ویروس های a و y سیب زمینی از جنس potyvirus و خانواده potyviridae خسارت های زیادی به این گیاه وارد می کنند. ایجاد و به کارگیری ارقام مقاوم به ویروس موثرترین و اقتصادی ترین روش مبارزه با بیماری های ویروسی به شمار می رود. در این راستا دستیابی به منابع مقاومت به خصوص در خویشاوندان وحشی سیب زمینی به منظور انتقال ژن های مقاومت آن ها به ارقام تجاری از اهداف مهم اصلاحی این گیاه می باشد. در این تحقیق گیاهان حاصل از بذر حقیقی tps) 12) ژنوتیپ سیب زمینی زراعی و 6 ژنوتیپ از 3 گونه وحشی آن در برابر potato virus a و potato virus y مورد ارزیابی قرار گرفت. ارزیابی ها در دو شرایط گلخانه ای و درون شیشه ای (in vitro) با استفاده از آزمون elisa صورت گرفت. به طور کلی ژنوتیپ های زراعی در گلخانه در برابر ویروس y دارای مقاومت بیشتر بودند و انواع وحشی حساسیت یا نیمه مقاومت نشان دادند. ژنوتیپ solanum kurtzianum 75-12 نسبت به pvy و ژنوتیپ s.gourlayi 75-396 نسبت به pva در گلخانه بسیار حساس و ژنوتیپ های زراعی agria و t2704 نسبت به هر دو ویروس حساسیت نشان دادند، ژنوتیپ 994007 نسبت به هر دو ویروس در گلخانه مقاوم و از گروه وحشی ها ژنوتیپ s.gourlayi 75-273 نیمه مقاوم به pvy و s.kurtzianum مقاوم به pva بودند. ژنوتیپ t2704 در درون شیشه به pvy و pva بسیار حساس و ژنوتیپ بامبا به هر دو ویروس در درون شیشه مقاوم شناخته شدند، از گروه ژنوتیپ های وحشی s.gourlayi 75-273 به pvy و s.phureja 75-470 به pva مقاوم و ژنوتیپ های s.gourlayi 75-273 به pva و s.phureja 75-470 به pvy حساسیت نشان دادند. ویروس در گیاه مقاوم معمولا کندتر از گیاه حساس حرکت می کند و تکثیر می شود اما گاه استثناهایی وجود دارد مانند ژنوتیپ زراعی 8039 که با وجود حساس بودن به ویروس a همانند ژنوتیپ های مقاوم ویروس دیرتر به برگ های انتهایی رسید یا s.phureja 75-36 که با وجود نیمه مقاوم بودن به ویروسy، ویروس در آن زودتر از ژنوتیپ های حساس به برگ های انتهایی رسید. در مقایسه شرایط گلخانه با درون شیشه مشخص شد افزایش غلظت ویروس در گیاهچه های حاصل از tps در شرایط درون شیشه سریع تر از شرایط گلخانه اتفاق می افتد و علائم ایجاد شده شدیدتر و مشخص تر است. روش درون شیشه به نسبت گلخانه از کارائی بیشتری برخوردار است زیرا فضای کمتر و امکان دسترسی به ماده گیاهی بیشتر و تکرار بیشتر آزمایش ها جهت بررسی صحت آن ها امکان پذیرتر می باشد، همچنین بررسی واکنش های گیاهان در برابر عوامل بیماریزا بدون دخالت هیچ عامل خارجی امکان پذیرتر می باشد. نژادهای ویروس y شاملn، o، ntn و c توسط rt-pcr با پرایمرهای اختصاصی برای هر نژاد در ژنوتیپ های وحشی سیب زمینی شناسایی شدند. ژنوتیپ ها با یکدیگر تفاوت هایی را نشان دادند. ژنوتیپ s.gourlayi 75-396 به نژادهای o و c، s.gourlayi 75-109 به o و c، s.gourlayi 75-273 به o و c، s.phureja 75-8 به n و ntn ، s.phureja 75-36به o و s.kurtzianum 75-12 به o، n و ntn حساس می باشند. نژاد ntn برای اولین بار در استان آذربایجان شرقی شناسایی شد. با بررسی ها و مطالعات گسترده تر بر روی ژنوتیپ های وحشی با گونه ها و زیرگروه های مختلف، شناسایی ژنوتیپ های مقاوم به ویروس ها و انتقال ژن های آن ها به ژنوتیپ های زراعی امکان تولید فراوان تر ژنوتیپ های مقاوم زراعی فراهم می آید و مبارزه با ویروس های گیاهی و کاهش خسارت آن ها امکان پذیرتر می شود.

چکیده ویروس برگ بادبزنی مو grapevine fan leaf virus (gflv) از خانواده comoviridae، یکی از مخرب ترین بیماری های مو در سراسر جهان می باشد. پیکره این ویروس دوذره ای، جورقطر و به قطر 30 نانومتر بوده و در طبیعت توسط نماتد xiphinema index منتقل می شود. این بیماری باعث زوال پیش رونده مو می گردد به طوریکه منجر به کاهش راندمان محصول تا بیش از 80% می شود. با توجه به محدودیت روشهای کنترل رایج این بیماری در تاکستانها، تولیدگیاهان تراریخته مقاوم به ویروس ابتدا از طریق بیان این ژن در باکتری و نهایتا بیان آن در گیاه از طریق مهندسی ژنتیک ، از اهداف انجام تحقیق حاضر بود. برخی استرین های gflv قادر به آلوده کردن گیاهانی نظیر cucumis sativus نمی باشند که این امر می تواند به دلیل عدم بیان ژن پروتئین حرکتی در گیاه باشد. این تحقیق می تواند در مطالعات مربوط به مقاومت میزبانی نقش احتمالی این پروتئین را مشخص کند. هدف اصلی در انجام تحقیق حاضر بررسی بیان ژن پروتئین حرکتی در باکتری escherichia coli rosetta بود تا با تولید آن، امکان تولید آنتی بادی نوترکیب در برابر آن فراهم گردد. به منظور تولید پروتئین حرکتی نوترکیب، بخشی از آر ان ای دوم ویروس که پروتئین حرکتی را رمز می کند، قبلا به کمک آغازگرهای اختصاصی از روی cdna تکثیر، همسانه سازی و تعیین توالی شده است. در این تحقیق از کلونی باکتریایی واجد ptz57gflvmp، پلاسمید به روش لیز آلکالینی استخراج و بعد از برش توسط آنزیم های bamhi و saci، قطعه مورد نظر به حامل بیان pet-21a(+) برش داده شده توسط آنزیم های bamhi و saci، اتصال داده شد. پس از بیان پروتئین حرکتی gflv در e. coli ، وزن مولکولی پروتئین نوترکیب استخراج شده در sds-page بررسی شد. وزن مولکولی این پروتئین در حدود 38 کیلودالتون بود که منهای تعداد اسیدآمینه های افزوده شده توسط حامل با اندازه پروتئین حرکتی gflv مطابقت داشت.

