هدف این تحقیق بررسی تأثیرات انجماد شیشه ای کمپلکس های تخمک–کومولوس (توده های coc) گوسفند بر بقای توده ها، بلوغ تخمک ها، بیان ژنهای بلوغ و آپوپتوزی، شیوع ناهنجاریهای کروموزومی و تغییرات فراساختاری توده ها بود. توده های coc جدا شده دارای کیفیت خوب به چهار گروه، غیرانجمادی کنترل، انجمادی conventional straw ، cryotop و solid surface تقسیم شدند. در گروههای انجمادی conventional straw وcryotop، توده های منجمد شیشه ای شده به ترتیب در درون نی انجمادی و بر روی نوک نوارcryotop قرار گرفتند و مستقیماً در نیتروژن مایع غوطه ور شدند درحالیکه در گروه انجمادی solid surface، توده های منجمد شیشه ای شده پس از قرار گرفتن بر رویcryotop ، ابتدا سرد و سپس به نیتروژن مایع منتقل شدند. پس از بررسی بقا، توده های coc سالم به همراه توده های تازه گروه کنترل، در شرایط آزمایشگاهی بالغ شده و وضعیت هسته ای تخمک ها ارزیابی شد. علاوه بر آن، بیان نسبی ژنهای بلوغ و آپوپتوزی با روش کمی real-time pcr مورد ارزیابی قرار گرفت و شیوع ناهنجاری کروموزومی نیز با روش کاریوتیپ بررسی شد. در آخر، تغییرات فراساختاری توده های منجمد شده و تخمک های منجمد و بالغ شده نیز بین گروههای مختلف مقایسه شد. نتایج نشان داد که میزان بقای توده های منجمد و ذوب شده در گروههای cryotop و solid surface نسبت به گروه conventional straw بالاتر بود (به ترتیب 2/85 ± 83/84 و 1/72 ± 78/56 در برابر 1/48 ± 63/43% ، 0/05>p)، بعلاوه اگر چه در گروه cryotop، میزان بلوغ تخمک ها شبیه به گروه کنترل بود (3/09 ± 48/81 در برابر 3/01 ± 51/94%) ولی در مقایسه با سایر گروههای انجمادی درصد بالاتری داشت (3/09 ± 48/81 در برابر 1/69 ± 36/60 و 2/51 ± 6/09% ، 0/05>p). با وجود کاهش بیان نسبی ژنهای بلوغ (gdf9 و bmp15) پس از انجماد شیشه ای، گروه cryotop در میان گروههای انجمادی، بیشترین بیان را به خود اختصاص داده بود. بالاترین میزان بیان گیرنده bmprii در گروه کنترل بود، در حالیکه گیرنده alk5 میزان بیان مشابهی را در تمام گروهها داشت. بیان ژنهای پروآپوپتوزی (بجزbax) و ضدآپوپتوزی در گروه cryotop در مقایسه با سایر گروههای انجمادی بیشتر بود. ژن bax در گروه solid surface بیش از حد بیان شده بود. گروه conventional straw نیز پایین ترین میزان بیان ژنهای آپوپتوزی را نشان داد. میزان شیوع ناهنجاری کروموزومی در گروه cryotop نسبت به گروه کنترل بیشتر بود (5/42 در برابر 20% ، 05/0<p). همچنین نتایج بررسی های فراساختاری نشان داد که انجماد شیشه ای با روشهای cryotop و solid surface سازمان دهی کلی اووپلاسم را حفظ کرده در حالیکه انجماد conventional straw این سازمان دهی را بهم ریخته بود. علاوه بر آن پس از انجماد شیشه ای، تعداد واکوئل ها در اووپلاسم افزایش یافت، گروهی از این واکوئل ها به صورت جزیی یا کامل با چربی پر شده و گروهی نیز دارای داربست میکروفیلامنتی بودند. در تمام گروههای انجمادی، توزیع میتوکندریها به حالت گروه گروه در اطراف قطرات چربی در آمده بود و پس از انجماد conventional straw، میتوکندریهای متسع و حتی پاره نیز مشاهده شدند. اتصالات فاصله دار میان تخمک و سلول های کومولوس اطراف و کمپلکس های اتصالی بین سلول های کومولوس در دو گروه انجمادی cryotop و solid surface به خوبی حفظ شده در حالیکه در گروه انجمادی conventional staw، سلول های کومولوس زوایدشان را از منطقه شفاف به عقب کشیده بودند. در تخمک های بالغ نیز از تعداد و تراکم گرانولهای قشری پس از انجماد conventional straw و solid surface کاسته شده بود. در نهایت، انجماد با روش cryotop در مقایسه با دو روش انجمادی دیگر روش مطمئنی بنظر رسیده و می تواند بقا، بلوغ پس از ذوب و میزان بیان ژنهای بلوغ را افزایش دهد و همانند گروه کنترل سبب القای مرگ سلولی از طریق مسیر آپوپتوزی گردد. بعلاوه این روش فراساختار توده های coc را نیز بخوبی حفاظت می کند ولیکن کاستی هایی در زمینه حفظ سازمان دهی کروموزومی تخمک از خود نشان می دهد.

