کاندیدا آلبیکنس مقاوم به فلوکونازول عامل کاندیدیازیس دهانی در بیماران با نقص سیستم ایمنی می باشد. هدف این مطالعه ارزیابی حساسیت و ردیابی ژن های مقاومتی (1mdr ، 1cdr) نسبت به داروی فلوکونازول در ایزوله های بالینی کاندیدا آلبیکنس جدا شده از بیماران ایدزی می باشد. در شرایط آزمایشگاهی حساسیت 66 ایزوله بالینی کاندیدا آلبیکنس نسبت به فلوکونازول ارزیابی شد. حساسیت به داروی فلوکونازول با استفاده از مایکرودایلوشن براث و دیسک دیفیوژن مطابق روش clsi انجام شد. از 66 ایزوله کاندیدا آلبیکنس تست شده با روش تعیین حساسیت دیسک دیفیوژن به ترتیب 45 ایزوله (% 18/68) حساس، 5 ایزوله (% 58/7) وابسته به دوز و 16 ایزوله (% 24/24) مقاوم به فلوکونازول بودند، در حالیکه با روش مایکرودایلوشن براث 43 ایزوله (% 15/65) حساس، 8 ایزوله (% 12/12) وابسته به دوز و 15 ایزوله (% 73/22) مقاوم به فلوکونازول تعیین گردید. مکانیسم مولکولی مقاومت به داروهای آزولی در کاندیدا آلبیکنس شامل بیان بیش از اندازه ژن های پمپ انتشار (1mdr ، 1cdr) و تغییرات در آنزیم هدف می باشد. در این مطالعه آنالیز مولکولی برای تمامی ایزوله ها انجام شد. rna تمامی ایزوله ها استخراج و cdna آنها سنتز شد. سپس با استفاده از پرایمر های 1mdr ، 1cdr و 1act،pcr rt- انجام شده و آنالیز شدت باند ها با استفاده از نرم افزار تعیین گردید. بیان بیش از اندازه ژن های 1mdr و 1cdr به ترتیب برای 2 و 8 ایزوله کاندیدا آلبیکنس تعیین گردید. درصد فراوانی برای بیان بیش از اندازه ژن 1mdr و 1cdr به ترتیب% 03/3 و %12/12 درصد می باشد.

امروزه قارچهای بیماریزای فرصت طلب جزء عفونت های تهدید کننده زندگی در بیماران با نقص سیستم ایمنی می باشند. بیماری های قارچی در بیماران ایدزی اغلب به صورت کاندیدیازیس دهانی حلقی تظاهر می یابد وعوامل ایجاد کننده آن از قارچهای مخمری کاندیدایی می باشد که شایعترین آنها کاندیدا آلبیکنس است.کاندیدیازیس دهانی از عفونت های شایع در بیماران ایدزی است واز اولین یافته های بالینی ویروس hiv می باشد.درمان توسط عوامل ضد قارچی آزولی بویژه فلوکونازول به عنوان راه کاری موثر جهت درمان عفونت های ناشی از مخمر کاندیدا آلبیکنس معرفی می شود،اما بروز مقاومت های دارویی این روش درمان را با مشکلات جدی روبرو ساخته است.لذا شناسایی گونه های مقاوم به عوامل ضد قارچی جهت درمان کارآمد وجلوگیری از مصرف بی رویه داروها بسیارضروری می باشد. هدف از این مطالعه شناسایی گونه های مقاوم به فلوکونازول در کاندیدا آلبیکنس های بومی جداشده از ضایعات دهانی افراد ایدزی با روش های فنوتیپی و مولکولی rt-pcr با تاکید بر دو ژن عامل مقاومت به داروی فلوکونازول( cdr2و(erg11 می باشد.در این مطالعه جهت تایید نمونه های مورد بررسی، ابتدا از کشت نمونه ها برروی محیط کروم آگارکاندیدا،آزمایش های کلامیدوسپور و لوله زایا استفاده شد.با روش دیسک دیفیوژن میزان حساسیت ایزوله ها به فلوکونازول تعیین گردید.پس از استخراج rna و تبدیل آن به cdna با پرایمرهای اختصاصی ژن های cdr2وerg11 واکنش rt-pcr انجام شد.