خانواده های کدوئیان، سولاناسه، کلمیان، حبوبات و غیره که در گروه سبزیجات طبقه بندی می شوند، با اهمیت اقتصادی فراوان به طور وسیع در شمال غرب کشور کشت می شوند. این گیاهان مورد حمله ی ویروس های زیادی قرار می گیرند که پوتی ویروس ها از مهم ترین ویروس های آلوده کننده ی این گیاهان می باشند. جنس پوتی ویروس متعلق به خانواده پوتی ویریده و دارای 111 گونه ی مشخص و 86 گونه ی موقتی است. این ویروس ها دارای ژنوم یک بخشی به طول تقریبی 10000 جفت باز می باشد. پوتی ویروس ها با پراکنش جهانی، وسیع ترین دامنه ی میزبانی را در سطح جنس و در بین ویروس های گیاهی داشته که در مزارع ایران نیز شیوع دارد و باعث کاهش راندمان محصول و خسارت جبران ناپذیر به مزارع می شود. از آنجایی که ردیابی پوتی ویروس ها و بررسی تغییرات ژنتیکی در بین جدایه های آنها گامی موثر در جهت کنترل این ویروس ها می باشد، هدف از این تحقیق، استفاده از روش های مولکولی مناسب و بهینه در ردیابی پوتی ویروس ها و تعیین گونه ها ی آنها می باشد. در تحقیق حاضر به منظور ردیابی این ویروس ها از مزارع مختلف آذربایجان شرقی و اردبیل طی بهار ، تابستان و پاییز سال 1389تعداد 215 نمونه گیاهی مشکوک به آلودگی با پوتی ویروس ها نمونه برداری شدند. علایم شامل موزاییک، ابلقی، بدشکلی برگ و میوه، تاولهای سبز رنگ روی برگ ومیوه و نقش ونگار های حلقوی شکل روی میوه ها بودند. در مطالعات گلخانه ای از گیاهان سلمه تره(chenopodium amaranticolor)، کدو(cucurbita pepo)، لوبیا(phaseolus vulgaris) و توتون(nicothiana tabacum cv.samsun) به عنوان میزبان های تشخیصی و از کدو، لوبیا و توتون به عنوان میزبان تکثیری استفاده شد. با انجام آزمون آرتی-پی سی آر با 2 جفت آغازگر عمومی، از 61 نمونه ی مورد بررسی، 7 نمونه به جفت آغازگر sprimer/m4 و 29 نمونه نیز به جفت آغازگر nib2f/nib3r پاسخ مثبت دادند. جفت آغازگر sprimer/m4 که منطبق بر ژن رمز کننده ی nib/polya می باشد، قطعه ای به طول 1600-2100 جفت باز را تکثیر دادند. همچنین جفت اغازگر nib2f/nib3r، قطعه ای به طول 350 جفت بازی را تکثیر دادند. قطعات دی ان ای 350 جفت بازی حاصل از جفت آغازگر nib2f/nib3r به پلاسمید ptz57r/t متصل و در باکتری e.coli dh5? کلون شدند. باکتری های ترنسفرم شده با پلاسمید نوترکیب بر روی محیط کشت lb حاوی آمپی سیلین، iptg، x-gal ، غربال شده و پلاسمید از آنها به روش لیز آلکالینی استخراج گردید. پلاسمید های استخراج شده با آنزیم های برشی ecor?/hind??? با محل اثر در 2 طرف محل اتصال دی ان ای خارجی برش داده شدند. به منظور شناسایی گونه ها ی جنس پوتی ویروس و مقایسه ی توالی نوکلئوتیدی بخش تکثیر یافته از ژن nib جدایه ها و مقایسه با سایر جدایه های این جنس ، تعیین توالی نوکلئوتیدی انجام گرفت. از بین 5 جدایه ی مورد بررسی، 4 جدایه به عنوان گونه های جنس پوتی ویروس شناخته شد. هر 4 توالی نوکلئوتیدی به اندازه ی 302 نوکلئوتید (پس از حذف توالی اغازگر ها) به پایگاه اطلاعاتی genbank واگذار گردید. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی هر یک از این جدایه ها با توالی های بدست آمده از بلاست در سایت ncbi انجام گرفت. جدایه ی a187 به عنوان گونه ی ویروس وای سیب زمینی شناخته شد و در درخت فیلوژنی موقعیت این جدایه در بین سایر جدایه ها متمایز است. جدایه ی t205 به عنوان ویروس موزاییک هندوانه شناخته شده و بیش ترین تشابه را با جدایه های ایرانی نشان داد. جدایه ی t172 نیز به عنوان گونه ی ویروس موزاییک معمولی لوبیا شناخته شد و با جدایه هایی از فنلاند، هلند در یک خوشه قرار دارد. همچنین جدایه ی t67 به عنوان گونه ی ویروس موزاییک زرد لوبیا شناسایی شد و با جدایه ای از استرالیا در یک خوشه قرار می گیرد.