فیبروز کبدی که به دنبال پاسخ ترمیمی کبد به آسیبهای مزمن اتفاق می افتد یکی از مهمترین مشکلات جوامع بشری در حوزه سلامت است؛ و در حال حاضر تنها راه درمانی چنین بیمارانی در مراحل پیشرفته آن، پیوند کبد می باشد. اما متاسفانه در این زمینه نیز مشکلات عدیده ای، از جمله کمبود عضو اهدایی، امکان رد پیوند، عمل جراحی پیچیده و هزینه گزاف وجود دارد. مطالعات اخیر نشان داده اند که طب ترمیمی قابلیت آن را دارد که به عنوان یک جایگزین در درمان چنین بیمارانی مطرح باشد. همچنین سلولهای مزانشیمی مغز استخوان توانایی تمایز به سلولهای کبدی را در محیط آزمایشگاهی و بدن دارند. اما همواره میزان و کیفیت تمایز این سلولها و نیز نقش آنها در ترمیم کبد بسیار پایین بوده است. به همین خاطر در مطالعه حاضر سعی شد تا راهکارهایی برای تمایز بهتر سلولهای مزانشیمی در محیط کشت و پیوند موثرتر آنها به کبد ارائه شود.در این مطالعه ابتدا سلولهای مزانشیمی مغز استخوان موش در حضور و عدم حضور بستر نانو رشته ای (گروه نانو مثبت و نانو منفی) به سلولهای شبه هپاتوسیتی اولیه (روز 18) و نهایی (روز 36) تمایز داده شدند؛ و بیان ژنها و پروتئینهای اختصاصی هپاتوسیتی آنها توسط روشهای real-time pcr و ایمنوفلورسنت بررسی شده، همچنین فراساختار سلولها با روشهای الکترون میکروسکوپی مطالعه شده، و عملکرد آنها با واکنش های pas و prod، و نیز اندازه گیری میزان ترشحات اختصاصی کبدی مورد بررسی قرار گرفت. در مرحله بعدی مطالعه سلولهای مزانشیمی و نیز سلولهای شبه هپاتوسیتی اولیه و نهایی گروه های نانو مثبت و منفی به موشهای مدل فیبروز کبدی ناشی از تتراکلرید کربن پیوند شدند. یافته ها نشان داد که بسیاری از شاخص های هپاتوسیتی بالغ، نظیر بیان آلبومین، hnf4a، کانکسین-32 و سیتوکروم 1a1، همچنین تولید و ترشح اوره، آلفافتوپروتئین و آلبومین، و نیز فعالیت آنزیم سیتوکروم p450 در سلولهای شبه هپاتوسیتی نهایی گروه نانو مثبت بالاتر از گروه نانو منفی بود. از طرفی دیگر مطالعه پیوند سلولی مشخص ساخت که سلولهای شبه هپاتوسیتی نهایی گروه نانو مثبت در مقایسه با گروه های نانو منفی و مزانشیم تیمار نشده، توانسته بودند با درصد بالاتری در بافت کبدی جایگزین شده، به هپاتوسیتهای فعال (آلبومین مثبت) تبدیل شوند و میزان آلبومین سرمی را بطور معنی داری افزایش و نیز میزان فیبروز را کاهش دهند. این یافته ها بیانگر آن است که خصوصیات توپوگرافیک حاصل از بستر نانو رشته ای می تواند موجب تمایز بهتر و حفظ عملکرد سلولهای شبه هپاتوسیتی مشتق از سلولهای مزانشیمی مغز استخوان موش شده، و آنها را برای اهداف سلول درمانی مساعد تر سازد.

چکیده: انجماد اسپرماتوزوا یک جزء بسیار مهم از تکنیکهای کمک باروری (art) است که امید و شانس باروری در آینده را افزایش می دهد. امروزه برای بهبود پروتکلهای انجمادی سیمن ، از آنتی اکسیدانها استفاده می نمایند تا اسپروماتوزوا در برابر آسیبهای مخرب انواع اکسیژن فعال (reactive oxygen speices) ros ، و اکسیداتیو استرس ناشی از آن مصون بماند. هدف از این مطالعه ارزیابی، اثرات افزودن آنتی اکسیدانهای تائورین(taurine)، سیستئین(cysteine)، بر روی استرس اکسیداتیو و پارامترهای اسپرم منجمد شده بود. برای رسیدن به این هدف از باقیمانده مایع منی 40 نفر که به پژوهشکده رویان مراجعه نموده و بر اساس معیارهای استاندارد whoو kruger criteria (morphology?15% , motility?60%) دارای اسپرم طبیعی بودند، استفاده شد. نمونه مایع منی به 2 بخش تقسیم گشته، قسمتی بعنوان تازه، آنالیز میشود. قسمت دوم با استفاده از آلگرید و ham’s-f10پردازش شده و دوباره به 3 قسمت، به صورت بدون آنتی اکسیدان(گروه کنترل فریز)، دارای آنتی اکسیدان تائورین با دو دوز 25و 50 میلی مولار و یا دارای آنتی اکسیدان سیستئین با دو دوز 5 و 10 میلی مولار و با روش انجماد سریع با مدیوم انجمادی hspm بصورت 1:1 منجمد شدند و در نهایت اسپرمها پس از ذوب، بررسی شدند. برای بررسی موتیلیتی از سیستم کامپیوتری و برنامه های ویژه آن (casa)، توان زنده مانی از رنگ آمیزی تریپان بلو، مورفولوژی از تست پاپانیکولائو، اندازه گیری میزان ros ، rns از dcfh-da به روش اسپکتروفلورومتری، قطعه قطعه شدن dna از(scd) sperm chromatin dispersion و برای تشخیص کمبود پروتامین از رنگ آمیزی کرومایسین (cma3) a3 استفاده شد. در انتها پس از بررسی آماری نتایج با روش anova معلوم گشت، پردازش اسپرم، سبب جداسازی اسپرمهای متحرک و سالم شده و در نتیجه سبب بهبود کیفیت آنها می شود. اما فرایند انجماد – ذوب سبب کاهش کیفیت پارامترهای کلاسیک شده و از سوی دیگر میزان ros, rns را افزایش میدهد. افزودن آنتی اکسیدان تائورین تنها با دوز 25 میلی مولار توانست سبب بهبود درصد تحرک کلاس (a) و (a+b) و کمبود پروتامین پس از انجماد و ذوب، نسبت به گروه کنترل شود. ولی هیچ یک از دوزهای تائورین نتوانست سبب بهبود درصد فاکتورهای مورفولوژی، توان بقای اسپرمها، و قطعه قطعه شدن dna پس از انجماد و ذوب شود. با بررسی میزانros, rns نیز مشخص شد که تائورین نتوانسته سبب کاهش آنها گردد. . آنتی اکسیدان سیستئین با دوز 5 میلی مولار تنها توانست سبب بهبود درصد توان زنده مانی و کاهش میزان rns نسبت به گروه کنترل فریز شوند. همچنین دوز 5 میلی مولار سیستئین نتوانست سبب بهبود درصد تحرک کلاس (a)، کاهش درصد ابنرمالیتی، کمبود پروتامین، قطعه قطعه شدن dna و میزان ros شود. افزوده آنتی اکسیدان سیستئین با دوز 10 میلی مولار سبب بهبود درصد موتیلیتی، توان زنده مانی و کاهش درصد ابنرمالیتی و میزانros rns, نسبت به گروه کنترل فریز شوند. همچنین دوز 10 میلی مولار سیستئین نتوانست سبب کاهش کمبود پروتامین و قطعه قطعه شدن dna شود. در نتیجه میتوان بیان داشت که دوز 10 میلی مولار سیستئین با کاهش سطوح ros ،rns سبب بهبود پارامترهای استاندارد شده است. واژه های کلیدی:

هدف این مطالعه بررسی اثر سیستم هم کشتی با سلولهای گرانولوزا مورال بر بلوغ توده های coc گوسفند بوده است، همچنین مراحل بلوغ هسته و سطح بیان ژنهای بلوغ و رسپتورهای آنها در دو مرحله ژرمینال وزیکول (gv) و متافاز دوم (mii) ارزیابی شد. توده های coc جدا شده از تخمدان بطور تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند: در گروههای کنترل توده های coc به ترتیب بمدت 3 و 27 ساعت در محیط بلوغ قرار گرفتند (3h control and 27h control) و در گروههای هم کشتی توده های coc به ترتیب بمدت 3 و 27 ساعت در محیط بلوغ هم کشت با سلولهای گرانولوزا مورال قرار گرفتند (3h coculture and 27h coculture). یک روز قبل از هم کشتی غیر تماسی، سلولهای گرانولوزا با تعداد 120 - 110 هزار سلول در چاهک ظروف چهار خانه کشت داده شدند. توده های coc خوب روی فیلتر insert قرار گرفته و سپس فیلتر درون چاهک پوشیده از سلولهای گرانولوزا گذاشته شد. مرحله بلوغ تخمک بوسیله رنگ آمیزی با هوخست تعیین گردید و حالتهای بلوغی آنها مشخص گردید (gv و mii). سطح بیان ژنهای بلوغ (bmp15, bmp6, gdf9) و رسپتورهای آنهاalk3(bmpria) ,alk5(tgf?ri) alk6(bmprib) ,bmprii , actriib وhas2 و ptgs2 نیز بوسیله real time pcr بررسی گردید. مقایسه میزان بلوغ تخمکها مشخص می کند که درصد تخمک های مرحله mii بطور معنی داری در گروه هم کشتی در مقایسه با گروه کنترل بالاتر است (p<0.05). نتایج بیان کمی ژنهای بلوغ بوسیله real time نشان داد که در مورد ژنهای bmp15, bmp6, alk3, has2 و ptgs2 تفاوت معنی داری بین گروهها وجود ندارد. بیان ژنهای actriib, bmprii و alk6 در گروه کنترل 27 ساعته نسبت به سایر گروهها افزایش معنی داری داشته است(p<0.05)، همچنین بیان اکثر ژنها نیز در تخمکهای mii گروه هم کشتی نسبت به گروه کنترل کاهش داشته است. نتیجه گیری: استفاده از سیستم هم کشتی با سلولهای گرانولوزا مورال در طی بلوغ آزمایشگاهی تخمک باعث افزایش میزان بلوغ تخمکها (تخمکهای mii) و بهبود سطح بیان اکثر ژنها می شود.

هدف از انجام این مطالعه ، بررسی اثر ros درون سلولی اسپرم بر روی پارامترهای کلاسیک ، شکست (df) dna، تغییرات پتانسیل غشا میتوکندریmmp) )، مرگ سلولی ( (apoptosisبا استفاده از تکنیک فلوسایتومتری و ارتباط آن با میزان لقاح و مورفولوژی جنین ها در مردان نابارور کاندید درمان تزریق درون سیتوپلاسمی (icsi) بود. بدین منظور 28 نمونه منی افراد normospermic و 62 نمونه منی بیماران کاندید icsi از زوج های نابارور مراجعه کننده به پژوهشگاه رویان جمع آوری شد . نمونه افراد normospermic توسط سه تکنیک swim- up، swim- up from semen و density gradient centrifugation (dgc) و بیماران منتخب icsi توسط روش swim- up پردازش شدند. تمامی نمونه های جمع آوری شده قبل و بعد از پردازش از نظر کیفیت پارامترهای کلاسیک اسپرم بررسی شده و سپس جهت مطالعه پارامترهای درون سلولی توسط فلوسایتومتری ، رنگ های dcfh-da ،dhe برای اندازه گیری ros ، کیت هایtunel و vy brant apoptosis به ترتیب به منظور شناسایی میزان شکست dna ، سلول های آپپتوزی و jc-1 برای مطالعه mmpبه کار گرفته شد. در افراد normospermic ، نمونه ها پس از swim-up بالاترین سطح h2o2 (05/0p<) نسبت به swim- up from semen و dgc بیشترین میزان df را در مقابل swim- up (05/0p<) دارا بودند. این در شرایطی بود که میانگین آپوپتوز ، مرگ سلولی و°¯ o2 در مقایسه با دو تکنیک دیگر افزایش چشمگیری (05/0p<) داشت. در همین حال در بیماران کاندید icsi ، کاهش mmp ارتباطی معنی دار با سطح ros برقرار نموده (01/0p<) و بالا رفتن h2o2 در پایین آمدن تعداد 2pn تاثیر گذار بود(01/0p<). به نظر می رسد دو تکنیک swim-up و dgc را می توان با انجام برخی اصلاحات برای جلوگیری از تولید ros و افزایش شکست dna، جهت پردازش نمونه های normospermic استفاده نمود.در بیماران کاندید icsi، ضمن آن که هرگونه اختلال در عملکرد میتوکندری در ناحیه midpiece اسپرم می تواند باعث آزاد شدن رادیکال های آزاد اکسیژنی به فضای سیتوپلاسمی شده و باعث نقص در فعالیت اسپرم و به ویژه کاهش تحرک گردد، نتایج حاضر بیانگر آن است که سطح بالای h2o2 درون سلولی اسپرم اگرچه بر روی پارامترهای کلاسیک و آپوپتوز تاثیر سویی نداشت امّا می تواند خللی در تشکیل پیش هسته ها ایجاد نموده و در کاهش کیفیت مورفولوژی جنین ها نقش داشته باشد.