پس از انجام الکتروفورز محصول pcr، الگوی باندهای حاصله با الگوی باندهای حاصل از گونه های استاندارد حساس ومقاوم به فلوکونازول بررسی وجهت اندازه گیری میزان بیان ژنerg11 ، نسبت این ژن به house keeping act1 توسط نرم افزار uvitec analyze محاسبه گردید. با استفاده از روش دیسک دیفیوژن 18/68% نمونه ها حساس،58/7% وابسته به دوز و24/24% مقاوم به فلوکونازول بودند.در تمامی روش های ژنوتیپی نقطه هدف (dna یاrna) از تغییر ناپذیری بالایی برخوردارند،امروزه تکنیک های مولکولی به علت حساسیت بالا بسیارمورد توجه می باشند، با بررسی نمونه ها توسط روش rt-pcr، 4 ایزوله دارای بیان ژن cdr2 و6 ایزوله دارای بیان بیش از اندازه ژن erg11 بودند. شیوع عفونت های کاندیدایی ومتعاقب آن درمان توسط عوامل ضد قارچی به خصوص ترکیبات آزولی ومقاومت نسبت به این ترکیبات، ضرورت استفاده از روش های تعیین حساسیت دارویی را بیش از پیش آشکار ساخته است. به هر حال مطلوب آن است که از روش های فنوتیپی مانند دیسک دیفیوژن که هزینه کمتری داشته همراه با روش های ژنوتیپی مانند rt-pcr که امکان بررسی مکانیسم های مقاومت دارویی و ژن های دخیل درآن را ایجاد می کند، استفاده شود.

شترسانان در سرمشان نوع خاصی از ایزوتیپ igg را دارا می باشند که به علت نداشتن زنجیره سبک، آنتی بادی زنجیره سنگین hcab نام گذاری شده اند. بخش متغیر این نوع آنتی بادی(vhh)، دارای ویژگی های منحصر به فردی است که منجر به کاربرد وسیع آن در بیوتکنولوژی شده است. در این مطالعه هدف انتخاب vhh با اختصاصیت بسیار بالا علیه زیرواحد urec آنزیم اوره آز هلیکوباکترپیلوری می باشد. هلیکو باکتر پیلوری یک باکتری گرم منفی است که درلایه مخاطی معده انسان لانه گزینی و ایجاد عفونت می کند. عفونت هلیکوباکترپیلوری با بیماری هایی همچون زخم معده یا دوازدهه و برخی سرطان ها همراه است. باکتری با تولید آنزیم اوره آز ، اوره را به آمونیاک ودی اکسیدکربن تبدیل می کند. آمونیاک تولید شده اسید گاستریک را خنثی و از این طریق امکان کلونیزاسیون باکتری را در معده فراهم می کند. از آنجا که در سرم همه ی بیماران مبتلا به هلیکوباکترپیلوری آنتی بادی علیه زیرواحد urec، آنزیم اوره آز دیده شده است بنابراین یکی از گزینه های مناسب جهت درمان، تولید آنتی بادی بر علیه urec می باشد. بدنبال تزریق urec نوترکیب به شتر و حصول اطمینان از ایمن شدن آن، کتابخانه فاژمیدی تهیه شد. جهت نمایش فاژی پروتئینvhh ، سلولهای حاوی کلون با فاژ کمکی m13k07 آلوده شدند و فاژهای نوترکیب با استفاده از پلی اتیلن گلیکول و کلرید سدیم 5/0 مولار رسوب داده شدند. جهت انتخاب کلونهای صحیح پنج مرحله غربالگری انجام شد. پس از انتخاب بهترین مرحله غربالگری با استفاده از فاژ الیزا، بروی کلونهای مربوط به آن مرحله مجددا فاژ الیزا گذاشته شد و کلونهایی با بیشترین میزان جذب جهت بیان پروتئین در فاز محلول انتخاب شدند. این اولین گزارش از انتخاب، تولید و بیان نانو بادی علیه آنتی ژن urec می باشد. شباهت بسیار زیاد vhh با vh های انسانی، امکان استفاده در ایمنی درمانی را فراهم می کند.