چکیده: سیب یکی از میوه هائی است که به خاطر داشتن ارزش غذائی بالا و ترکیبات آنتی اکسیدانتی و رنگیزه های مفید از جمله کارتنوئید ها و آنتوسیانین ها در بین درختان میوه از جایگاه ویژه ای برخوردار می باشد و هر گونه بهبود در کیفیت و یا کمیت این گیاه دارای ارزش اقتصادی بسیار می باشد. بر خلاف گیاهان علفی، در درختان میوه مانند سیب روند اصلاح به خاطر طولانی بودن فاز نونهالی بسیار دشوار است، بنابراین از بین اهداف اصلاحی سیب کوتاه کردن طول دوره نونهالی در درجه اول اهمیت قرار دارد. درک مکانیسم القاء و تکوین گل برای دستکاری صفت طول دوره نونهالی لازم و ضروری است. mdsoc1a ژنی از ژن های احتمالی در گیر در گلدهی سیب است که تعیین نقش دقیق آن مستلزم فوق تظاهر و خاموش کردن آن در گیاهان مدل و سیب میباشد. در این پژوهش هدف ساختن سازه مناسب برای خاموش کردن ژن mdsoc1a می باشد. بدین منظور، توالی ژن جدا شدهmdsoc1a ، با استفاده از آغازگرهای دارای توالی اضافی برای دو سایت برشی در دو انتها از حامل pnm103 توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر شد و قطعه حاصل در حامل pgem-t easy به منظور تسهیل فرآیند هضم همسانه سازی شده و منجر به ایجاد یک سازه جدید با عنوان pnm107 گردید. سپس قطعه هضم شده با saci-bamhi به همراه ژن مورد نظر در جهت آنتی سنس در یک سازهی دوگانه تازه طراحی شده با عنوان pnm106 همسانه سازی و در نهایت نام pnm109 به آن اختصاص داده شد. واکنش colony pcr و تجزیه و تحلیل نقشه برشی نشان داد که همسانه سازی ژن به درستی صورت گرفته است. در نهایت سازه pnm109 به اشرشیاکلی سویه dh5? و بعد به agrobacterium tumefaciens سویهagl1 انتقال یافت.

تاکنون 5 ویروئید به نام های grapevine yellow speckle viroid-1 (gysvd-1)، grapevine yellowspeckle viroid-2 (gysvd-2)، australian grapevine viroid (agvd)، hop stunt viroid (hsvd)، citrus exocortis viroid (cevd) از مو شناسایی شده است. به علاوه، حدود 60 ویروس نیز این میزبان مهم را آلوده می کنند که 15 عضو آن در جنس نپوویروس قرار دارند. در این تحقیق به منظور بررسی پراکنش و تنوع ژنتیکی ویروئیدهای مو و همچنین نپوویروس ها و آلودگی مخلوط آن ها با همدیگر، نمونه برداری از سه استان آذربایجان شرقی، آذربایجان غربی و اردبیل طی تابستان سال های 1388 و 1389 انجام شد و برای اولین بارروش مولتی پلکس پی سی آر (mrt-pcr) برای ردیابی هم زمان همه ویروئیدهای شناخته شده مو به کار گرفته شد. همچنین، یک روش ابداعی دیگر برای ردیابی هم زمان سه ویروئید gysvd-1، gysvd-2 وhsvd بر روی یک ممبران با مخلوط کردن پروب های اختصاصی در نورترن بلات (multiprobe northern blot, mpnb) بهینه سازی شد. ردیابی ویروئیدهای مو با سه روش mrt-pcr، mpnb و dot blotاز تاک های مورد بررسی نشان داد که منطقه شمال غرب کشور به صورت گسترده به این ویروئیدها آلوده هستند به نحوی که،gysvd-1، gysvd-2، agvd، hsvd و به ترتیب در 91، 65، 95 و 100 درصد تاک ها ردیابی شدند و در هیچ موردی آلودگی به ویروئید اگزوکورتیس مرکبات دیده نشد. نکته جالب این که در 63 درصد تاک ها چهار ویروئید gysvd-1، gysvd-2، agvd و hsvdبه صورت توامان حضور داشتند که نشان می دهد که آلودگی مخلوط در ویروئیدهای مو معمول است. در این بررسی، تنها در 5 تاک یک ویروئید حضور داشت و در 96 درصد موارد آلودگی مخلوط ویروئیدها مشاهده شد. mrt-pcr به صورت موثر و موفقیت آمیزی قادر به ردیابی همه ویروئیدهای مو بود و این روش می تواند در برنامه صدور گواهی سلامت در مو نقش مهمی را ایفا کند. بررسی های بیشتر این نمونه ها با روش rt-pcr، حاکی از حضور ویروس برگ بادبزنی مو (gflv) در 37 درصدتاک ها و بیماری رگ نواری مو (نتیجه ی برهمکنش بین gflv و ویروئیدهایی لکه زردی مو) در 17 درصدتاک ها را داشت. در آلودگی توام این دو عامل بر شدت بیماری افزوده می شد. در این تحقیق همچنین زیرگروه های a، b و c نپوویروس ها با روش mrt-pcr مورد ردیابی قرار گرفتند که نتایج حاکی از عدم حضور ویروس موزاییک آرابیس در این منطقه بود. در بین سایر نپوویروس ها تنها دو ویروس لکه حلقوی آناتولی مو (garsv) و ویروس بدشکلی مو (gdefv) در این تحقیق ردیابی شدند ولی میزان فراوانی این ویروس ها بسیار پایین بود به طوریکه هر کدام این ویروس ها تنها از یک نمونه ردیابی شدند.تعیین توالی کلون های ویروئیدها نشان داد که تنوع قابل ملاحظه ای در جدایه های ایرانی ویروئیدها و ساختارهای ثانویه منحصر به فرد آن ها وجود دارد.در ساختمان ثانویه gysvd-1بیشترین تفاوت با جدایه ها در منطقه متغیر، دو طرف ccr، قسمت چپ انتهایی قرار داشت. این تغییرات در gysvd-2 مربوط به ناحیه راست و چپ انتهایی ودر agvd مربوط به منطقه ی بیماریزایی بود. جدایه های ایرانی hsvd تفاوت قابل ملاحظه ای با سایر جدایه-ها نداشتند.روابط فیلوژنتیکی این ویروئیدها نشان داد که در اکثر موارد ایزوله های ایرانی تکامل مستقلی را طی نموده اند. توالی های به دست آمده از ایزوله های ایرانی در هیچ کدام از سه تیپ شناخته شده از ویروئید لکه زردی مو-1 قرار نمی-گیرند و تیپ فرضی جدیدی را می توان برای این ویروئید پیشنهاد کرد. نتایج حاصل از این تحقیق در تشخیص این ویروئیدها در مقیاس وسیع، صدور گواهی سلامت برای قلمه ها، آگاهی از وضعیت آلودگی تاکستان های شمال غرب کشور به ویروئیدها و نپوویروس ها در جهت برنامه ریزی برای کنترل آن ها می تواند بسیار مفید باشد.