انجماد شیشه ای و کشت آزمایشگاهی فولیکولهای پره آنترال، روشی مناسب جهت حفظ باروری افراد در معرض خطر ناباروری است، اما هنوز اثرات این روش بر الگوی بیان ژن های بلوغ در موش سوری بررسی نشده است. جهت انجام این مطالعه، فولیکولهای پره آنترال متوسط از تخمدان های موش سوری نابالغ جدا و به دو گروه انجمادی و کنترل تقسیم شدند. در گروه انجمادی، فولیکولها به ترتیب در محلول های تعادل و انجمادی شستشو داده شده و سپس توسط حامل کرایوتاپ در نیتروژن مایع غوطه ور شدند. این فولیکول ها پس از ذوب در محلولهای سوکروز با غلظت های نزولی، به همراه فولیکولهای گروه کنترل به مدت 13 روز کشت داده شدند. میزان بقا 3-2 ساعت، 4، 8 و 12 روز پس از کشت و همچنین میزان بیان کمی ژن های بلوغ 3-2 ساعت، 4، 8 و 13 روز پس از کشت در هر دو گروه بررسی گردید. در نهایت میزان بلوغ تخمکهای هر دو گروه نیز در روز 13 با یکدیگر مقایسه شد. در بررسی میزان بقای فولیکولها طی روزهای مختلف کشت، گروه انجمادی در همه روزها بقای کمتری را نسبت به گروه کنترل نشان داد (p<0.05). بررسی میزان بلوغ تخمک ها نیز نشان داد که در گروه انجمادی تخمک های بیشتری از مرحله gv خارج شده (p<0.05) و به مرحله mii رسیدند (p>0.05). در ارزیابی کمی بیان ژنی نیز در اکثر ژن های بلوغ و گیرنده میزان بیان در گروه انجمادی به خصوص در روزهای اولیه کشت بالاتر از کنترل بود و در تعدادی از ژن ها از جمله gdf9، bmp15، tgf?1، bmprii و act-rii این تفاوت به صورت معنادار نشان داده شد (p<0.05). از نتایج حاصله می توان این طور نتیجه گیری کرد که انجماد شیشه ای فولیکولها با روش کرایوتاپ هر چند باعث کاهش اندکی در میزان بقای آن ها می شود، اما بر بیان ژن های بلوغ تأثیر منفی نداشته و در کل روشی ایمن جهت حفظ و نگهداری فولیکول های پره آنترال است.

هدف از مطالعه حاضر تعیین ترکیب ضد یخ مناسب برای انجماد شیشه ای بافت تخمدان کامل موش صحرایی و بررسی تغییرات هورمونی، فراساختار فولیکول ابتدایی، بیان ژنهای بلوغ فولیکولی، رگزائی و آپوپتوزی بافت تخمدان انجمادی پس از پیوند به خودی است. برای قسمت اول مطالعه و به منظور تعیین ترکیب ضدیخ مناسب، تخمدان های موش های صحرایی ویستار 5 هفته ای به طور تصادفی به 13 گروه با عنوان کنترل (غیر انجمادی)، vi و ti (eg + dmso)، vii و tii (eg + proh)، viii و tiii (dmso + proh)، viv و tiv (eg + dmso و 25/0 مول در لیتر سوکروز)، vv و tv (eg + proh و 25/0 مول در لیتر سوکروز) و vvi و tvi (dmso + proh و 25/0 مول در لیتر سوکروز) تقسیم بندی شده و با استفاده از روش های بافت شناسی معمولی، em و ایمونوهیستوشیمی مورد ارزیابی قرار گرفتند. برای قسمت دوم مطالعه نیز پس از تعیین ترکیب ضدیخ مناسب و به منظور بررسی تغییرات پیوند به خودی بافت تخمدان انجمادی، تخمدان های موش با مشخصات فوق به صورت تصادفی در 6 گروه کنترل (غیر انجمادی غیر پیوندی)، nvtng (غیر انجمادی پیوندی غیر گنادکتومی)، vtng (انجمادی پیوندی غیر گنادکتومی)، nvtg (غیر انجمادی پیوندی گنادکتومی)، vtg (انجمادی پیوندی گنادکتومی) و blg (گنادکتومی دو طرفه) تقسیم بندی شده و به مانند قسمت اول، با استفاده از روش های بافت شناسی معمولی، em و ایمونوهیستوشیمی مورد ارزیابی قرار گرفتند. علاوه بر آن در این گروه ها، بیان ژن های بلوغ فولیکولی، آپوپتوزی و رگ زایی با روش real time pcr مورد ارزیابی قرار گرفته و سطح گنادوتروپین ها (lh و fsh) و هورمون های استروئیدی (استرادیول، پروژسترون و تستوسترون) در سرم خون با گروه کنترل و blg (گنادکتومی دو طرفه) مقایسه شد. نتایج نشان داد که گروه های انجمادی با ترکیبات مختلف ضدیخ در مقایسه با گروه کنترل، فولیکول های سالم کمتری داشته و درصد فولیکول های آپوپتوتیک آن ها بالاتر است. همچنین در بین گروه های انجمادی، گروه viv بهترین میزان زنده مانی را به خصوص برای فولیکول های مراحل ابتدایی داشته و درصد بروز آپوپتوز آن کمتر بود. تغییرات فراساختاری در گروه اخیر در مقایسه با گروه کنترل محسوس بوده اما نسبت به گروه فاقد سوکروز (گروه vi)، چندان مزیتی را نشان نداد. پیوند به خودی تخمدان های غیر انجمادی و انجمادی، بازگشت چرخه هورمونی و عملکرد تخمدان را به دنبال داشته و در دو گروه vtg و nvtg، به گروه کنترل نزدیک تر بود. همچنین در دو گروه اخیر، درصد بلوغ فولیکول ها و نیز فراساختار تخمدان پیوندی، وضعیت بهتری را نشان داده و بروز آپوپتوز در فولیکول های بدوی و آنترال نسبت به دو گروه nvtng و vtng بیشتر و در فولیکول های اولیه و پرآنترال کمتر شده بود. میزان بیان عوامل رگ زایی (cd34 و cd31) نیز در تمامی گروه های پیوندی به خصوص در تخمدان های دو گروه vtg و nvtg به گروه کنترل غیر پیوندی نزدیک تر شده بود. از مطالعه حاضر می توان نتیجه گرفت که ترکیب ضدیخ های eg + dmso و سوکروز، نسبت به سایر ترکیبات، برای حفظ فولیکول ها به خصوص در مراحل ابتدایی، مناسبتر است و استفاده از آن می تواند عملکرد نسبی تخمدان را پس از انجماد و پیوند به خودی به همراه داشته باشد.

