فسفر در مقایسه با دیگر عناصر غذایی، در بیشتر خاک ها تحرک و قابلیت جذب کمی دارد. از آنجا که گیاهان فقط قادر به جذب یون فسفات آزاد از منابع فسفر آلی و معدنی می باشند، این عنصر یکی از اصلی ترین عوامل محدود کننده رشد گیاهان به شمار می رود. ریزسازواره های حل کننده فسفات نقش مهمی در تامین فسفر در قالب روش های سازگار با محیط زیست و پایدار می تواند داشته باشد. سازوکار اصلی برای رهاسازی فسفر معدنی و آلی موجود در خاک به ترتیب تولید اسیدهای آلی و آنزیم فسفاتاز توسط ریزسازواره ها می باشد. هدف اصلی این تحقیق شناسایی، جداسازی، همسانه سازی و بررسی ویژگی های آنزیمی یکی از ژن های فسفاتاز از باکتری pseudomonas putida p13 بود. به منظور همسانه سازی ژن های فسفاتاز مورد نظر از روش غربالگری کتابخانه ژنومی p. putida p13 و شناسایی ژن ها از طریق مطالعات بیوانفورماتیک استفاده شد، گرچه انجام مطالعات بیوانفورماتیک و انتخاب ژن نامزد با توجه به اطلاعات موجود در پایگاه های اطلاعاتی به منظور طراحی آغازگر موفقیت آمیز نبود، ولیکن تهیه کتابخانه ژنومی برای جداسازی ژن با استفاده از طراحی سیستم جدید غربالگری عملکردی ابداعی در محیط کشت حداقل حاوی یک سوبسترای رنگزا منجر به جدا نمودن دو همسانه مستقل از هم شد. مطالعات بعدی در راستای رسیدن به توالی رمزکننده فسفاتازها از طریق زیرهمسانه سازی با توجه به نقشه برشی آن ها و با استفاده از آغازگرها در دو طرف مناطق رمزکننده موجود در همسانه ژنومی جداشده انجام پذیرفت. پس از شناسایی منطقه رمزکننده فسفاتازها، برای بیان فراوان آن ها ژن های جداشده درون ناقلpgem-t easy در باکتری e. coli dh5? انتقال یافتند. بررسی ویژگی های آنزیمی ژن های جداشده بعد از خالص سازی پروتئین نشان داد که یکی از آنها به نام ppp1 دارای فعالیت فیتازی است و دیگری به نام ppp2 رمزکننده آنزیم فسفاتاز قندی است. بررسی های بیشتر بر روی آنزیم ها نشان داد که هر دو آنزیم فعالیت بهینه ای در 5ph و دمای 60 درجه سانتیگراد دارند. بررسی ها در حضور فیتات نشان داد که ثابت های بیوشیمیایی km و vmax برای ژن های فیتاز با وزن مولکولی kda 27 به ترتیب mm237/0 و µmol min?1 mg?1 281 و برای فسفاتاز قندی با وزن مولکولی kda50 mm192/0 و µmol min?1 mg?120 می باشد. نتایج hplc نشان داد که ژن ppp1 قادر به رهاسازی 5 گروه فسفات از 6 گروه فسفات ملکول فیتات می باشد، در حالی که ژن ppp2 تنها یک گروه فسفات را آزاد می نماید. هر دو آنزیم در دماهای بالا پایدار بوده و نگهداری در دماهای 55 و 60 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه اثری بر فعالیت آنزیم فیتاز و فسفاتاز قندی ندارد. گرچه رفتار آنزیمی و ویژگی های بیوشیمیایی این آنزیم ها با آنزیم های شناخته شده در کلاس 4 گانه فیتازی (به ویژه hapها) یا کلاس 3 گانه اسید فسفاتازهای غیر ویژه (به ویژه کلاس a) تفاوت چندانی نشان نمی دهد، اما از نظر توالی اسید آمینه، با کلاس های فوق هیچ تشابهی نشان نداده و به نظر می رسد که خود در کلاس جداگانه ای قرار می گیرند. توالی اسید آمینه ژن های جدا شده بیشتر با پروتئین های تسهیل کننده (major facilitator superfamily ) تشابه نشان می دهد. برای ارزیابی اثر باکتری های حل کننده فسفات بر رشد گیاه و جذب فسفر توسط گیاه گندم رقم روشن، آزمایش گلخانه ای در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار با اعمال 4 تیمار باکتریایی شامل باکتریp13 p. putida ،p5 p. agglomerans، p. fluorescence chao، باکتریهای p. putida بعلاوه p. agglomerans و شاهد (بدون تلقیح باکتری) در خاک استریل با بافت لوم انجام شد. تجزیه آماری بر روی صفات اندازه گیری شده، شامل وزن تر و خشک بخش هوایی، تعداد خوشه، تعداد دانه و وزن دانه، فسفر بخش هوایی در میان دوره (50 روز) و انتهای دوره رشد (120 روز) و فسفر موجود در دانه، نشان داد که تیمارهای باکتریایی در مقایسه با شاهد باعث افزایش غلظت فسفر بخش هوایی می شود، به گونه ای که تیمار حاوی دو باکتری p13 بعلاوه p5 دارای بالاترین میانگین می باشد. ولیکن اعمال تیمارها تاثیری بر افزایش بیوماس گیاهی نداشته است، هر چند که پارامترهایی نظیر تعداد خوشه یا تعداد دانه و وزن دانه در برخی از تیمارهای باکتریای دارای میانگین بالاتری نسبت به شاهد بودند.

فسفر یکی از عناصر مهم و ضروری برای گیاهان محسوب می شود که در رشد، انتقال انرژی، بیوسنتز ماکرومولکول ها، فتوسنتز، تنفس سلولی و به طور کلی سوخت و ساز سلولی نقش اساسی دارد. همچنین فسفر در ترارسانی پیام و تنظیم فعالیت پروتئین ها دخالت دارد. از آنجا که گیاهان فقط قادر به جذب یون فسفات آزاد از منابع فسفر آلی و معدنی می باشند، این عنصر یکی از اصلی ترین عوامل محدود کننده رشد گیاهان به شمار می رود. بهره گیری و استفاده موثر از فسفات آلی نیازمند فعالیت مجموعه ای از آنزیم ها موسوم به اسیدفسفاتازها می باشد که هیدرولیز مونواسترهای فسفات را در محدوده ph اسیدی کاتالیز می‏کنند. atpap26 یکی از آنزیم‏های مهم در بازیابی فسفات از ترکیبات داخل و خارج سلولی است. در این پژوهش، توالی کامل cdna رمزکننده ژن atpap26 پس از همسانه‏سازی، به گیاهان طبیعی، جهش‏یافته در جایگاه ژن atpap26 آرابیدوپسیس تالیانا و همچنین گیاه توتون به عنوان یک میزبان بیانی غیرهمسان منتقل شد و به کمک روش rt-pcr بیان ژن مذکور در گیاهان مختلف مورد بررسی قرار گرفت. در گیاه جهش‏یافته آرابیدوپسیس، تخریب ژن atpap26 موجب افزایش بیان ژن‏های atpap17 و atpap8 و نیز atplp9 شد که پیآمد آن افزایش 5/1 تا 2 برابری در فعالیت فسفاتازی با سوبستراهای pep و plp در مقایسه با گیاهان طبیعی شد. جالب توجه این که تغییرات معنی دار در فعالیت سایر اسیدفسفاتازها بیانگر وجود شبکه‏ای ارتباطی برای هماهنگی جهت حفظ هموستازی فسفات در بین آن‏ها است. افزایش بیان atpap26 و در نتیجه، افزایش فعالیت فسفاتازی در این گیاهان، افزایش حداقل 20 درصدی در محتوای فسفات و در نتیجه افزایش 50 و 30 درصدی بیوماس در گیاهان بیش‏بیانی آرابیدوپسیس و توتون را در پی داشت. همچنین انتقال ژن atpap26 به گیاهان جهش‏یافته آرابیدوپسیس موجب جبران تغییرات در اثر نقص ایجاد شده شد. همچنین نشان داده شد که گیاهان توتون تراریخت در مقایسه با گیاهان طبیعی غیرتراریخت در شرایط کمبود فسفات دارای ریشه اصلی کوتاه تر با انشعاب کمتر و نیز تعداد ریشه های فرعی کمتری هستند، در حالی که چنین فنوتیپی در گیاهان آرابیدوپسیس مشاهده نشد. مشاهده تأخیر در جوانه‏زنی و بروز فنوتیپ کوتولگی در گیاهان تراریخت توتون نشان می دهد که احتمالاً بیوسنتز اسیدجیبرلیک کاهش یافته است، در حالی که گیاهان تراریخت و جهش‏یافته آرابیدوپسیس تغییرات فنوتیپی قابل مشاهده‏ای نشان ندادند. افزایش بیوماس در گیاهان تراریخت در شرایط کمبود فسفات نویدبخش راهکاری مناسب در جهت کاهش آلودگی‏های ناشی از مصرف بی‏رویه کودهای فسفاته و فضولات صنعت مرغداری است.