بیماری برگ بادبزنی مو توسط grapevine fanleaf virus (gflv) ایجاد شده و قدیمی ترین و مخرب ترین بیماری ویروسی شناخته شده در مو است. به رغم گذشت بیش از هفت دهه از شناسایی این ویروس همچنان بسیاری از جنبه های آن ناشناخته باقی مانده است. از اینرو برای بررسی فیلوژنی، تغییرات ژنتیکی و اثرات آن در خصوصیات بیولوژیکی ویروس، تعداد 257 نمونه با علایم مشکوک به آلودگی با gflv از تاکستان های قدیمی جمع آوری شدند. در ادامه براساس الگوی برش آنزیمی محصولات rt-pcr انجام شده برروی نمونه های الیزا مثبت، چهار جدایه برای همسانه سازی و تعیین توالی طول کامل rna2 ویروس انتخاب شد. نتایج تعیین توالی نشان داد که طول rna2 در جدایه های ارومیه و شیرامین 3730 نوکلئوتید و در جدایه های تاکستان و بناب 3749 نوکلئوتید بدون در نظر گرفتن طول دنباله آدنوزینی بود. دلیل کوتاهی rna2 در این جدایه ها حذف هایی بود که در هر دو ناحیه های ترجمه نشونده 3 و 5 رخ داده است. در درخت فیلوژنی ترسیم شده براساس طول کامل rna2، تمامی جدایه های gflv در سه گروه قرار گرفتند که در آن میان جدایه های ایرانی در یک کلاستر مجزا قرار داشتند. آنالیزهای نوترکیبی نشان داد که جدایه های gflv-nw، gflv-f13، شیرامین و arabis mosaic virus –lv جدایه های نوترکیب بوده و دارای جد مشترک هستند. مقایسه توالی نوکلئوتیدی rna2 در چهار جدایه ی ایرانی gflv که دوتای آنها مرتبط با علایم موزاییک زردی و دوتای دیگر مرتبط با علایم رگ نواری بودند نشان داد که rna2ی این جدایه ها بیشترین تفاوت را در ناحیه ی ژن 2ahp بویژه انتهای آمینی آن داشت و احتمالاً در ایجاد علایم نقش دارد ولی شواهد مستقیمی یافت نشد. علاوه براین، انتهای آمینی 2ahp بر خلاف انتهای کربوکسیلی و نیز orf2 تحت فشار انتخابی مثبت بود. از اینرو برای بررسی اثرات جهش های رخ داده در انتهای آمینی 2ahp در تکثیر و بیماریزایی ویروس، همسانه های نوترکیبی برای انتهای آمینی و نیز کل ژن 2ahp ساخته و تکثیر آنها بررسی شد. نتایج نشان داد که تغییرات اعمال شده باعث افزایش در تکثیر rna2 ویروس شده اند. به موازات این بررسی ها برای معرفی یک روش حساس در ارزیابی پایه های مادری، ردیابی 14 نمونه ی الیزا مثبت با استفاده از rt-pcr و با بکارگیری آغازگرهای موجود در منابع و طراحی شده در این پژوهش بررسی شد. نتایج نشان داد که اکثر آغازگرهای موجود در منابع قادر به ردیابی تمامی نمونه های بررسی شده نبودند. در حالیکه آغازگرهای طراحی شده در این پژوهش ویروس را در همه ی نمونه ها ردیابی کردند. کارایی آغازگرهای طراحی شده روی 35 نمونه ی الیزا مثبت جمع آوری شده از سایر استان ها در سال بعد (1388) بررسی و تأیید شد. همچنین روش پیوند سبز روی رقم قره داش (بعنوان میزبان نموده سازی) آلودگی به gflv را تایید کرد. نتایج این پژوهش نشان داد که ترکیب پیوند سبز و rt-pcr با آغازگرهای معرفی شده در این بررسی روشی حساس برای ردیابی gflv است.

