. پیشگویی عملکرد لیپاز با حذف ناحیه ?3، افزایش فعالیت لیپاز در برابر سوبستراهای 4 تا 10 کربنه را نشان داد. سپس مارپیچ ?3 با روش soe-pcr از ژن لیپاز btl2 حذف شد، بیان ژن لیپاز جهش یافته در مخمر pichia pastoris و خالص سازی با روش کروماتوگرافی تعویض یونی انجام شد. بررسی فعالیت لیپاز جهش یافته نشان داد که حذف ناحیه ?3، فعالیت کلی لیپاز در حضور سوبسترای 4 کربنه (سوبسترای مطلوب این لیپاز) را 8/1 برابر (u/mg 13418)، در حضور سوبسترای 8 کربنه 2/2 برابر (u/mg 10974) و برای سوبسترای 18 کربنه 1/2 برابر (u/mg 3635) افزایش می دهد. ویژگی سوبسترایی به سمت هیدرولیز سوبستراهای بزرگتر تغییر یافت. محدوه فعالیت لیپاز جهش یافته در دماهای 50 تا 60 درجه سانتی گراد و ph 7 تا 10 افزایش یافت. پایداری دمایی لیپاز جهش یافته تغییر چندانی نداشت. یون-های فلزی mn2+ و k+ فعالیت نسبی لیپاز جهش یافته را افزایش دادند اما افزایش فعالیت لیپاز جهش یافته در حضور یون zn2+ بسیار قابل توجه بود در حالیکه یون zn2+ فعالیت لیپاز طبیعی را مهار کرد. فعالیت لیپاز جهش یافته در حضور یون های ca2+ و mg2+ همانند فعالیت لیپاز طبیعی بود و در حضور یون na+ فعالیت لیپاز جهش یافته تغییری نکرد. در حضور حلال های آلی غیر قطبی فعالیت لیپاز جهش -یافته افزایش یافت، اما اثر سورفکتانت ها بر فعالیت لیپاز جهش یافته، همانند لیپاز طبیعی بود. بنابراین از لیپاز جهش یافته می توان جهت کاربرد در بخش های مختلف صنعت استفاده کرد.

لیپازها آنزیم هایی هستند که هیدرولیز تری گلیسریدها را در حد فاصل آب و سوبسترا کاتالیز می کنند. لیپازهای ترموآلکالوفیل به دلیل داشتن ویژگی های منحصر به فرد از قبیل مقاومت به پروتئازها، دترجنت ها و سایر عوامل همراه با پایداری شدید آنها در دماهای بالا و حلال های آلی، از مهمترین کاتالیزورهای زیستی می باشند. لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس (btl2) نوعی لیپاز ترموآلکالوفیل است که در دمای 75-60 درجه سانتیگراد و ph برابر 10 -8 فعالیت می کند. این ویژگی ها باعث تبدیل این لیپاز به یک گزینه مناسب برای کارهای تحقیقاتی و همچنین کاربردهای صنعتی شده است. در این تحقیق، کل توالی پنتا پپتیدی (ala-his-ser-gln-gly) ناحیه زانوی هسته دوست لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس با توالی پنتا پپتیدی (gly-glu-ser-ala-gly) ناحیه مشابه از لیپاز قارچ کاندیدا روگوزا جایگزین شد. برای این منظور ابتدا جهش مورد نظر با استفاده از روش جهش زایی در محل در ژن btl2 ایجاد شد. در مرحله بعد لیپاز btl2 جهش یافته در باکتری e. coli کلون و در مخمر pichia pastoris به صورت یک پروتئین ترشحی بیان شد. در پایان فعالیت آنزیمی لیپاز طبیعی و جهش یافته در حضور سوبستراهای مختلف اندازه گیری شد. همچنین اثر عوامل مختلف از قبیل دما، ph، دترجنت ها، حلال های آلی و یونهای فلزی بر روی فعالیت آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدست آمده نشان داد که فعالیت آنزیمی لیپاز جهش یافته برای همه سوبستراهای بکاربرده شده به غیر از تری مریستین (14c) و تری پالمیتین (16c) بیشتر از آنزیم طبیعی می باشد، همچنین جهش ایجاد شده پایداری دمایی، و مقاومت آنزیم نسبت به عوامل بررسی شده از قبیل دترجنت ها، حلال ها و یونهای فلزی، را افزایش داده است.

