چکیده: پایدار سازی پروتئین نسبت به حرارت توام با بهبود فعالیت، با در نظر گرفتن رابطه ی بین فعالیت و عملکرد تا حدی مشکل به نظر می رسد. zn-متالو پروتئازها از اعضای خانواده ی پروتئازهای همولوگ هستند که نسبت به مقاومت دربرابر حرارت وهضم خودبه خودی با یکدیگر متفاوت هستند. موتاسیون های (ala39? pro) و (thr63?phe)واقع بر سطح یک zn-متالوپروتئاز جدید از salinivibrio proteolyticus طراحی شد. دو جهش جدید توسط روش جهش زایی هدفمند ایجاد شده، سپس پارامتر ها ی بیوشیمیایی و سینتیکی، پایداری حرارتی و مقاومت در برابر autodegradation واریانت ها مورد بررسی قرار گرفت. واریانت ها در وکتور بیانی pqe-80l کلون شده بودند. حداکثر میزان بیان با دما ی ?c30، غلظت mm iptg1 و در محیط کشت lb به دست آمد. بعد از تخلیص آنزیم با ستون q-سفارز کروماتوگرافی، مقاومت در برابر حرارت و هضم خودبه خودی جهش یافته ها مورد بررسی قرار گرفت. جهت بررسی اثرات ساختاری موتاسیون ها، طیف سنجی فلورسانس ذاتی و دورنگ نمایی دورانی در محدوده ماورای بنفش دور، به ترتیب به عنوان شاخص های ردیابی ساختار ها ی سوم و دوم مورد استفاده قرار گرفت. در این جهش یافته ها مقاومت در برابر هضم خودبه خودی و پایداری حرارتی تا حدودی نسبت به آنزیم وحشی افزایش داشت. همچنین پارامتر های سینتیکی نیز نسبت به آنزیم وحشی تا حدودی تغییر یافته بودند. کلمات کلیدی: مهندسی پروتئین، هضم خود به خودی، متالو-پروتئاز ها و طیف سنجی

در پژوهش حاضر، سه گونه باکتریایی بیمارگر erwinia carotovora، xanthomonas axonopodis و streptomyces turgidiscabies به منظور یافتن پکتیناز خارج سلولی که توانایی شکست پکتین مرکبات با درجه استریفیه بالا را دارد، مورد بررسی قرار گرفت. در این میان، گونه xanthomonas axonopodis دارای بهترین فعالیت پکتینازی می باشد. بهینه سازی شرایط کشت نشان داد که این باکتری در محیط حاوی1/0% پکتین مرکبات، 1% پپتن، 1%yeast extract در دمایc° 30با 7ph و rpm 180در روز پنجم (u/ml0.64) بهترین فعالیت آنزیمی را دارد. آنزیم تخلیص شده، بوسیله تلفیقی از دو ستون کروماتوگرافی تعویض یونی deae-cellulose و sephacryl s-200 gel filtration خالص گردید. این آنزیم یک پکتیناز دیمر با وزن مولکولیkda 104 به کمک gel filtration و kda 56 به کمکsds-page می باشد. آنزیم پلی متیل گالاکتوروناز فعالیت بهینه خود را در oc 60 و 6 ph با vmax و km به ترتیب µmol/min 066/0 وmg/ml 51/2 پکتین به عنوان سوبسترا انجام می دهد. آنزیم در طیف وسیعی از ph (9-5) و دمای بالا (تا oc 90) پایدار است. حضورmm 5 از یون هـای +ca2+, cu2+, mg2+,mn2 و+ co2 به شکل مشخص باعث افزایش فعالیت و حضور hg2+ و fe2+ فعالیت را به شدت کاهش می دهد. از آنجایی که edta اثری مهاری بر روی فعالیت پکتینازی آنزیم نشان می دهد، می توان گفت که آنزیم به فلز برای فعالیت خود وابسته است. در مجموع، بر اساس ویژگی های این پکتیناز از جمله اسیدی بودن و مقاومت بالای دمایی آن، پیشنهاد می شود که این آنزیم می تواند یک انتخاب مطلوب برای آبگیری و شفاف سازی در صنایع تولید آبمیوه، خصوصاً مرکبات باشد.