با توجه به اینکه سبزیجات ازجمله خانواده کدوئیان، سیب زمینی و غیره، از منابع مهم در تغذیه ی انسانها، به ویروس های مختلفی حساس هستند و هرساله زیان اقتصادی زیادی را به کشاورزان تحمیل می کنند، شناسایی ویروس های عامل این خسارات از اهمیت زیادی برخوردار است. پوتی ویروس به عنوان مهم-ترین جنس خانواده پوتی ویریده، مهم ترین جنس ویروسی است که موجب کاهش شدید در عملکرد کشت این محصولات میشود. بر اساس آخرین گزارش کمیته بین المللی آرایه بندی ویروس ها (ictv)، جنس پوتی ویروس شامل 146 گونه می باشد. هر ساله نیز گونه های جدیدی به این جنس اضافه می شوند. ژنوم اعضاء این جنس آران ای تک رشته ای با قطبیت مثبت با طولی حدود kb10 میباشد که تنها دارای یک orf بوده و به یک پلی پروتئین ترجمه می شود. در این تحقیق سعی بر این شد که با همسانه سازی قطعات حاصل از آرتی-پی سی آر با آغازگرهای دژنره به شناسایی مولکولی پوتی ویروس های موجود در مزارع آذربایجان شرقی پرداخته شود. جهت این کار، از قطعات ژنومی موجود حاصل از آرتی-پی سی آر با استفاده از یک جفت آغازگر دژنره به نام nib2f/nib3a استفاده شد. قطعات دی ان ای 350 جفت بازی حاصل از این آغازگر به پلاسمید ptz57r/t تهیه شده در این تحقیق، متصل و در باکتری escherichi coli dh5? همسانه سازی شدند. باکتری های تراریخت شده با پلاسمید نوترکیب بر روی محیط کشت lb حاوی آمپی سیلین، iptg و x-gal، غربال شده و پلاسمید از آنها به روش لیز آلکالینی استخراج گردید. پلاسمید های استخراج شده با آنزیم های برشی ecor?/hind??? برش داده شدند. به منظور شناسایی گونه ها ی جنس پوتی ویروس و مقایسه ی توالی نوکلئوتیدی بخش تکثیر یافته از ژن nib جدایه ها و مقایسه با سایر جدایه های این جنس، تعیین توالی نوکلئوتیدی انجام گرفت. تمامی 11 جدایه ی مورد بررسی، به عنوان گونه های جنس پوتی ویروس شناخته شدند. هر 11 توالی نوکلئوتیدی به اندازه ی 302 نوکلئوتید (پس از حذف توالی آغازگر ها) در پایگاه اطلاعاتی genbank ثبت گردیدند. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی هر یک از این جدایه ها با توالی های مشابه موجود در genbank انجام گرفت. هفت جدایه به نام های a186, t180, u167, a206, t192,a213 و t41 به عنوان گونه ی ویروس موزائیک هندوانه شناخته شدند و در درخت فیلوژنی در دو گروه مجزا قرار گرفتند بطوریکه 5 جدایه a186, a206 ,t192 ,a213 و t41 در یک گروه قرار گرفته و بیشترین شباهت را با جدایه های ایرانی نشان دادند و دو جدایه-ی t180 و u167 با فاصله ژنتیکی مشخص در گروه دورتری واقع شدند. دو جدایه یa74 و a185 به عنوان ویروس وای سیب زمینی شناخته شده و در یک گروه مجزا و نزدیک به جدایه ایرانی این ویروس قرار گرفتند. جدایه یt209 نیز به عنوان گونه ی ویروس موزاییک سویا شناخته شد و با یک جدایه از کره جنوبی در یک خوشه قرار گرفت. همچنین جدایه ی t210 به عنوان گونه ی ویروس موزاییک زردکدوی فرنگی (زوکینی) شناسایی شد و همراه با جدایه هایی از اسرائیل در یک خوشه قرار گرفتند.

گوجه فرنگی از نظر اقتصادی یکی از مهم ترین محصولات سبزی و صیفی در سطح دنیا می باشد. کشت گوجه فرنگی در ایران از اهمیت خاصی برخوردار می باشد و در سال های اخیر کشت گلخانه ای این محصول رشد فزاینده ای داشته است. بیماری های ویروسی به عنوان یکی از مهم ترین مشکلات موثر در کشت گوجه فرنگی در اکثر مناطق کشت و برداشت این محصول مطرح می باشند. تعدادی از ویروس های آلوده کننده گوجه فرنگی ویروس وای سیب زمینی (pvy)، ویروس ایکس سیب زمینی (pvx)، ویروس موزاییک گوجه فرنگی (tomv)، ویروس موزاییک خیار (cmv)، ویروس پژمردگی لکه ای گوجه فرنگی (tswv) و ویروس موزاییک آرابیس (armv) را شامل می شوند. هدف از این تحقیق بررسی وجود cmv ،tswv ، tomv و tmv می باشد. ویروس پژمردگی لکه ای گوجه فرنگی متعلق به خانواده بنیاویریده و از جنس توسپوویروس می باشد. این ویروس یکی از 10 ویروس گیاهی مخرب می باشد. این ویروس و تریپس ناقل آن همه جا منتشر شده و منجر به خسارت اقتصادی در محصولات کشاورزی می-شود. ویروس موزاییک گوجه فرنگی و ویروس موزاییک توتون متعلق به خانواده ویرقاویریده و از جنس توبموویروس می باشند که از ویروس های شایع و یک مشکل جدی در گوجه فرنگی در اکثر مناطق سبزی کاری دنیا هستند. ویروس موزاییک خیار متعلق به خانواده بروموویریده و از جنس کوکوموویروس می باشد. دامنه میزبانی وسیعی دارد و در مزارع ایران نیز شیوع دارد. از آنجا که ردیابی ویروس ها و بررسی تغییرات ژنتیکی جمعیت آنها گامی موثر در جهت کنترل ویروس ها می باشد، در نتیجه هدف از این تحقیق استفاده از روش های مناسب در ردیابی ویروس های شایع گوجه فرنگی با استفاده از مایه زنی گیاهان محک، روش-های سرولوژیک و مولکولی را شامل می شد. در مطالعه حاضر به منظور ردیابی ویروس های شایع گوجه-فرنگی از مزارع جنوبی آذربایجان شرقی طی تابستان و پاییز سال 1390 تعداد 205 نمونه گیاهی مشکوک به آلودگی با ویروس نمونه برداری شد. علائم شامل موزاییک، کوتولگی، باریک شدن برگ ها، بدشکلی برگ-ها و میوه ها و نکروز برگ ها بودند. در مطالعات گلخانه ای از گیاه سلمه تره (chenopodium amaranticolor) به عنوان میزبان لکه موضعی برای خالص سازی بیولوژیک و از کدو (cucurbita pepo) و توتون (nicotiana samson) به عنوان میزبان های تکثیری و تشخیصی ویروس های مذکور استفاده شدند. tas-elisa با آنتی بادی های تشخیص دهنده ویروس موزاییک خیار انجام شد و از 105 نمونه ای که مشکوک به آلودگی با cmv بودند 28 نمونه واکنش مثبت نشان دادند. آرتی-پی سی آر برای ویروس های cmv، اعضای جنس توسپوویروس و جنس توبموویروس انجام شد. برای جنس توسپوویروس، پی سی آر با یک جفت آغازگر منطبق بر قسمتی از آر.ان.ای بزرگ (l) و با دمای اتصال c?48 منجر به تکثیر قطعه مورد انتظار به طول 800 جفت باز در شش نمونه آلوده شد. قطعات تکثیر یافته با پی سی آر با آنزیم های hindiii و ecori برش یافته و قطعه ای به طول 800 جفت باز ایجاد شد که نشان داد این جدایه ها متعلق بهtswv می باشند. برای جنس توبموویروس، پی سی آر با یک جفت آغازگر منطبق بر پروتئین پوششی و انتهای 3 و با دمای اتصال c?50 منجر به تکثیر قطعه مورد انتظار به طول 800 جفت باز در 37 نمونه آلوده شد. قطعات تکثیر یافته با پی سی آر با آنزیم taqi برش یافته و دو قطعه به طول 282 و 430 جفت باز ایجاد شد که تعلق نمونه ها به tomv طبق پروفایل برشی را نشان می داد. در این تحقیق tmv در نمونه های جمع آوری شده ردیابی نشد. در مورد ویروس موزاییک خیار، پی سی آر با یک جفت آغازگر منطبق بر ژن رمز کننده پروتئین پوششی و با دمای اتصال c?50 منجر به تکثیر قطعه مورد انتظار به طول 870 جفت باز در شش نمونه شد. قطعات تکثیر یافته در پی سی آر با آنزیم mspi برش یافته و نشان داده شد که جدایه ها در زیر گروه i ویروس موزاییک خیار قرار دارند. قطعات تکثیر یافته 800 جفت بازی tswv به پلاسمید ptz57r متصل و در باکتری e. coli dh5? کلون شدند. باکتری های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب بر روی محیط کشت lb حاوی آمپی سیلین، iptg و x-gal غربال شده و پلاسمید از آنها به روش لیز آلکالینی استخراج گردید. پلاسمیدهای استخراج شده با آنزیم های ecori و hindiii با محل اثر در دو طرف محل اتصال دی.ان.ای خارجی برش داده شدند. پلاسمید برای تعیین توالی به شرکت bioneer کره جنوبی ارسال شد و بعد از آنالیز توالی ها تعلق جدایه ها به ویروس پژمردگی لکه ای گوجه فرنگی اثبات شد.