اسید فسفاتازهای ارغوانی(pap) (ec 3.1.3.2) آنزیم های متالوفسفواسترازی هستند که هیدرولیز پیوندهای استری فسفات را در گستره وسیعی از سوبستراها برعهده دارند. در ژنوم آرابیدوپسیس 29 جایگاه ژنی رمز کننده اسید فسفاتازهای ارغوانی شناسایی شده است. به لحاظ ساختاری pap های گیاهی به دو گروه، با وزن مولکولی بالا و پایین تقسیم می شوند. گروه اول به شکل همودایمر فعالند در حالی که گروه دوم که تنها دارای دامین متالوفسفاتاز هستند به شکل منومر فعالیت می کنند. در مقایسه با اسید فسفاتازهای ارغوانی با وزن مولکولی پایین اهمیت زیستی انتهای آمینی و دامین فیبرونکتین و همچنین ساختار دایمری موجود در اسید فسفاتازهای ارغوانی با وزن مولکولی بالا ناشناخته باقی مانده است. در این پژوهش عملکرد ژن های atpap18 و atpap9 با استفاده از روش های مختلف بررسی شده است. این دو ژن به ترتیب hmwو lmw بوده و بیان هر دو در شرایط فقدان فسفات القا شده و هر دو وارد مسیر ترشحی می شوند. بیان فراوان ژن atpap18 منجر به افزایش فعالیت اسید فسفاتازی، ذخایر فسفات و تولید مواد زیستی در گیاهان ترایخت توتون و آرابیدوپسیس گردید. بررسی استقرار سلولی پروتئین atpap18 با استفاده از بیان گذرای این ژن با سازه 35s::atpap18-gfp در سلول های بشره پیاز نشان دهنده استقرار آن در واکوئل و همچنین ترشح آن به خارج از سلول است. آزمایش مشابهی با تراریختی پایدار گیاهان آرابیدوپسیس و سازه 35s::atpap18-gus در محیط واجد فسفات انجام شد. نتایج نشان دهنده حضور رنگ آبی در سلول های تار کشنده و تریکوم و ترشح آن به مقدار زیاد به خارج از این سلول ها بود. در گیاهان آرابیدوپسیس تراریخت شده با سازه 35s::sp18-gus رنگ آبی در محیط واجد فسفات در ریشه ها و در محیط فاقد فسفات در اندام هوایی مشاهده شد. بیان پایدار ژن gfp با استفاده از سازه های 35s::atpap18-gfp و 35s::sp18-gfp در گیاهان آرابیدوپسیس نتایجی مشابه با سازه های دارای ژن gus را ایجاد نمود. همچنین در این پژوهش، وجود دو نسخه متفاوت رونویسی که توسط ژن atpap9 رمز می شود با بررسی لاین های t-dna تایید شد. الگوی بیان هر دو نسخه به طور جداگانه ارزیابی شد. تفاوت نسخه atpap9-2 با نسخه atpap9-1 فقط در انتهای 5 آن است که اهمیت آن مورد بررسی قرار گرفت. الگوی بیان atpap9-1 با اتصال پروموتر آن به ژن گزارشگر gus بررسی شد و نتایج نشان داد که این ژن ویژگی بیان بافتی دارد. نسخه atpap9-1 بیان بالایی در گوشوارک ها و بافت آوندی، به ویژه در پاسخ به آلودگی قارچی دارد. محل استقرار پروتئین atpap9-1 با اتصال آن به ژن gfp مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که این پروتئین در اتصال غشای پلاسمایی به دیواره سلولی درگیر است. این یافته ها همراه با طرح های ساختاری پروتئین atpap9-1 نشان می دهند که این پروتئین احتمالا یکی از اجزای مسیر پیام رسانی است.