هدف از انجام این مطالعه ارزیابی تغییرات هورمونی و الگوی بیان ژن های رشد فولیکولی بافت تخمدان منجمد شده رت بعد از پیوند اتوگرافت است. در این تحقیق از تخمدان موش صحرایی ماده 5 هفته ای استفاده گردید که در گروه های کنترل، انجمادی، پیوندی و انجمادی- پیوندی مورد ارزیابی قرار گرفتند. بافت تخمدان در فرآیند انجماد، ابتدا به محلول های تعادلی و انجمادی منتقل شده و بلافاصله پس از قرارگیری در محلول ذوب در زیر پوست گردن به صورت اتوگرافت و hetrotopic پیوند زده شد. در نهایت 1 و 3 هفته بعد از پیوند، تخمدان از بدن موش خارج و تحت بررسی های بافت شناسی و ملکولی قرار گرفت. مورفولوژی بافت تخمدان در تمامی گروه های آزمایشی با استفاده از رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین و میزان کمی بیان ژن های اختصاصی دخیل در رشد فولیکولی (bmp15، gdf-9، گرلین، لپتین و رسپتور های آنها ) و رگزایی (vegf) با استفاده از تکنیک real-time pcr بررسی شد. علاوه بر آن برای بررسی عملکرد هورمونی بافت پیوندی میزان ترشح هورمون های lh، fsh، استرادیول، پروژسترون، گرلین و لپتین خون در انتهای دوره پیوند اندازه گیری شد. مطالعات آماری نشان داد به استثنای هورمون گرلین و لپتین که در هفته هشتم پس از تولد اختلاف معنی داری بین گروه کنترل نسبت به گروه های پیوندی و انجمادی- پیوندی داشت اما دیگر هورمون ها تفاوت معنی داری را بین این گروه ها نشان نداند. اگرچه میزان فولیکول های بدوی و اولیه در گروه های پیوندی و انجمادی- پیوندی نسبت به گروه کنترل کاهش معنی داری را داشت اما افزایش معنی داری در تعداد فولیکول های پره آنترال، آنترال و جسم زرد مشاهده شد. میزان بیان ژن رگزایی(vegf) در گروه های انجمادی- پیوندی نسبت به گروه های کنترل، انجمادی، پیوندی افزایش معنی داری را نشان داد. ژن های اختصاصی (bmp15 و gdf9) و غیراختصاصی ( لپتین و گیرنده های لپتین و گرلین ) در گروه های پیوندی و انجمادی- پیوندی نسبت به گروه کنترل کاهش معنی دار را نشان داد این در حالیست که بیان ژن گرلین تنها در هفته هشتم پس از تولد مانند دیگر ژن های غیراختصاصی بود درحالیکه در هفته ششم تنها گروه انجمادی- پیوندی کاهش معنی داری را نسبت به گروه کنترل و پیوندی نشان داد. همچنین میزان بیان کلیه ژن های دخیل در رشد فولیکولی در گروه انجمادی نسبت به گروه کنترل در هفته پنجم پس از تولد کاهش معنی داری را داشت. نتایج این تحقیق علی رغم آسیب هایی که در طی پروسه ی پیوند و انجماد بر بافت تحمیل می گردد، نشان داد که بافت تخمدان در گروه پیوندی و انجمادی- پیوندی توانست با برقراری مجدد سیکل هورمونی، فرآیند رشد فولیکولی را از سر گیرد که افزایش تعداد فولیکول های پره آنترال، آنترال و جسم زرد و همچنین افزایش بیان ژن رگزایی دلیلی بر بهبود عملکرد بافت است. همچنین مطالعاتی که بر روی بیان فاکتورهای رشد فولیکولی صورت گرفته است نشان می دهند که میزان بیان این فاکتور ها تا مرحله پره آنترال به حداکثر میزان خود می رسند. اما به تدریج میزان بیان این ژن ها سیری نزولی را در پیش می گیرند که این مطلب به نوعی در مطالعه حاضر نیز مشاهده شد و تاییدی بر نتایج مطلوب بدست آمده در بررسی فاکتورهای رشد است.