از آنجائیکه ترکیب هتروسیکل نیتروژن دار کربازول درصد بالایی از محتوای نیتروژنی نفت را تشکیل می دهد، و از طرفی از این ترکیب در تولید رنگ، پلاستیک و دارو استفاده می شود و با توجه به اثرات منفی حضور این ترکیب در صنعت پالایش و محیط زیست، این ترکیب به عنوان ترکیب مدل جهت جداسازی باکتری با قابلیت کاهش ترکیبات نیتروژن دار از نفت یا قابلیت حذف این ترکیب از محیط زیست مورد استفاده قرار گرفت. با نمونه برداری از محیط های مختلف آلوده به ترکیبات نفتی و رشد میکروارگانیسمهای موجود در محیط کشت مینیمال، یک گونه جدید با قابلیت استفاده از کربازول به عنوان منبع کربن، نیتروژن و انرژی جداسازی گردید. مطالعات مورفولوژیکی و تعیین توالی ژن16s rrna صورت گرفته بر روی گونه جداسازی شده نشان داد که این گونه متعلق به جنسachromobacter می باشد و تحت عنوان achromobacter sp. strain car1389 نامگذاری شد. توالی حاصل در پایگاه اطلاعات توالی نوکلئوتیدی تحت شماره hq832894.1 ثبت گردید. آزمایشات تکمیلی بررسی اثر دما و غلظت اولیه کربازول در محیط کشت باکتری مشخص نمود که achromobacter sp. car1389 قادر به حذف بیش از 90% کربازول 6 میلی مولار در دماهای 25، 30 و 37 درجه سانتی گراد می باشد. بیشترین میزان تجزیه کـربازول نیز در غلظت اولیه برابر با mm6 این ترکیب دیده شد. در این پژوهش حدواسط های تولید شده در مسیر تجزیه کربازول با استفاده از tlc و دستگاه gc mass بررسی گردید. این نتایج نشان داد که باکتری achromobacter sp. car1389 را می توان به عنوان سویه ایی مناسب در زیست پالایی مناطق آلوده به کربازول معرفی نمود.

svp2 یک آنزیم خارج سلولی است که از باکتری سالینو ویبربو پروتئولیتیکوس جدا شده است. این پروتئین به صورت پری پروپروتئین بیان می شود و شامل 4 دمین می باشد. سیگنال پپتید (23 اسید آمینه)، پروپپتید انتهای آمین (177 اسیدآمینه)، بخش کامل (313 اسید آمینه)، پروپپتید انتهای کربوکسیل (100 اسیدآمینه). چندین نقش برای هر منطقه ی این زیموژن گزارش شده است. در این مطالعه، هدف بررسی نقش دقیق عملکردی ناحیه ی انتهای آمین svp2 بر فعال سازی و پایداری این آنزیم می باشد. سه فرم از آنزیم ذکر شده را کلون کرده که شامل فرم کامل و فعال آنزیم، فرم بدون سیگنال پپتید (pro-svp2) و فرم بالغ mature) ، بدون سیگنال پپتید و پروپپتید) می باشد. فعالیت کازئینولیتیک این سه فرم در حالت های خارج سلولی و داخل سلولی(حالت محلول و نامحلول) نشان داد. اگرچه همانطور که انتظار داشتیم سیگنال پپتید در ترشح آنزیم نقش اساسی دارد اما برخلاف گزارشات قبلی در مورد پروتئازهای مشابه ترمولایزین، پروپپتید انتهای آمین برای تاخوردگی پروتئین ضروری نمی باشد. نتایج نشان می دهد که پروپپتید فعالیت فرم بالغ و پری پلاسمیک svp2 را در حالت سیس و ترانس مهار می کند. در حقیقت، svp2 بالغ به وسیله پروپپتید انتهای آمین در یک روش نامشخص مهار می شود.

تولید میکروبی نانوذرات یک تکنولوژی پاک محسوب می شود که از تلفیق بین نانوتکنولوژی و بیوتکنولوژی میکروبی ایجاد شده است. تولید میکروبی نانوذرات منجر به تولید ذراتی با ساختار و خصوصیات قابل کنترل، محلول در آب و زیست سازگار می شود. از این رو در این مطالعه سعی شد که توانایی تولید نانوذرات طلا و نقره به صورت خارج سلولی از یک سویه ی باکتریایی گرم مثبت مقاوم به فلزات، جدا شده از معدن مس سرچشمه کرمان مورد بررسی قرار گرفته و شرایط بهینه برای تولید حداکثر نانوذرات با خواص کنترل شده، ارائه شود. مطالعات اسپکتروسکوپیuv–visible و میکروسکوپ الکترونی tem نشان داد که نانوذرات طلا و نقره تولید شده توسط این سویه، کروی و اندازه ای در حدود 30-10 نانومتر دارند. مطالعه ی پراش اشعه ایکس(xrd) از نمونه ی نانوذرات نشان داد که جنس این ذرات ag(0) و au(0) می باشد. همچنین مطالعه ft-ir از نمونه نانوذرات نشان داد که گروه عاملی آمیدی در احیای یونهای فلزی دخیل است. همچنین در این پژوهش سعی شد نانوذرات مس برای اولین بار توسط یک گونه باکتریایی گرم مثبت مقاوم به مس بصورت خارج سلولی در حضور باکتری تولید شود. مطالعات میکروسکوپ الکترونی tem نشان داد که نانوذرات مس بیوسنتز شده دارای شکل کروی هستند و میانگین اندازه ی ذرات کمتر از 10 نانومتر است. بررسی پراش اشعه ی (xrd)xاز نمونه ی محلول حاوی نانوذرات نشان داد که جنس این ذرات (0) cu است. همچنین مطالعه ft-ir از نمونه نانوذرات نشان می داد که گروه پپتیدی در احیای یونهای فلزی دخیل می باشند. رشد باکتری در غلظت های سمی و بالای مس نشان دهنده مقاومت مناسب این سویه باکتریایی به مس و قابلیت زیست پالایی آن می باشد.