سیب زمینیs.tuberosum گیاه یک ساله علفی دو لپه ای می باشد و در مناطقی که غده ها بتوانند در بین فصول زراعی بقا یابند به صورت چند ساله رشد کرده و به عنوان یک گیاه صنعتی و پر درآمد بصورت جهانی کشت می شود. خاستگاه این گیاه کوه های آند آمریکایی جنوبی می باشد، جایی که سیب زمینی یکی از ارکان رژیم غذایی میلیون ها نفر از افراد بومی می باشد. امروزه سیب زمینی غالبا برای مصارف انسانی کشت می شود، و در طول تنها چهار قرن اخیر، سیب زمینی بعد از برنج، گندم و ذرت، تبدیل به چهارمین محصول غذایی بزرگ در سطح جهان شده است. چین بزرگترین تولید کننده آن بوده و فدراسیون روسیه، ایالات متحده آمریکا و لهستان به ترتیب در رتبه های بعدی قرار گرفته اند (خانیزاد و همکاران، 1389). سازمان خواربار و کشاورزی ملل متحد (فائو) تولید سیب زمینی ایران را در سال 2010 رقمی معادل چهار میلیون و 54 هزار تن تخمین زده است. بر این اساس، ایران رتبه پانزدهم را در جدول بزرگ ترین کشور های تولیدکننده سیب زمینی از نظر میزان تولید به خود اختصاص داده است. بیماری های ویروسی در طول قرن گذشته نقش مهمی را در کاهش توسعه صنعت سیب-زمینی بازی کرده اند به طوری که حداقل 37 گونه ی ویروسی به صورت طبیعی موجب آلودگی سیب-زمینی می شود که potato virus y یکی از مهم ترین آن ها بوده و دارای پراکنش جهانی است، در ایران نیز این ویروس از استان های اصفهان، خراسان، اردبیل، همدان و آذربایجان شرقی گزارش شده است (قاسم زاده و همکاران. 1389). علایم آن روی گیاهان سیب زمینی بسته به نژاد ویروس و رقم سیب-زمینی از موزاییک خفیف گرفته تا نکروز شدید شاخ و برگ و حتی مرگ گیاهان آلوده متغیر است. انتشار با شته های ناقل به عنوان یکی از مهم ترین راههای انتقال طبیعی ویروس در مزرعه است هر چند که این ویروس به صورت مکانیکی و از طریق تماس شاخ و برگ یا غده بین گیاهان انتشار پیدا می کند. ویروس yسیب زمینی از جهت ایجاد علایم روی گیاهان مختلف و از جهت پاسخ سرولوژیک به آنتی بادی های مونوکلونال به 3 گروه تقسیم می شوند: استرین n در توتون باعث ایجاد کلروز در رگبرگ ها می گردد و در سیب زمینی علایم خفیفی ایجاد می کند. از این گروه نژاد ntn در اروپا در سال های اخیر شناسایی شده است. نژاد cدر برخی ارقام سیب زمینی باعث موزاییک سیستمیک و خطوط نقطه چین در برگ ها می شود، نژاد o در برگ های توتون باعث موزاییک و پیسک و در سیب زمینی باعث پیسک یا موزاییک شدید و افتادگی برگ ها می شود. خسارت ناشی از این ویروس بسته به نژاد آن ممکن است به صورت موزاییک, پیسک, زخم, کوتولگی و نکروز باشد (خانیزاد و همکاران، 1389). روش های سرولوژیک به عنوان یکی از متداول ترین روش های ردیابی ویروس های بیماری زای گیاهی مورد استفاده قرار می گیرند به دلیل اینکه نسبت به سایر روش ها نیاز کمتری به زمان و امکانات دارند. برای انجام این روش ها (سرولوژیک) نیاز به آنتی بادی ویژه ی ویروس می باشد که، معمولا به روش سنتی برای تولید این آنتی بادی ها از پیکره های خالص سازی شده ی ویروس استفاده می شود. با توجه به مشکلاتی که این روش دارد، مثلا این روش نیازمند زمان و هزینه ی بیشتر و امکانات مخصوص مانند التراسانتریفوژ است که در همه ی آزمایشگاه ها وجود ندارد. همچنین، قیمت آنتی بادی های تجارتی ویروس ها زیاد و برخی از ویروس های گیاهی در گیاه دارای غلظت کمی بوده و در حین مراحل خالص سازی ناپایدارند بنابراین، به نظر می رسد که استفاده از پروتئین های نوترکیب ویروسی از جمله بیان پروتئین پوششی برای تهیه-ی آنتی بادی های نوترکیب می تواند این مشکلات را مرتفع سازد. در راستای تولید چنین پروتئین های نوترکیب، بایستی آن ها را در سیستمی مانند سیستم پروکاریوتی بیان کرد. در این تحقیق، از بیان ژن پروتئین پوششی این ویروس در باکتری escherichia coli به جای خالص سازی ذرّات ویروسی به منظور تهیه ی آنتی بادی چند همسانه ای علیه نژادهای pvy، استفاده شد. پس از بیان ژن مورد نظر، بیان آن با استفاده از آزمون های مثل sds-page و وسترن بلاتینگ ، مورد بررسی قرار گرفت که نتایج به دست آمده حاکی از بیان این پروتئین نوترکیب بود.