به منظور مقایسه اثر انجمادآهسته و شیشه ای بافت تخمدان بر روند رشد فولیکول پرآنترال کشت داده شده در سیستم سه بعدی و الگوی بیان ژن های بلوغ و تکوین فولیکول ها، تخمدان های موش های سوری نابالغ ماده 14-12 روزه در سه گروه کنترل، انجمادشیشه ای و انجمادآهسته مورد مطالعه قرارگرفتند. در انجمادآهسته تخمدان هادر فریزر برنامه ریزی شده منجمد شدند و در انجمادشیشه ای نیز در محلول های انجمادی به روش needle immersed انجام شد. در مرحله بعد فولیکول های پرآنترال با قطر متوسط به روش مکانیکی از تخمدان-های تازه و منجمد- ذوب شده جدا و به مدت 12 روز در سیستم کشت سه بعدی در سدیم-آلژینیت 0/7% کشت داده شدند. میزان بقا، رشد فولیکول ها، شکل گیری حفره آنتروم و میزان بیان ژن های موثر در بلوغ تخمک (bmp15، gdf9،fgf8 ،igf1 ، kit،kit-l ) پس از 1، 8 و 12 روز کشت، بررسی شد. در نهایت میزان بلوغ تخمک های کشت داده شده ارزیابی گردید. طی ارزیابی بافت شناسی یکپارچگی بافت تخمدان درهر دو گروه انجمادی مشابه گروه کنترل بود. در بررسی میزان بقای فولیکول ها، هر دو گروه انجمادی در روز 8 و 12 بقای کمتری را نسبت به گروه کنترل نشان دادند (0/05 >p). تخمک های یکسانی نیز در هر سه گروه از مرحله gv خارج شده و به مرحله mii رسیدند. ارزیابی میزان بیان رونوشت ژن‏های بلوغ، روند نزولی ژن-های bmp15، gdf9،fgf8 ، kit،kit-l در هر سه گروه را طی کشت نشان داد. مقایسه ی بین گروه های مورد مطالعه افزایش بیان سه ژن kit ، kit-l و gdf-9 در گروه انجمادشیشه ای و ژن igf-1 در گروه انجمادآهسته طی روز اول کشت را نشان داد (0/05 >p). با توجه به نتایج مذکور، فولیکول های زنده مانده پس از فرایند انجماد و ذوب در هر دو گروه انجمادی با انجام یک واکنش جبرانی نه تنها بقای خود را حفظ و به رشد خود ادامه دادند، بلکه به صورت یکسان بر تکوین تخمک ها تأثیرگذار بودند.

پرتوانی به عنوان ظرفیت سلول ها در تمایز به همه ی لایه های جنینی تعریف شده و سلول های بنیادی جنینی، سلول های پرتوانی هستند که از توده سلولِ درونیِ (icm) بلاستوسیست تولید می شوند. سلول های بنیادی جنینی موشی بطور متعارف روی فیبروبلاست های جنین موشی (mef) و در حضور سرمِ گاوی (fbs) کِشت می شدند. مطالعات نشان داده که با مهار دو مسیر پیام رسانیِ mapk و gsk3 ، سلول های بنیادی جنینی از نژادهای مختلف موشی تولید شدندکه این محیط کشت را“2i” نامیدند. با هدف کشف مسیرهای جایگزین و بهینه کردن محیط کشت سلول های بنیادی، تاثیر تعداد زیادی از ریز مولکول ها مطالعه شده است. به تازگی پژوهشگران پژوهشگاه رویان محیط کشت “r2i” را معرفی کرده اند که با بکارگیری دو کوچک مولکول sb431542 و pd0325901 (مهارکننده های مسیر tgfβ و mapk) نه تنها قادر به تولید سلول های بنیادی جنینی با کارایی حدود 100% هستند، بلکه در مقایسه با محیط کشت شناخته شده ی “2i” ، قدرت حفظ پایداری ژنومی بیشتری دارد. در مطالعه پیش رو، بررسی مکانیسم عملکردی تولید و حفظ پرتوانی سلول ها در حضور r2i انجام شده است. بدین منظور در فاز اول، پروفایل بیان ژن در دو رده سلول بنیادی جنینیِ کشت شده در محیط r2i و 2i بررسی شد که ضرورت فعال بودن مسیر پیام رسانی bmp4 در محیط کشت r2i نتیجه گیری شد. ضرورت نقش مسیر آبشاری bmp4 در حفظ وضعیت پایه پرتوانی در محیط کشت r2i با مهار گیرنده bmp4 اثبات شد که باعث تمایز و مرگ سلولی می شود کارایی بالای محیط r2i در تولید رده سلول بنیادی جنینی، این امکان را فراهم می کند که به بررسی مکانیسم این فرایند پرداخته شود. بنابراین در فاز دوم، پروفایل بیان ژنی و متیلاسیون dna در نمونه های جنینِ کشت شده در روند تولید سلول های بنیادی بررسی شد. ما الگوی بیان متفاوتی را در شبکه تنظیمی ژن های مرتبط به پرتوانی، متابولیسم انرژی، و تنظیم کننده های مورفولوژی سلولی از قبیل آبشار اتصالات اپی تلیالی مشاهده کردیم. نتایج متیلاسیون dna ، وضعیت هیپرمتیلاسیون را در سلول های icm به نسبت سلول های es نشان می دهد. در این آزمایش متیلاسیون dna بخصوص در نواحی line1، msat و iap بررسی شده است. این مطاله درک بهتری از مکانیسم مولکولی و مدار تنظیمی تولید سلول های پرتوان جنینی ارائه می دهد. مطالعات مراحل اولیه ی جنینی نشان می دهد که سلول های icm اپی تلیالی شکل بوده و در روند تکوین و تمایز، به سلول های مزانشیمی تبدیل می شوند. بیشتر بافت ها و ارگان ها از تبدیل سلول های اپی تلیالی به مزانشیمی بوجود می آیند. این فرایند تکوینی را emt و تبدیل سلول مزانشیمی به اپی تلیالی را met می نامند. در طرح حاضر، فرضیه ای مطرح شد که انسداد فرایند emt را برای تولید سلول بنیادی جنینی موشی لازم می دانست. به منظور اثبات این فرضیه، بیان ژن های cdh1، snail، و klf4 در روند تولید سلول های es مورد ارزیابی قرار گرفتند. همچنین با القاء emt با tgf-β1 و activin در دو محیط کشت 2i و r2i این فرضیه ارزیابی شد که در نهایت منجر به تایید فرضیه "لزوم انسداد فرایند emt" در روند تولید سلول های بنیادی جنینی موشی شد.استفاده از سلول های بنیادی به دلیل توانایی نامحدود در تمایز به سلول های جدید، از مهمترین چشم اندازهای طب ترمیمی تلقی می شود. بنابراین بالا بردن کارایی تولید و کشف مکانیسم های مولکولی درگیر در سلول های بنیادی جنینی موشی، راه کاری برای افزایش دانش تولید و نگهداری سلول های بنیادی انسانی (hescs) نیز خواهد بود.