علم محاسبات زیستی به عنوان یک علم بین رشته ای ما بین رشته های زیست شناسی مولکولی، شیمی، علوم کامپیوتر، ریاضیات و آمار به وجود آمد. این رشته اولین بار توسط لئونارد آدلمان در سال 1994 معرفی شد. وی نشان داد dna میتواند مسائل کلاس np را حل نماید. در این تحقیق از dna به عنوان ابزاری برای حل مساله کوتاهترین مسیرمابیندو راس ازیک گراف جهت دار به کار گرفته شده است. متد حل به این صورت است که به وسیله بعضی از تکنیک های رایج در علم زیست شناسیابتدا تمام مسیرهای ممکن را تولید کرده و سپس dna های هدف را جداسازی مینماییم. اگرچه این مساله ترکیبی در کامپیوتر به علت افزایش شدید تعداد مسیرهای بالقوه غیر ممکن میشود، اما در علم محاسبات زیستی به دلیل موازی کاری فوق العاده زیاد، خیلی مهم نیست. در این تحقیق متد رمزنگاری کردن بر اساس اختلاف بین وزن ها و میانگین آنها، به کار گرفته شده است. متد های به کار گرفته شده در تحقیقات پیشین از نواقصی همچون عدم صرف اقتصادی برای پیاده سازی، عدم مناسب بودن متد برای وزن های بزرگ و زمان بر بودن و عدم حل صحیح مساله در مواردی خاص رنج می بردند. متد پیشنهاد شده در این تحقیق ضمن ارائه روشی جدید سعی بر رفع نواقص ذکر شده را دارد.

در پژوهش حاضر، تولید یک پروتئاز خارج سلولی از باکتری مقاوم به شرایط اسیدی و توانایی ایجاد لخته در شیر مد نظر بود. باکتری از مناطق با خاک های اسیدی جداسازی گردید و آنالیز 16s rrna نشان داد که باکتری مورد نظر از جنس serratia می باشد. serratia sp. strain sr1 در محیط tsb (5/5ph~)، دمای ?c30 و rpm 180 کشت داده شد و پس از 72 ساعت بالاترین میزان ترشح پروتئازی را از خود نشان داد. آنزیم توسط آمونیوم سولفات 75% اشباع و ستون های کروماتوگرافی تعویض یونی sp-sepharose و ژل فیلتراسیون sephacryl s-200 خالص سازی گردید. پروتئاز مورد نظر به میزان 38/9 برابر محیط کشت اولیه با بازده 15% خالص و دارای فعالیت ویژه u/mg 3-10×25/99 بر روی bsa می باشد.sds-page نشان داد که وزن مولکولی ظاهری آنزیم حدود 45 کیلودالتون است. ph و دمای بهینه ی آنزیم به ترتیب 0/4 و ?c 45 می باشد و در دمای ?c 50، 60% از فعالیت پروتئازی خود را از دست می دهد. kmو vmaxاین آنزیم به ترتیب µm 06/62 و µm/s 029/0 می باشد. پروتئاز مورد نظر توسط edta مهار می شود ولی نسبت به دیگر مهار کننده های اختصاصی پروتئازها مقاوم می باشد و می توان آنرا به عنوان یک متالوپروتئاز معرفی نمود. آنزیم دارای توانایی ایجاد لخته در skim milk می باشد و این توانایی در حضور غلظت های بالاتر از 2 میلی مولار کلرید کلسیم افزایش می یابد. آنزیم در دماهای بالاتر از ?c 40 توانایی خود را در ایجاد لخته از دست می دهد که بواسطه ناپایداری ساختاری آنزیم می باشد. الگوی آبکافت شیر بر روی sds-page نشان می دهد که این آنزیم توانایی آبکافت کازئین های شیر را دارا می باشد. همچنین پنیر تولید شده توسط این آنزیم از لحاظ بافتی و طعم در مقایسه با نمونه تجاری مناسب بنظر می رسد. در مجموع، پروتئاز استخراج شده از سویه sr1 با آبکافت آلفا و بتا کازئین و به طور مشخص کاپا کازئین توانایی بر هم زدن ساختار میسل های کازئینی و ایجاد لخته در شیر را دارد. همچنین دارا بودن بهینه ی فعالیت در ph اسیدی، پایداری دمایی پایین، تسهیل ایجاد لخته در اثر افزودن cacl2 و عدم ایجاد مزه ی تلخ در پنیر تولیدی نیز از خصوصیات ویژه ی این آنزیم می باشد، که آن را به عنوان جایگزین مناسبی برای کیموزین مطرح می کند.