لیپازها (تری آسیل گلیسرول آسیل هیدرولازها ec 3.1.1.3 ) هیدرولیز تری آسیل گلیسرول به اسیدهای چرب و گلیسرول را در حد فاصل لایه چربی و آب کاتالیز می کند.این آنزیم ها کاربردهای فراوانی در صنایع غذایی، کشاورزی، روغن، چوب و کاغذ، پزشکی و دارویی دارند. از مهمترین کاربردهای لیپاز استفاده در شوینده های خانگی برای از بین بردن لکه های چربی می باشد. لیپازهای باکتریایی نوترکیب بخش مهمی از تجارت آنزیم ها هستند. در این تحقیق لیپاز باکتریایی که قبلا" از یک باسیلوس پامیلوس( bacillus pumilus) بومی از خاک جداسازی و ژن مربوط به آن توالی یابی شده بود، در میزبان مخمری پیکیا پاستوریس(( pichia pastoris کلون و بیان شد. پس از تکثیر ژن لیپاز دارای توالی راهنمای باسیلوسی وبدون توالی راهنمای باسیلوسی (لیپاز بالغ) با روش pcr ، محصول pcr در وکتور pgem5zf کلون گردید. سپس ژن لیپاز از حامل کلونینگ خارج ودر حامل بیانی تحت کنترل دو پروموتر الکل اکسیداز و گلیسرآلدهیدفسفات دهیدروژناز کلون شده وسازه حاصل پس از تأیید کلونینک با روش های ملکولی و آنزیمی با روش الکتروپوریشن به درون مخمر بیانی پیکیا پاستوریس( pichia pastoris ) انتقال داده شد. بیان آنزیم لیپاز در محیط کشت بیانی تأیید آن با تست پارانیتروفنیل پالمیتات(pnpp ) و روش sds-page انجام شد. سپس برای بیان بهتر و بالای این آنزیم در مخمر، بهینه سازی قابلیت ترجمه پذیری کدون های ژن باسیلوسی براساس میزبان مخمری انجام و ژن بهینه به صورت مصنوعی ساخته شد و در درون ژنوم مخمر میزبان کلون وبیان شد.در نهایت میزان بیان این دو با هم مقایسه شد.

لیپازهای قلیاحرارت مقاوم در صنایع گوناگون کاربردهایی بسیاری دارند. در این مطالعه لیپاز قلیاحرات-مقاوم یک باکتری بومی enterobacter sp.bn12)) که از خاک پوششی مزارع پرورش قارچ خوراکی در اطراف تهران جداسازی شده، مورد بررسی قرار گرفت. ژن لیپاز (elbn12) از طریق کتابخانه ژنومی شناسایی گردید. بررسی قطعه بدست آمده از کتابخانه ژنومی، توالی کدکننده لیپازی را با وزن مولکولی پیش بینی شده kda 31 نشان داد. توالی پروتئینی لیپاز بدست آمده با لیپاز enterobacter sp.ag1 96% یکسانی داشت. لیپاز elbn12 به زیرخانواده i.1 لیپازهای باکتریایی تعلق دارد و جایگاه فعال آن از ser82، asp237 و his259 تشکیل شده است. لیپاز elbn12 در میزبان escherichia coli bl21 (de3) plyss تولید و سپس خالص سازی گردید. حداکثر فعالیت این لیپاز در?c 60 و درph 0/8 در حضور سوبسترای تری کاپریلین (c8) مشاهده شد و فعالیت ویژه آن در این شرایط u/mg 97/775±5106 بود ولی این لیپاز تنها 54% از فعالیت اولیه خود را پس از یک ساعت گرماگذاری در ?c 60 حفظ می کرد. به منظور افزایش پایداری حرارتی لیپاز elbn12، پنج جهش یافته از آن با جهش زایی در جایگاه های مشخص تهیه گردید. مطالعات بیوانفورماتیک و به دنبال آن بررسی های آزمایشگاهی برای بررسی اثر جهش ها انجام شد. تمامی این جهش یافته ها نیز در میزبان e. coli bl21 (de3) plyss تولید و سپس تخلیص شدند. دو جهش یافته k173a وq177a که از نظر موقعیت در سطح پروتئین قرار دارند، با افزایش پایداری حراراتی و همچنین فعالیت ویژه آنزیم همراه بودند. با این حال اعمال همزمان این دو جایگزینی در یک جهش یافته، اثر منفی در پایداری حرارتی داشت. جایگزینی اسیدهای آمینه هیدروفوب: ala و ile در جایگاه n106 که در فضای اتصال سوبسترا قرار دارد، با افزایش پایداری حرارتی همراه بود ولی فعالیت ویژه آنزیم را کاهش داد. بنابراین به نظر می رسد که آسپاراژین 106 برای ساختار یا عملکرد آنزیم ضروری است. لیپاز elbn12 و اکثر جهش یافته های آن در شرایط قلیایی پایدار بودند. این آنزیم ها پایداری خوبی را در حضور 50% (v/v) حلالهای آلی قطبی و غیرقطبی و همچنین در محلول 1% (w/v) دترجنت های غیریونی از خود نشان دادند. بعلاوه پایداری آنزیم های مورد بررسی در غلظت mm 10 یونهای فلزی به استثناء یونهای فلزات سنگین (zn2+ و fe3+) قابل توجه بود. edta هم در غلظت mm 10 تاثیر مهاری روی فعالیت هیچ یک از لیپازها نداشت. با نتایج بدست آمده می توان این طور نتیجه گیری کرد که جهش یافته های k173a و q177a از قابلیت های بیشتری برای استفاده در صنایع مختلف برخوردار هستند.