مسمومیت غذایی ناشی از سموم کلستریدیوم بوتولینیم یکی از کشنده ترین مسمومیتهای شناخته شده می باشد. لذا تشخیص به موقع و درمان آن می تواند از اهمیت ویژه ای بخصوص در کشورهای جهان سوم برخوردار باشد. آنتی بادی های زنجیره سنگین شتری یا همان نانوبادی ها به دلیل خواص ویژه خود مانند ثبات، حلالیت بالا، محلول بودن در آب، تحمل گرمایی بالا و... کاربردهای زیادی در بیوتکنولوژی پیدا کرده-اند. با توجه به خصوصیات ویژه این آنتی بادی ها می توان از آنها برای شناسایی و درمان مسمومیتهای ناشی از سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع e استفاده نمود. هدف تولید نانوبادی شتری بر علیه بخش اتصال دهنده سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع e که بطور موثری سم مورد نظر شناسایی و خنثی نماید. روش بخش اتصال دهنده سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع eبه صورت نوترکیب تولید و به شتر تزریق شد. میزان ایمنی شترها توسط الایزا مورد آزمایش قرار گرفت. بعد از خونگیری، لنفوسیتها جداسازی و rna تام آنها تخلیص و به cdna تبدیل شد. تکثیر ژنهای نانوبادی با nested pcr انجام و ژنهای بدست آمده در وکتور فاژمیدی مناسب قرار داده شد. و بعد از چند بار تکرار این مرحله کتابخانه ژنی با غنای کافی بدست آمد. غربالگری کتابخانه علیه سم مورد نظر در پنج مرحله صورت گرفت و بعد از مرحله پنجم 20 کلنی انتخاب و به وسیله الایزا یک کلنی با تمایل زیاد به آنتی ژن مورد نظر انتخاب گردید. نتیجه نتایج الایزا حاکی از آن است که نانوبادی تولید شده در این تحقیق تمایل زیادی به آنتی ژن مورد نظر نشان داده و می توان از آن برای تشخیص و درمان سم کلستریدیوم بوتولینیم نوع e استفاده کرد.

شتر ها قادر به تولید آنتی بادی هایی فاقد زنجیره سبک می باشند و قطعات حاصل از انتهای آمین این آنتی بادی ها vhh یا نانوبادی نام داشته و دارای توانایی کامل اتصال به آنتی ژن می باشند. برخی از مزایای نانوبادی ها قابلیت تولید آسان و انبوه آن ها در میکروارگانیسم ها و توانایی استفاده از آن ها در سیستم هایی از قبیل نمایش فاژی، مخمری یا ریبوزومی می باشد. هدف این پژوهش تهیه نانوبادی هایی با قابلیت اتصال به لیپوپلی ساکارید باکتری ویبریو کلرا اینابا o1 با استفاده از سیستم نمایش فاژی می باشد. به این منظور پس از جداسازی لنفوسیت ها از خون شتر غیر ایمن، rna تخلیص و با استفاده از پرایمر های oligo dt بهcdna تبدیل شدند. قطعات کد کننده vhh توسط nested pcr تکثیر شده و پس از هضم توسط آنزیم اندونوکلئاز sfii به فاژمید pcomb3x الحاق شدند. فاژمید های نوترکیب با استفاده از الکتروپوریشن به باکتری e.coli tg-1 منتقل گردیده و جهت آزادسازی آن ها هنگامی که od600 به 7/0 رسید توسط فاژ های کمکی m13k07 آلوده شدند. فاژ های مورد نظر توسط panning با استفاده از لیپوپلی ساکارید باکتری ویبریو کلرا اینابا o1 به عنوان آنتی ژن جدا شدند. پس از انتقال آنتی بادی جدا شده به فاز محلول، قابلیت اتصال، اختصاصیت و تمایل آن به آنتی ژن مورد نظر و همچنین باکتری ویبریو کلرا اینابا o1 توسط لکه گذاری وسترن و الایزا مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدست آمده بیانگر اتصال اختصاصی این آنتی بادی به لیپوپلی ساکارید باکتری ویبریو کلرا اینابا o1 و همچنین باکتری ویبریو کلرا اینابا o1 بود.