ویروس موزاییک زرد کدو zucchini yellow mosaic virus (zymv) مترادف muskmelon yellow stunt virus ، عضو جنس potyvirus از خانواده potyviridaeبوده و اولین بار در سال1973از ایتالیا گزارش شده است(2). در ایران این ویروس اولین بار در سال 1367 از تهران گزارش شد. این ویروس از اکثر مناطق جهان گزارش شده و از بیماری های مهم از روی خیار در منطقه حوزه دریای مدیترانه می-باشد. دامنه میزبانی آن خانواده های aizoaceae، amaranthaceae(تاج خروس)، chenopodiaceae(اسفناجیان)، compositae(مرکبان)، cucurbitaceae(کدوییان)، labiatae(نعناییان)، leguminosae(حبوبات)، ranunculaceae(آلالگان)، scrophulariaceae(گل میمون)، solanaceae(سیب زمینی) وumbelliferacae (گل جعفری) می باشد. علایم بیماری شامل موزاییک، زردی، کوتولگی، تغییر شکل میوه ها و دانه ها در کدو، تیل، خیار و هندوانه می باشد.zymv از طریق چند ین گونه شته از جمله شته سبز هلو به طریق ناپایا منتقل می شود و در کدو به صورت بذر زاد قابل انتقال میباشد. ذرات zymv به صورت رشته های انعطاف پذیر به طول 750 نانومتر است که حاوی rna تک رشته ای مثبت می باشد. هدف از این تحقیق بیان ژن کامل کپسید پروتئینی این ویروس در سیستم پروکاریوتیک باکتری escherichia coli می بود. با توجه به اینکه خالص سازی ویروس نیازمند امکانات گسترده مانند سانتریفوژهای با سرعت بالا و التراسانتریفوژ می باشد که در اغلب آزمایشگاه های کشور وجود ندارد، تولید آنتی بادی های نوترکیب با استفاده از پروتئین پوششی نوترکیب می تواند این مشکل را مرتفع سازد. بیان ژن کپسید پروتئینی ویروس باعث ایجاد ذرات شبه ویروسی در باکتری میگردد که این پیکره های تو خالی به عنوان نانو متریال مورد استفاده قرار میگیرد. بنابرین با بیان ژن کپسید ویروس موزاییک کدوی فرنگی زمینه برای استفاده از آن به عنوان ماده نانو در آینده فراهم خواهد شد. به همین منظور، ژن پروتئین پوششی ویروس مورد نظر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی در آزمون pcr تکثیر داده شد. برای تهیه ی سازه ی بیان، قطعه ی تکثیر یافته در پلاسمید همسانه سازی (ptz57r-t) قرار داده شد و با آنزیم های مناسب که محل اثر آنها در روی هر دو حامل همسانه سازی و بیان (pet22b) وجود داشت بریده شد و به منظور قرارگیری در پلاسمید بیان، قطعه مورد نظر از پلاسمید همسانه سازی خارج شد و در پلاسمید بیان قرار داده شد. سازه ساخته شده به باکتری بیان مناسب (rosetta) انتقال داده شد و بهینه سازی بیان ژن در میزبان باکتریایی (سویه ی rosetta باکتری e.coli) انجام گردید. به منظور بررسی بیان ژن پروتئین پوششی در e.coli پس از استخراج پروتئین، الکتروفورز عمودی در ژل پلی آکریل آمید(sds-page) انجام شده و باندی در حدود 35 کیلو دالتون مشاهده گردید، با لکه گذاری وسترن(western blotting) بیان ژن در باکتری مورد تآیید قرار گرفت.

چکیده: سیب با نام علمی malus × domestica brokh. یکی از رایج ترین میوه کشت شده در مناطق معتدله می باشد که طول دوره نونهالی آن بر حسب رقم 5 تا 12 سال می باشد. اصلاح صفت طول دوره نونهالی دانهال-های سیب در درجه اول اهمیت قرار دارد، چرا که این صفت باعث افزایش زمان و هزینه لازم برای اصلاح ژنوتیپ های مختلف سیب می شود. کوتاه کردن دوره نونهالی درختان میوه می تواند از طریق مهندسی ژنتیک با خاموش کردن یا کاهش تظاهر ژن های ممانعت کننده گلدهی عملی شود. در این راستا، در این تحقیق برخی ژن های احتمالی ممانعت کننده درگیر در مسیر گلدهی سیب از جمله همولوگ های atsef و attem شناسایی و الگوی بیان آن ها و نیز ژن های احتمالی پایین دست آنها (mdsoc1 و mdft) در بافت های مختلف بررسی شد. بررسی های بیوانفورماتیک مشخص کرد که mdsef1، mdsef2 و mdsef3 به عنوان همولوگ های atsef، در سیب به ترتیب 64%، 65% و 65% با atsef شباهت داشتند. بررسی همردیفیmdsef1 با توالی های دیگر نشان داد که pyrus × bretschneideri 92% شباهت دارد. blastp توالی اسید آمینه ای ژن tem آرابیدوپسیس با سیب 2 توالی بسیار مشابه mdtem1و mdtem2 را به ترتیب با شباهت 60% و 61% با attem ، نشان داد. نواحی رمزآور 776 جفت بازیmdsef1 و 1228 جفت بازی mdtem1 برای اولین بار جداسازی و همسانه سازی شد. بررسی نیمه کمی بیان ژن، وجود رونوشت mdsef1 وmdsef2 را در تمام بافت ها بجز ریشه ثابت کرد. بررسی بیان کمی نشان داد که بیان mdsef1 در برگ نونهال در مقایسه با سایر بافت ها بیشتر است. در حالیکه بیشترین میزان بیان mdsef2 در بافت میوه مشاهده شد. همچنین مشخص شد که بیان mdsoc1 در بافت برگ بیشترین مقدار است. بررسی نیمه کمی mdtem1 بیان آن را در تمام بافت ها نشان داد اما mdtem2 در بافت ریشه مشاهده نشد. بررسی کمی بیان mdtem1 نشان داد که در بافت برگ نونهال بیشترین مقدار را دارد. درحالیکه بیشترین بیان mdtem2 در ساقه بالغ بوده است. بررسی کمی بیان ژن های مورد مطالعه، همچنین، نشان داد که بیان ژن mdft در بافت میوه بیشترین مقدار را دارد در حالیکه در بافت های برگ بالغ و نونهال و ساقه نونهال بیان آن فوق العاده کم بوده است.