امروزه انجماد بافت تخمدان به دو روش آهسته و شیشه¬ای صورت می¬گیرد، گرچه هنوز روش مناسب برای انجماد بافت تخمدان و تاثیر روش¬های انجمادی بر الگوی بیان ژن¬های بلوغ مورد سوال است. در این مطالعه ابتدا تخمدان¬ها از بدن موش سوری نابالغ خارج و به سه گروه کنترل، انجمادآهسته و شیشه¬ای تقسیم شدند. در گروه انجماد آهسته تخمدان¬ها با استفاده از دستگاه فریز برنامه¬ریزی شده، و در گروه انجماد شیشه ای تخمدان ها به روش niv منجمد شدند. موفولوژی بافت تخمدان در گروه های کنترل و انجمادی بعد از ذوب با استفاده از رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین مورد ارزیابی قرار گرفت. فولیکول¬های پیش آنترال با روش مکانیکی از تخمدان¬های گروه کنترل و تخمدان¬های منجمد- ذوب شده گروه انجماد آهسته و شیشه¬ای جدا و به مدت 12 روز کشت داده شدند. میزان بقا 1، 8 و 12 روز پس از کشت و همچنین میزان بیان کمی ژن¬های بلوغ 1، 8 و 12 روز پس از کشت در هر سه گروه بررسی گردید. در نهایت میزان بلوغ تخمک¬های هر سه گروه نیز در روز 13 با یکدیگر مقایسه شد. . در بررسی های مورفولوژیک تمامیت و یکپارچگی بافت تخمدان در گروه های انجمادی بخوبی و مشابه گروه کنترل حفظ شده بود. در بررسی میزان بقای فولیکول¬ها طی روزهای مختلف کشت، گروه انجماد آهسته در روزهای 8 و 12 کشت بقای کمتری نسبت به گروه کنترل نشان داد (p<0.05)، گروه انجماد شیشه¬ای نیز نسبت به گروه کنترل و انجماد آهسته در تمامی روزهای کشت بقای کمتری نشان داد(p<0.05). بررسی میزان بلوغ تخمک ها نیز نشان داد که هیچ تفاوت معنی داری بین سه گروه مورد آزمایش وجود ندارد. در ارزیابی کمی بیان ژنی نیز در همه ژن¬های بلوغ به جز igf1، میزان بیان در گروه¬های انجمادی در روز 1 کشت بالاتر از کنترل بود، که این میزان در ژن bmp15 در هر دو گروه انجمادی و در ژن kit-l در گروه انجماد شیشه ای نسبت به کنترل به طور برجسته بیشتر بود (p<0.05). از نتایج بدست آمده می¬توان این طور نتیجه گیری کرد هرچند هر دو روش انجماد آهسته و شیشه¬ای بافت تخمدان بر بیان ژن¬های بلوغ تأثیر منفی نداشته، اما با توجه به میزان بقا بیشتر در گروه انجماد آهسته این روش مناسبت تر برای انجماد بافت تخمدان و حفظ ذخایر فولیکولی آن می¬باشد.

چکیده ندارد.

این پژوهش به منظور ارزیابی اثر انجماد شیشه ای کرایوتاپ و انجماد آهسته بر میزان بقا، بلوغ و بیان ژنهای آپوپتوز در فولیکول های پره آنترال جداشده از تخمدان موش انجام گرفت. مطالعه به روش تجربی بر روی موش های نابالغ 12- 14 روزه نژاد nmri انجام شد. فولیکول های پره آنترال جدا شده به گروه های غیرانجمادی، انجماد شیشه ای و انجماد آهسته تقسیم شدند. میزان بقا در فولیکول های گروه های غیرانجمادی، انجماد شیشه ای و انجماد آهسته به ترتیب 100%، 2/35±97/56% و 2/47±49/68% بود آنالیز آماری حاکی از عدم وجود تفاوت معنی دار بین گروه های غیرانجمادی و انجماد شیشه ای بود. در صورتی که گروه انجماد آهسته تفاوت معنی دار با این گروه ها داشت (p=0.00). ارزیابی بلوغ در روز چهارده کشت نشان داد میزان بلوغ در گروه غیر انجمادی 3/92 ±82/54%، گروه انجماد شیشه ای 2/91 ±71/51 % و در گروه انجماد آهسته 1/43± 30/1% بود. آنالیز آماری حاکی از وجود تفاوت معنی دار بین هر سه گروه بود(p=0.00). ارزیابی بیان ژن هایbax،bcl2 ،p53 ،fas و survivin در فولیکول های پره آنترال غیر انجمادی، انجماد شیشه ای و انجماد آهسته نشان داد بیان bcl2 در گروه انجماد آهسته به طور معنی داری نسبت به گروه انجماد شیشه ای و غیرانجمادی کاهش یافته ولی دو گروه انجماد شیشه ای و غیرانجمادی تفاوت معنی داری نداشتند. میزان بیان ژن های bax و p53 در گروه انجماد آهسته بطور معنی داری بیشتر از گروه های غیرانجمادی و انجماد شیشه ای بوده ولی بیان این ژنها در این دو گروه تفاوت معنی دار نداشت. ژن fas فقط در گروه انجماد آهسته بیان شده است. بیان survivin در سه گروه اختلاف معنی داری نداشت. نسبت بیان نیمه کمی رونوشت bax به bcl2 در گروه انجماد آهسته بطور معنی داری بیشتر از گروه های انجماد شیشه ای و غیر انجمادی بود. اما تفاوت معنی داری بین گروه های انجماد شیشه ای و غیر انجمادی مشاهده نشد (p<0.05). در مجموع می توان نتیجه گرفت انجماد شیشه ای کرایوتاپ نسبت به انجماد آهسته روش مناسب تری برای انجماد فولیکول های پره آنترال می باشد. همچنین انجماد آهسته نسبت به انجماد شیشه ای بطور معنی داری بیان ژن های آغازگر آپوپتوز را افزایش می دهد.