مقدمه، سرطان پروستات شایع ترین سرطان موجود در مردان می باشد. استفاده از آنتی بادی در درمانهای انتخابی سرطان بسیار مورد توجه است. مهمترین فاکتور در درمان یا تشخیص، یافتن آنتی ژن های اختصاصی سرطان می باشد. آنتی ژن psma با توجه به افزایش آن در سرطان پروستات، گزینه مناسبی جهت آنتی بادی درمانی می باشد. نوع خاصی از آنتی بادی های شتری که vhh نام دارد، با توجه به کوچکی اندازه، دارای مزایای بسیار زیادی در کاربرد های کلینیکی می باشد. پس از تهیه کتابخانه های فاژی حاوی نانو بادی توسط تکنیک نمایش فاژی و غربالگری آنها، نانوبادی اختصاصی با افینیتی بالا بر علیه آنتی ژن مورد نظر به دست می-آید. هدف از این مطالعه طراحی و تولید یک اپی توپ از آنتی ژن psma، تهیه کتابخانه فاژی ایمن حاوی نانوبادی های شتری، غربالگری کتابخانه فاژی بر علیه آنتی ژن psma و در نهایت تولید نانوبادی (vhh) مونوکلونال اختصاصی بر علیه آنتی ژن psma می باشد. روش، آنتی ژن psma پس از کلون و بیان، به شتر تزریق شد. پس از تخلیص لنفوسیت های شتری و جداسازی rna، cdna ساخته شد. با انجام دو واکنش pcr متوالی، ژنهای vhh جدا گردید. ژنهای نانوبادی وارد وکتور فاژمیدی شد و پس از قرار دادن در میزبان مناسب، توسط فاژ کمکی آلوده گردید. بدین ترتیب کتابخانه فاژی حاوی نانوبادی ایجاد شد. این کتابخانه جهت به دست آوردن نانوبادی با افینیتی بالا، 5 مرحله غربالگری شد. پس از انجام فاژ الایزا، چند کلونی انتخاب و نانو بادی به صورت محلول تولید شد. جهت افزایش تولید نانوبادی، ژن vhh وارد وکتور بیانی pet28a شد. در نهایت میزان تمایل و اختصاصیت نانوبادی اندازه گیری شد. نتیجه و بحث، بیان آنتی ژن psma توسط الکتروفورز و وسترن بلات، و ایمن شدن شترها توسط الایزا تایید شد. تکثیر ژنهای vhh توسط الکتروفورز تایید شد. همچنین تایید کتابخانه ژنی توسط واکنش کلونی pcr انجام شد. وجود فاژهای نمایش دهنده نانوبادی نیز توسط الایزا بر علیه psma به تایید رسید. تولید نانوبادی نوترکیب نیز توسط الکتروفورز و وسترن بلات به تایید رسید. میزان تمایل نانوبادی بر علیه psma نوترکیب 8-10 × 7/5 محاسبه گردید. در نهایت با توجه به افینیتی و اختصاصیت بالای نانوبادی تولیدی، میتوان به این محصول به عنوان یک ابزار تشخیصی در سرطان پروستات امیدوار بود.

چکیده : اسینتوباکتر بومانی یک پاتوژن بیمارستانی، که عامل عفونت های متعددی از جمله عفونت های تنفسی،باکتریمی، مننژیت و عفونت دستگاه ادراری است . تمایل گونه های بیمارستانی این باکتری به تولید بیوفیلم و ارتباط بیوفیلم با عفونتزایی و مقاومت این باکتری به طیف وسیعی از آنتیبیوتیکها، بهخوبی شناخته شده است . در این تحقیق بر آن شدیم، نانو بادی مشتق از آنتی بادی های تک دومینی نوترکیب شتری علیه 136 شامل واحدهای تکراری - قطعه حفاظت شده 1119 نوکلئوتیدی از موقعی 1316 a3b3a4b4c2 ازآنتی ژن bap در اسینتو باکتر بومانی تولید کنیم. برای این منظور به دنبال تزریق constract b-bapنوترکیب به شتر و حصول از ایمن شدن آن،کتابخانه فاژمیدی تهیه شد. برای نمایش فاژی vhh ، سلولهایحاوی کلون با فاژ کمکی m13ko7 آلوده شدند و فاژهای نوترکیب با استفاده از پلی اتیلن گلیکول و کلرید سدیم 3 1 مولار رسوب داده شدند. جهت انتخاب کلونهای صحیح شش مرحله غربالگری انجام شد. پس از انتخاب بهترین مرحله ی غربالگری با استفاده از فاژ الیزا روی کلونهای مربوط به آن مرحله مجددا فاژ الیزا گذاشته شد و کلونهایی با بیشترین مقدار جذب، جهت بیان پروتئین در فاز محلول انتخاب شدند. این اولین گزارش از انتخاب ، تولید و بیان نانوبادی علیه آنتی ژن bap میباشد . مقاومت فزاینده و نقش مهم آنتی بادی ها در تشخیص و درمان بیماریها و همچنین شباهت بسیار زیاد vhh با vh های انسانی امکان استفاده این نانوبادی را در ایمنی درمانی را فراهم میکند.