چکیده ندارد.

ویروس موزاییک خیارcucumber mosaic cucumovirus (cmv) از خانواده bromoviridae یکی از مهمترین ویروس های بیمارگر کدوییان می باشد. جنس cucumovirus از خانواده bromoviridae دارای سه عضو، ویروس موزائیک خیار ((cmv، ویروس بی بذری گوجه فرنگی ((tav و ویروس کوتولگی بادام زمینی (psv) می باشد. cmv با پراکنش جهانی، وسیع ترین دامنه میزبانی را در بین ویروس های گیاهی داشته که در مزارع ایران نیز شیوع دارد و باعث کاهش راندمان محصول تا بیش از یک سوم می شود. استرین های ویروس موزائیک خیار در دو گروه بزرگ (? و ??) قرار می گیرند که بر اساس اطلاعات سرولوژیکی، هیبریداسیون، توالی نوکلئوتید و اطلاعات پروتئین پوششی توصیف می شوند. این دو گروه در حدود 75% توالی نوکلئوتیدی با همدیگر مشابهت نشان می دهند، این در حالیست که این استرینها در همان زیر گروه 97%-99% در توالی نوکلئوتیدی مشابهت دارند. این ویروس ها دارای ژنوم چند بخشی شامل سه قطعه آر. ان. ای تک رشته ای و آر. ان. ای های زیر ژنومی می باشند. rna1 بعنوان بزرگترین قطعه بوده و دارای 3357 نوکلئوتید و پروتئین 1a را کد می کند. rna2 حاوی 3050 نوکلئوتید و پروتئین 2aرا کد می کند. پروتئین های 1aو 2a برای همانند سازی آر. ان. ای ویروسی ضروری هستند.rna3 حاوی حدود 2200 نوکلئوتید و دارای دو سیسترون می باشد پروتئین 3a توسط orf قرار گرفته در مجاورت ?5 رمز می شود این پروتئین برای حرکت سلول به سلول در میزبان مورد نیاز است. دومین orf موجود درrna3، پروتئین پوششی (kda24) را کد می کند که در طرف ´3 مولکول rna3 قرار گرفته واز طریقrna4 زیر ژنومی کد می شود. هدف این تحقیق بیان ژن پروتئین پوششی ویروس موزائیک خیار در باکتریescherichia coli بدون نیاز به خالص سازی ویروس بود. تولید پادتن نوترکیب، نیاز به خالص سازی ویروس را که مستلزم وجود الترا سانتریفوژ است، مرتفع می سازد. به منظور تولید پروتئین پوششی نوترکیب، قاب خواندنی شماره چهار (rna4)، rna سوم ویروس که پروتئین پوششی را رمزگردانی می کند به کمک دو آغازگر اختصاصی از روی cdnaکامل ویروس توسط pcrتکثیر و به حامل همسانه سازی (ptz57r/t) متصل و در باکتریe. coli dh5 کلون شدند باکتری های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب برروی محیط کشت lb حاوی آمپی سیلین، iptg و x-gal غربال شدند و پلاسمید از آنها به روش لیز آلکالینی استخراج گردید. پلاسمید های استخراج شده با آنزیم های bam hiو sac i با محل اثر در دو طرف محل اتصال دی ان ای خارجی برش داده شدند، قطعه ی مورد نظر افزایش و به حامل بیان pet22b(+) اتصال داده شد بود. پس از بیان پروتئین پوششی cmv در e. coli rosseta اندازه ی آن در sds-page بررسی شد. وزن مولکولی این پروتئین در حدود 24 کیلو دالتون که منهای تعداد اسیدآمینه های افزوده شده توسط حامل، با اندازه ی پروتئین پوششی cmv مطابقت داشت.

در این بررسی ، روش حساستر آر .تی - پی . سی . آر . برای ردیابی جدایه ها استفاده شد . آزمون آر . تی - پی . سی . آر . بر روی 9 جدایه از 13 جدایه مورد بررسی انجام گرفت . برای این منظور ، از یک جفت پرایمر طراحی شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن پوشش پروتئینی نژاد ‏‎q‎‏ ویروس موزائیک خیار ‏‎(cmv-q)‎‏ که تکثیر قطعه ای به طول 866 جفت باز از اسید نوکلئیک کل استخراج شده از برگ آلوده به ویروس را امکان پذیر می نمود ، استفاده شد . با استفاده از این همین پرایمر ها ، هنگامی که عصاره های استخراجی از گیاهان سالم به عنوان شاهد در آزمون ‏‎rt-pcr‎‏ مورد استفاده قرار گرفتند هیچ گونه فرآورده پی . سی . آر مشاهده نشد .به این ترتیب ، این پرایمر ها که در اصل برای ردپابی جدایه های ‏‎cmv‎‏ در استرالیا مورد استفاده قرار گرفته بودند ، در تشخیص جدایه های ایرانی نیز مناسب واقع شدند .