در روش ازدیاد برداشت میکروبی نفت، از میکروارگانیسم ها و فعالیت های متابولیکی آن ها مثل تولید بیوسورفکتانت ها در بازیافت نفت بهره گرفته می شود. این شیوه نسبت به سایر رو شهای ازدیاد برداشت نفت دارای مزیت های منحصر بفردی از جمله هزینه ی پایین و سازگاری بسیار خوب با محیط زیست می باشد. در پژوهش حاضر با فرض اینکه برخی از باکتری های موجود در نفت خام و یا خاک های آلوده به ترکیبات نفتی قادر به تولید بیوسورفاکتانت هستند، نمونه گیری از نفت خام برخی مخازن نفتی و خاک های آلوده منطقه برای جستجوی باکتری تولید کننده بیوسورفاکتانت انجام و پس از استخراج گونه های مختلف باکتری، انجام آزمایشات بررسی پتانسیل تولید بیوسورفکتانت و خصوصیات عملکردی آن جهت انتخاب مناسب ترین گونه ی باکتریایی انجام گرفت. سپسبهینه سازی تولید بیوسورفکتانت توسط باکتری با تغییر شرایط فیزیکی و شیمیایی محیط کشت مورد مطالعه قرار گرفت. شناسایینوع بیوسورفکتانت تولید شده و محتوای بیوشیمیایی آن به کمک تکنیک های ftir، tlc، gc-ms و nmr مورد بررسی قرارگرفت و نتایج اولیه حاکی از محتوای لیپوپپتیدی بیوسورفکتانت مورد نظر است. همچنین محیط و شرایط رشد باکتری در استفاده از منابع ارزان قیمت بهینه سازی شد. نتایج نشان داد که بالاترین میزان تولید این بیوسورفکتانت در غلظتهای 5 % ملاس چغندر قند، 8/0 % آمونیوم نیترات در دمای oc 30 و ph برابر با 0/9 حاصل شد.

در پژوهش حاضر ژن smp کد کننده یک پروتئازاسیدی با استفاده از تکنیک pcr از سویه بومی 1390 f serratia sp. strain جداسازی و در باکتری e. coli کلون گردید. ابتدا برپایه توالی dna متالوپروتئازهایی از سراشیا e-15 و sm6، پرایمر مناسب طراحی و ژن smp تکثیر گردید. سپس این قطعه 1515 جفت بازی در حامل petblue-2 وارد و در باکتری e. coli کلون گردید. آنالیز توالی ژن smp یک ژن متالوپروتئازی با طول 504 اسید آمینه را نشان داد .به منظور افزایش بیان پروتئاز، قطعه کامل ژن smp در وکتور بیانی pet 22b که حاوی پروموتور t7می باشد،کلون گردید و به داخل سلول های bl21(de3) انتقال یافت. اگرچه یک توالی نشانه در ژن کلون شده وجود دارد اما پس از القاء e.coli حاوی پلاسمید نوترکیب با iptg، هیچ فعالیت پروتئازی در محیط کشت باکتری مشاهده نشد. آزمایشات تکمیلی نشان داد که پروتئاز smp تنها در فراکشن داخل سلولی باکتری نوترکیب مشاهده می گردد. انجام آزمایشات بررسی خصوصیات بیوشیمیایی بر روی عصاره آنزیمی نشان داد که پروتئاز smp نوترکیب ph و دمای بهینه ی به ترتیب 0/5 و ?c 40 را دارا می باشد که در مقایسه با فرم وحشی آنزیم کمی متفاوت است. این آنزیم به شدت توسط edta 5 میلی مولار مهار می شود و بنابراین همانند پروتئازهای خانواده serralysin جزء متالوپروتئازها طبقه بندی می گردد. مطالعه عملکرد لخته کنندگی شیر پروتئاز نوترکیب نیز قابلیت مناسب این آنزیم را در تولید پنیر نشان می دهد.