چکیده مخمر پیکیا پاستوریس یک میزبان برجسته برای تولید پروتئین های نوترکیب است و در مقایسه با دیگر سیستم های بیانی مزایای فراوانی دارد. از جمله اینکه این سیستم به عنوان یک یوکاریوت، قادر است تعداد زیادی از تغییرات پس از ترجمه همچون پردازش پروتئولتیک، فولدینگ صحیح، تشکیل پیوند های دی سولفیدی و گلیکوزیلاسیون پروتئین ها را انجام دهد. همچنین قادر به استفاده از متانول به عنوان تنها منبع کربن در غیاب گلوکز و ترشح پروتئین های تولید شده به محیط می باشد. با وجود این مزایا پیکیا پاستوریس می تواند یک جایگزین عالی برای سیستم بیانی اشرشیا کلی باشد. در این پژوهش، آنتی بادی زنجیره سنگین شتری علیه نوروتوکسین بوتولینوم نوع e در پیکیا پاستوریس بیان و سپس تخلیص گردید. ژن vhh دروکتور ppink-hc کلون و در ابتدا به باکتری اشرشیا کلی(top10) منتقل شد. وکتور™ pichiapink حاوی ژن vhh به منظور ورود به ژنوم مخمرخطی شد و به سلول های مستعد مخمری منتقل گردید. تعدادی از کلونی های ترانسفورم شده انتخاب و در محیط کشت بیانی مخمر(bmgy ) کشت داده شد. vhh نوترکیب درپیکیا پاستوریس بیان شد. بیان پروتئین به وسیله sds-page آنالیز گردید و مشاهده شد که میزان بیان پروتئین در مخمر پیکیا پاستوریس نسبت به باکتری اشرشیا کلی بالاتر است. کارایی نانوبادی بیان شده در مخمر، در بدن موجودات زنده (موش) مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین مقایسه ای میان کارایی نانوبادی بیان شده در مخمر و باکتری صورت پذیرفت. نانوبادی بیان شده در مخمر توانست در بدن موش های مورد آزمایش، دوز کشنده 50 درصد توکسین را، در 25 درصد موش ها تا 4 برابر افزایش دهد. همچنین نانوبادی بیان شده در باکتری توانست زمان زنده ماندن موش ها را به دو برابر افزایش دهد. در پایان مشخص شد که نانوبادی بیان شده در مخمر در جهت مهار توکسین کارایی بهتری دارد.

بوتولینوم یکی از سمی ترین موادی است که بر روی سیستم اعصاب محیطی تاثیرگذار است که باعث ایجاد فلج شل حاد می شود.بنابراین تشخیص سریع و درمان نوروتوکسین های بوتولینوم ضروری به نظر می رسد.آنتی بادی ها به عنوان ابزارهای مهمی در تحقیقات، تشخیص و درمان بیماری ها شناخته شده اند.نانوبادی های جزء آنتی بادی های زنجیره سنگین شتری هستند که در مقایسه با آنتی بادی های کلاسیک دارای ویژگی های خاصی هستند.بلوغ تمایلی آنتی بادی ها کاربرد آنها را در پزشکی و پروژه های تحقیقاتی تسهیل کرده است.با نمایش قطعات آنتی بادی ها در سطح فاژ، می توان فاژهای مخصوص آنتی ژن را جداسازی نمود. برای انجام غنی سازی مراحل غربالگری چندین بار تکرار می شود.در تحقیق گذشته، نانوبادی اختصاصی علیه نوروتوکسین کلستریدیوم بوتولینوم نوع e به دست آمد.در این تحقیق هدف بهبود تمایل این نانوبادی به وسیله ی تکنیک زنجیره پلی مراز مستعد خطا است.بدین منظور کتابخانه ای جهشی از ژن نانوبادی علیه نوروتوکسین کلستریدیوم بوتولینوم نوع e با بهره گیری از واکنش زنجیره پلی مراز مستعد خطا ساخته شد.بدین منظور قطعات vhh کلون شدند و برای انجام مراحل غربالگری بر سطح فاژ به نمایش گذاشته شدند.فاژهای متصل شده باکتری را آلوده می کنند و برای مرحله بعدی غنی سازی و نیز آنالیز میزان اتصال مجددا تکثیر داده می شوند.بعد از انجام فاژ-الایزا و انتخاب چند کلونی، بیان نانوبادی به انجام رسید.نتایج الایزای تمایلی نشان از افزایش 8 درصدی در تمایل این نانوبادی داشت.