در پژوهش حاضر سامانه ای بیانی وابسته به پروتئین sigb در باسیلوس سوبتیلیس ساخته شد. پلاسیمد بیانی ساخته شده شامل ناحیه پروموتور ohrb، توالی سیگنال amyq، ژن زایلاناز از باسیلوس سوبتیلیس aq1 (بعنوان ژن هدف) و دنباله هیستیدینی بود. بیان ژن هدف در این سامانه بیانی با اعمال گرسنگی گلوکز در محیطی سنتزی محدود به گلوکز بررسی شد. نتایج نشان داد در طول فاز تاخیر و رشد نمایی پروتئین هدف تقریبا بیان نشده است. در اواخر فاز نمایی و اوایل فاز سکون، میزان تولید آنزیم به صورت ناگهانی افزایش یافته و به بیش از 41 واحد رسید که این نتیجه موید کنترل پذیری مناسب این سامانه در این محیط محدود به گلوکز است. بیان ژن هدف در سامانه بیانی ساخته شده با به کارگیری تنش های محیطی در lb و یک محیط کشت سنتزی بررسی شد. در نتیجه اعمال تنش های نمک (nacl)، گرما و اتانول در محیط lb به ترتیب افزایش 5، 6 و 15 برابری در فعالیت پروتئین هدف مشاهده شد. در تنش نمک بیشترین میزان فعالیت آنزیمی 40 دقیقه بعد از اعمال تنش حاصل شده و به مقدار 12 واحد رسید و در ادامه مقادیر فعالیت کاهش یافت. در تنش اتانول، 30 دقیقه بعد از اعمال تنش بیشینه میزان فعالیت آنزیمی در حدود 10 واحد حاصل شد. در تنش حرارتی، بعد از مدت 10 دقیقه فعالیت آنزیمی به 11 واحد رسید که در ادامه باکاهش فعالیت همراه بود. نهایتا از دقیقه 30 ام به بعد فعالیت افزایش یافت بطوریکه در دقیقه 60 به مقدار 13 واحد رسید. در مجموع بهترین بیان آنزیم و همچنین نسبت القاء مربوط به اعمال تنش نمک در محیط سنتزی بود. بطوریکه بیشترین میزان فعالیت آنزیمی 40 دقیقه بعد از اعمال تنش حاصل شده و به مقدار 15 واحد رسید در حالیکه پیش از اعمال تنش فعالیت زایلانازی مشاهده نشده بود. بررسی قابلیت خود القایی سامانه بیانی در تولید پروتئین هدف با انجام تخمیر چگالی سلولی بالای سویه نوترکیب در محیطی بر پایه گلوکز انجام شد. در پایان فرایند تخمیر، هم زمان با ورود سویه به فاز سکون افزایش چشم گیری در تولید آنزیم زایلاناز دیده شد. به طوری که فعالیت آنزیم ای از 3 واحد بر میلی لیتر در طی یک ساعت به 8 واحد بر میلی لیتر و متعاقبا با گذشت 4 ساعت دیگر به 10 واحد بر میلی لیتر رسید. افزایش ناگهانی فعالیت زایلاناز در اوایل ورود سویه به فاز سکون موید قابلیت خود القایی این سامانه بیانی بود. در شرایط مشابه، حداکثر تولید آنزیم زایلاناز توسط سویه شاهد 2 واحد بر میلی لیتر بود. تولید آنزیم زایلاناز توسط سویه شاهد به دلیل حضور ژن زایلاناز بر روی کروموزوم است. پروفایل فعالیت زایلاناز توسط این سویه نشان دهنده تولید وابسته به رشد این آنزیم است. در نتیجه ایجاد گرسنگی سلولی و یا اعمال تنش در باسیلوس سوبتیلیس، پروتئین sigb به حالت فعال در آمده و سبب بیان ژن هدف شده است.

چکیده ندارد.

چکیده ندارد.