قارچ خوراکی منبعی غنی از پروتئین¬های لکتین و تایروزیناز می¬باشد. لکتین¬ها، پروتئین¬هایی غیرآنزیمی هستند که به طور اختصاصی و برگشت پذیر به بخش های کربوهیدراتی گلیکوپروتئین ها و گلیکولیپیدها، بدون این که ساختار کووالان لیگاند های گلیکوزیله را تغییر دهند، متصل می شوند. کاربرد لکتین ها در بیوحسگرها، تشخیص های اختصاصی، تخلیص ترکیبات قندی و مطالعات بیوشیمیایی قندها می¬باشد. تایروزیناز یک پلی فنول اکسیداز می¬یاشد. این آنزیم یکی از مهمترین آنزیم های مسیر سنتز ترکیبات پلی فنلی و ملانین است. اهمیت بالینی این آنزیم در سنتز ملانین و نقش آن در بیماری ویتلیگو می¬باشد. در صنعت نیز به عنوان آنزیم اصلی در مسیر تولید داروی l-dopa می¬باشد. با توجه به تحقیقات گذشته نشان داده شده که تایروزیناز و لکتین بواسطه داشتن اندرکنش با یکدیگر در طی فرایند تخلیص از یکدیگر تفکیک¬پذیر نبودند. در این مطالعه سعی بر این شد که با تغییر و بهبود شرایط حاکم بر مراحل استخراج، استفاده از حلال آلی جهت شستشو و رسوب¬دهی مرحله¬ای و در نهایت انتخاب ستون کروماتوگرافی مناسب شرایط لازم برای کاهش اندرکنش و تفکیک این دو پروتئین ایجاد شود. در نهایت نشان داده شد که ستون کروماتوگرافی غربالی سفادکس g-100 بهترین قدرت تفکیکی برای پروتئین-های حاصل از شستشوی متانولی و رسوب¬دهی دو مرحله¬ای توسط استن را دارا می¬باشد. همچنین با توجه به شواهد موجود بر اندرکنش این دو پروتئین، مطالعه¬ای قیاسی جهت بررسی میزان اثرگذاری لکتین بر کاهش نیروی هیدروالکترواستاتیک وارد بر آنزیم تایروزیناز و نتیجتاً میزان پایداری فعالیت تایروزیناز صورت گرفت که نشان دهنده تاثیر مثبت حضور لکتین بود.

لیپازها (تری اسیل گلیسرول اسیل هیدرولازها) هیدرولیز و ساخت استرهای تشکیل شده از گلیسرول و اسیدهای چرب دارای زنجیره های بلند را کاتالیز می کنند و در صنایع مختلف از قبیل صنایع غذایی، لبنی، شوینده، کاغذ سازی، چرم سازی، دارویی، کشاورزی و صنایع روغنی کاربرد دارند. در این تحقیق، کلونینگ و بیان ژن btl2 با توالی نشانه تاژک cs3 اشریشیاکلی انجام و با بیان ژن با توالی نشانه طبیعی مقایسه گردید. ژن btl2 از ژنوم باسیلوس ترموکاتنولاتوس توسط pcr جداسازی، کلون و با روش های استاندارد مهندسی ژنتیک تأیید شد. سپس با استفاده از آنزیم های ndei ، hindiii وsaci ژن مذکور از وکتور کلونینگ (ptz57r/t) جدا و مجدداً در وکتورهای بیانی pet21-a(+) و pet26-b(+)کلون و به e. coli سویه bl21(plyss) منتقل شد. بررسی پروتئین های سلولی بر روی ژل پلی آکریلامید (sds-page)، بیان شدن لیپاز حدوداً 42 کیلو دالتونی را تأیید و آنالیز پروتئینی و بررسی فعالیت لیپاز نوترکیب در مایع پری پلاسمی توسط آزمون pnpp حاکی از این بود که هر دو توالی نشانه قدرت پایینی برای ترشح پروتئین به فضای پری پلاسمی e. coli دارند، که یکی از دلایل آن را می توان بیان پروتئین به صورت اینکلوژن بادی مطرح کرد، بدین منظور مراحل خالص سازی و refolding بر روی اینکلوژن بادی انجام و با روش ph-stat و برادفورد به ترتیب فعالیت آنزیمی و میزان لیپاز محلول اندازه گیری شد.