در طول دو دهه گذشته مخمرمتیلوتروفیک پیکیا پاستوریس به عنوان یکی از موفق ترین سیستم های بیانی جهت تولید انواعی از پروتئینهای نوترکیب مورد استفاده قرار گرفته است. این مخمر قابلیت انجام بسیاری از تغییرات پس از ترجمه ای یوکاریوتی مانند گلیکوزیلاسیون، تشکیل پیوندهای دی سولفیدی و در نتیجه فولدینگ صحیح پروتئین دارد. با وجود این مزایا، پیکیا پاستوریس می تواند یک جایگزین عالی برای سیستم بیانی اشرشیا کلی باشد. در این پژوهش، آنتی بادی زنجیره سنگین شتری علیه زیر واحد urec آنزیم اوره آز هلیکوباکترپیلوری در پیکیا پاستوریس بیان و سپس تخلیص گردید. ژن vhh دروکتور ppink-hc کلون و در ابتدا به باکتری اشرشیا کلی، سویه top10 منتقل شد. سپس وکتور حاوی ژن vhh به منظور ورود به ژنوم مخمرخطی شد و به سلول های مستعد مخمری منتقل گردید. تعدادی از کلونی های ترانسفورم شده انتخاب و در محیط کشت بیانی مخمر (bmgy,bmmy) کشت داده شد وvhh نوترکیب درپیکیا پاستوریس بیان شد. بیان پروتئین به وسیله sds-page آنالیز گردید و مشاهده شد که میزان بیان پروتئین در مخمر پیکیا پاستوریس نسبت به باکتری اشرشیا کلی بالاتر است. در نهایت کارایی نانوبادی بیان شده در شرایط invitro مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین مقایسه ای بین کارایی نانوبادی بیان شده در باکتری و مخمر صورت گرفت و مشخص شد که نانوبادی بیان شده در مخمر در جهت مهار آنزیم اوره آز کارایی بهتری دارد.

دست ورزی آنتی بادی های مهم از نظر کلینیکی، می تواند در بهبود تشخیص و درمان موثر باشد. فرایند بلوغ افینیتی توانایی قابل توجهی در بهبود کارایی آنتی بادی ها دارد. یکی از راه های پیشنهادی استفاده از روش جهش زای pcr مستعد خطا برای افزایش افینیتی آنتی بادی ها می باشد. در تحقیق پیش رو این روش، روی آنتی بادی زنجیره سنگین شتری (vhh، نانوبادی) ایجاد شده علیه زیرواحد urec آنزیم اوره آز h.pylori اعمال شد. اوره آز مهم ترین عامل بیماری زایی h.pylori است و جایگاه فعال آنزیم در زیرواحد بزرگ آن (urec) قرار دارد. این vhh به عنوان مولکول پایه برای ساخت یک کتابخانه ی نمایش فاژی بزرگ و متنوع از vhhهای تصادفی مورد استفاده قرار گرفت. کتابخانه ی فاژی حاوی نانوبادی های جهش یافته، در معرض چندین مرحله غربالگری علیه آنتی ژن urec در فاژ الایزا قرار گرفت و یک vhh جهش یافته با افینیتی بالاتر از نوع اولیه جدا شد. این vhh به میزان 5/1 برابر نسبت به vhh اولیه فعالیت اتصالی بیشتری به آنتی ژن هدف نشان داد. به علاوه، این vhh جهش یافته، عملکرد بهتری در مهار فعالیت اوره آزی به خصوص در غلظت های کم آنتی بادی داشته است، در حالی که اختصاصیت و پایداری دمایی خود را حفظ می کند.