لقاح، لانه گزینی و تشکیل جفت رویدادهای دینامیکی هستند که در آنها ارتباطات پیچیده سلول ها مطرح می گردند. برخی از گلیکوپروتئین های عرض غشاء از جمله اینتگرین ها به عنوان رسپتور اجزای ماتریکس عمل می کنند. این مولکول ها در اتصال سلول ها به ماتریکس خارج سلولی و تسهیل مهاجرت سلولی نقش دارند و در تمام مراحل باروری، لقاح، لانه گزینی و تکوین جفت مداخله می کنند. هدف از این مطالعه بررسی بیان ژنهای اینتگرینی αv ، β3 ، α4 و β1 و لیگاند آنها استئوپونتین در موشهای فاقد تخمدان و تحت درمان با هورمون های تخمدانی در مقایسه با موش های نرمال بود. همچنین مطالعه فراساختار آندومتر و ارتباط بروز پینوپودها با بیان ژنهای اینتگرینی ذکر شده نیز از دیگر اهداف تحقیق حاضر بود. در گروه واجد تخمدان فازهای مختلف هر سیکل تعیین و نمونه برداری از 1:3 میانی رحم انجام شد و در گروه فاقد تخمدان پس از مطالعه مقدماتی بر مبنای سه معیار بافتی ارتفاع اپی تلیال، تعداد غدد و قطر غدد، روز دوم به عنوان بهترین روز نمونه برداری انتخاب شد و پس از کشتن موشها نمونه های بافتی از 1:3 میانی رحم تهیه شد سپس بروز اینتگرین های مختلف با دو تکنیک ایمونوهیستوشیمی و real time rt-pcr بررسی شد. همچنین فراساختار آندومتر گروه فاقد تخمدان با دو تکنیک sem و tem بررسی شد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد در موشهای واجد تخمدان مولکول های مورد نظر opn αv ، β3 ، α4 و β1 در کلیه فازهای مختلف سیکل استروس دیده شد و فقط در فاز مت استروس در سطح پروتئین نیز این مولکول ها مشاهده شدند. همچنین در گروه موشهای فاقد تخمدان تحت درمان بیان مولکول های مدنظر هم در سطح ژن و هم در سطح پروتئین در گروه های تحت درمان پروژسترون دیده شد ولی در گروه تحت درمان استروژن فقط در سطح ژن این مولکول ها مشاهده شدند. از نظر فراساختاری بین گروه های مورد مطالعه در موشهای فاقد تخمدان تفاوتی مشاهده نشد و در عین حال بروز پینوپودها تنها در گروه تحت درمان با پروژسترون ملاحظه شد و ارتباط خاصی بین بروز پینوپودها با بیان ژن های اینتگرینی دیده نشد. در مجموع تحقیق حاضر نشان داد که تأثیر هورمون پروژسترون در مقایسه با استروژن بر بیان اینتگرین ها در اندومتر بیشتر بوده و اختلاف در الگوی بیان این مولکول ها در سطوح مختلف اندومتر اهمیت و الویت آنها را در پدیده لانه گزینی نشان می دهد.

هدف از این مطالعه بررسی ارتباط رادیکالهای آزاد موجود در مایع منی با آسیب dna، پتانسیل غیر طبیعی غشاء میتوکندری، اپوپتوز و میزان لقاح در بیماران نابارور با علت مردانه می باشد. برای رسیدن به این هدف از نمونه اسپرم 120 زوج مراجعه کننده به پژوهشکده رویان جهت درمان ناباروری به علت فاکتور مردانه استفاده شد و از نظر پارامترهای اسپرمی مورد مطالعه قرار گرفت. نمونه مایع منی به میزان 1 میلی لیتر پس از آنالیز اولیه پروسس شده سپس به مدت 7 دقیقه در g ×500 سانتریفوژ نموده و pellet تشکیل شده را به هفت الیکوت تقسیم نموده قسمت اول جهت swim-upودرمان icsi و بررسی میزان لقاح مورد استفاده قرار گرفته و مابقی الیکوت ها از نظر میزان ros ، rns ، آسیب dna ، اپوپتوز ، پتانسیل غیر طبیعی غشاء میتوکندری و اندازه گیری آنتی اکسیدان ها مورد بررسی قرار گرفت. برای اندازه گیری میزان ros ، rns از dcfh-da به روش اسپکتروفلورومتری استفاده شد. آنتی اکسیدان موجود در مایع منی با روش اسپکتروفتومتری اندازه گیری شد. برای بررسی آسیب dna از test(scd) sperm chromatin dispersion استفاده شد. میزان اپوپتوز به کمک رنگ annexinv-pi و میزان پتانسیل غیر طبیعی غشاء میتوکندری با رنگ1 jc- به روش فلوسایتومتری اندازه گیری شد. در انتها ارتباط میزان رادیکالهای آزاد با پارامترهای ros ، rns ، آسیب dna ، اپوپتوز، پتانسیل غیر طبیعی غشاء میتوکندری موجود در مایع منی و میزان لقاح توسط تست همبستگی پیرسون و منحنی roc مورد ارزیابی قرار گرفت. بین میزان رادیکالهای آزاد موجود در مایع منی با پتانسیل غیر طبیعی غشاء میتوکندری، اپوپتوز و پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مرفولوژی غیر طبیعی) که توسط تست همبستگی پیرسون آنالیز گردید رابطه مثبت وجود داشت و اختلاف معنی دار بود. در بررسی با منحنی roc، تنها بین رادیکال h2o2 با پتانسیل غیر طبیعی غشاء میتوکندری، اپوپتوز و مرفولوژی غیر طبیعی رابطه مشاهده شد در حالی که بین میزان رادیکالهای آزاد با آسیب dna و درصد لقاح که توسط هر دو تست مورد ارزیابی قرار گرفت ارتباطی مشاهده نشد. بنابراین می توان نتیجه گرفت که با وجود ارتباط مثبت بین رادیکالهای آزاد با بعضی از پارامترهای اسپرمی، نمی توان حضور رادیکالهای آزاد در مایع منی را ملاک خوبی برای عدم وقوع لقاح و به دنبال آن ناباروری دانست و از تکنیک art جهت درمان این بیماران صرفه نظر نمود.

در این تحقیق به بررسی و مطالعه فراساختاری و ملکولی خاصیت آنتی اپوپتوزی دپرنیل بر مرگ نورون های حرکتی نخاع بعد از آکسوتومی عصب سیاتیک در نوزادان موش صحرایی پرداخته شده است.