ca ix (کربونیک انهیدراز9) عضوی از خانواده کربونیک انهیدرازهاست که به عنوان مارکر تشخیصی در تومورهای هیپوکسیک شناخته شده است. این آنزیم علاوه بر تنظیم ph –که مشخصه اصلی تمام کربونیک انهیدرازها می باشد- و شرکت در فرآیندهای تومورزایی، در چسبندگی سلول نیز نقش بازی می کند. تاکنون تلاش های زیادی در جهت تشخیص و/یا درمان بر اساس شناسایی و/یا ممانعت از عمل این آنزیم انجام گرفته است. در این پژوهش با استفاده از تخلیص لنفوسیت های شتر تک کوهانه ایمن شده علیه جایگاه فعال ca ix، کتابخانه فاژمیدی حاوی ژن های vhh ساخته شد. پس از آن بالاترین vhh متصل به فاژ با بیشترین تمایل با استفاده از روش غنی سازی جدا و درون وکتوری بیانی زیرهمسانه سازی گردید. vhh حاصل تخلیص و در تست الایزا با ca ix نوترکیب و سلول های هلا استفاده شد. vhh به دست آمده مولکول های ca ix را بر روی سلول های هلا شناسایی کرد و بر روی سلول های pc3 به عنوان کنترل ایمنی نداشت.

درماتوفیتوزیس یک بیماری شایع جلدی قارچی است که انتشار جهانی داشته و از نظر بهداشتی با اهمیت می-باشد که پوست و ضمائم آن مانند مو و ناخن را درگیر می کند. شدت بیماری علاوه بر سوش عامل و حساسیت میزبان به قارچ مولد، به وضعیت عمومی بیمار نیز بستگی دارد. بیشترین عامل عفونت قارچی ناخن یا اونیکومایکوزیس، ترایکوفیتون روبروم شناخته شده است. اگرچه این عفونت در افراد مبتلا به نقص سیستم ایمنی به شکل تهاجم موضعی، عمقی یا منتشره چند ارگانی درمیآید که در رفرانس های علمی به اسـامی tinea; ringworm و کچلی مطرح می شود. گونه های مختلف مخمرها، درماتوفیت ها و ساپروفیت ها یا کپک ها نیز ایجاد عفونت اونیکومایکوزیس می کنند. روش های متداول فعلی مانند آزمایش مستقیم میکروسکوپی و کشت، زمانبر بوده و از طرفی وجود احتمال منفی کاذب دراین دو روش، جواب گوی همه گیری این بیماری در بیماران مختلف از جمله بیماران ایمونوساپرس که به هر دلیلی سیستم ایمنی شان تضعیف شده است نمی باشد. روش بکار برده شده در این مطالعه، برای اولین بار در ایران تعداد 186 بیمار مشکوک و آلوده به انیکومایکوزیس، یا عفونت قارچی ناخن را به صورت مستقیم مورد بررسی و تشخیص مولکولی قرار داد که ازین تعداد 140 نفر زن (75%) و 46 نفر مرد (25%) با درگیری ناخن های دست و پا بوده اند. امروزه اهمیت بکار گیری پروتکلهای درمانی هدفمند و کارآمد، بر علیه آلودگی به گونه های مختلف درماتوفیتها برپایه تشخیص سریع و دقیق عامل عفونی احساس می شود. در بسیاری از کشورها از روشهای مولکولی متعدد و متنوعی برای تشخیص طیف وسیعی از بیماریهای عفونی سود می برند. واکنش زنجیره ای پلیمراز تکنیکی است که به طور گسترده در بیولوژی مولکولی بکارگرفته می شود. با پیشرفت تکنولوژی pcr و با استفاده از real time pcr سرعت تشخیص آزمایشگاهی انواع بیماری ها ازجمله درماتوفیتوزیس نیز درحال افزایش است که میتواند تشخیص سریع و شناسایی درماتوفیت ها را از مقادیر ناچیز مواد اولیه (نمونه بالینی) در ظرف چندین ساعت امکان پذیرکند. در این تحقیق علاوه بر روش های رایج آزمایش مستقیم و کشت، به صورت مقایسه یی از هر دو روش معمول pcr و پیشرفته real time pcr نیز استفاده گردید. از مجموع 186 نمونه بالینی بیماران در pcr معمولی، 92 نفر با پرایمر اختصاصی روبروم " t-rub" مثبت (49%) و 161 نفر با پرایمر یونیورسال قارچ its1&4 (86%) مثبت شده اند که 92 نفر اختصاصی روبروم نیز شامل آن شده و 25 مورد هم، منفی باقی ماند. همچنین از مجموع 186 نمونه pcr معمولی، تعداد 112 نمونه بالینی آن با real time pcr ارزیابی شد که 25 مورد منفی pcr معمولی نیز شامل آن می شود. از مجموع موارد منفی، 19 مورد آن در real time pcr مثبت و 6 مورد باز هم منفی باقی ماند.

آنژیوژنز فرایندی است که در طی آن رگ های خونی جدید در بدن تشکیل می شود. تشکیل رگ های جدید در یک تومور سرطانی باعث می شود مواد غذایی و اکسیژن بیشتری به سلول های تومور رسیده و تومور از حالت توده ی سلول های جهش یافته و بی ضرر تبدیل به یک تومور بدخیم شود. این تومور می تواند به بافت های دیگر حمله نموده و منجر به متاستاز شود. یکی از مهم ترین عوامل آنژیوژنز در بدن فاکتور رشد اندوتلیال رگی (vegf) می باشد. مهار عملکرد vegf باعث توقف آنژیوژنز و متاستاز تومورها می گردد. آنتی بادی های زنجیره سنگین شتری نوع خاصی از آنتی بادی بوده که در شترهای خانواده camelidae یافت می شوند. ناحیه اتصال به آنتی ژن این آنتی بادی ها تحت عنوان vhh یا نانوبادی، دارای خصوصیات منحصر به فردی از جمله پایداری بالا در برابر گرما، مواد کائوتروپیک و ph بوده و به دلیل داشتن اندازه کوچک قابلیت نفوذ موثرتری به بافت ها را دارند. این خصوصیت باعث می شود بتوانند اپی توپ های پنهان یا غیر عادی را شناسایی کنند. تکنیک نمایش فاژی تکنیک پرقدرتی برای مهندسی نمودن پپتیدها و پروتئین ها می باشد. این تکنیک قابلیت نمایش کتابخانه هایی با میلیون ها و حتی میلیاردها پپتید یا پروتئین مختلف را دارد. هدف از پروژه حاضر تولید نانوبادی های مشتق از آنتی بادی زنجیره سنگین شتری بر علیه فاکتور رشد اندوتلیال رگی (vegf-a) با استفاده از تکنیک نمایش فاژی می باشد. برای این کار ناحیه اتصال به رسپتور vegf-a سنتز شده در وکتور pet28a کلون گردید. پس ازبیان آن، پروتئین حاصل به عنوان ایمونوژن در پنج نوبت به شتر تزریق شد. پس از ایمن شدن شترها و کنترل ایمنی با آزمایش الایزا، لنفوسیت ها از خون محیطی استخراج شده و تخلیص rna آن انجام شد. در مرحله بعد با استفاده از rt-pcr، cdna ساخته شد. طی دو مرحله pcr (nested pcr) قطعات کد کننده vhh سنتز شدند. در pcr اولیه باندهای 600، 700 و 900 جفت بازی و در pcr ثانویه دو باند 400 و 500 جفت بازی در ژل مشاهده شد. قطعه 400 جفت بازی حاصل ازpcr دوم (vhh) در وکتور فاژمیدی pcomb3x کلون گردید. قطعه و وکتور هر دو با آنزیم sfii برش داده شده بودند. این عمل برای ساخت کتابخانه فاژی انجام می شود.

امروزه بکارگیری وسایل ایمنواسی و طراحی روشهای سریع برای تشخیص مورد توجه می باشد، لذا در سالهای اخیر تست های سریع با دقت و حساسیت کافی طراحی و جایگزین سایر روشهای پیچیده و پرهزینه ایمنواسی مثل رادیوایمنواسی ، الایزا و ... شده اند. آنتی بادی به عنوان یکی از مهمترین اجزا سنجشهای ایمنی در این نوع روشها مورد عنایت و استفاده است.آنتی بادی های پلی کلونال علیه مورفین تاکنون در حیوانات پستاندار گزارش شده اند، در این تحقیق برای اولین بار آنتی بادی پلی کلونال علیه مورفین ‏‎igy-anti-morphine‎‏ با ایمن کردن مرغها توسط ایمنوژن 6- مورفین همی سوکسینات -آلبومین سرم گاو ‏‎6-mhs-bsa‎‏ و تخلیص آن با روش ساده و با استفاده از پلی اتیلن گلیکول 6000 صورت گرفته است.