چکیده: اشریشیاکلی انتروهموراژیک o157:h7(ehec) در انسان موجب عفونت های روده ای از فرم اسهال بدون خون ریزی تا کولیت هموراژیک و سندروم اورمی همولیتیک (huc)می شود. انتقال e. coli o157:h7 از طریق آب و غذای آلوده بوده و مهمترین و اصلی ترین مخزن این باکتری حیواناتی مانند گاو و گوسفند می باشند. این باکتری قادر است که آسیب های attaching/effacing ((a/e در سلول های اپیتلیال روده میزبان ایجاد کند. محصول پروتئینی چندین ژن در اتصال باکتری به دیواره روده و تخریب آن دخیل هستند. در این میان espa مهم ترین پروتئین سیستم ترشحی تیپ ??? می باشد و باعث انتقال پروتئین tir(گیرنده intimin) به سلول میزبان می شود. پروتئین intimin یکی از مهم ترین عوامل در ایجاد ضایعات attaching/effacing (a/e) است. در این پژوهش اپی توپ های موثر دو پروتئین espa و intimin با لینکری که از تداخل کونفورماسیون آن دو جلوگیری می کند، به هم متصل شده و درون وکتور pet28a کلون شد. پروتئین کایمریک پس از بیان در میزبان اشریشیا کلی و تخلیص به موش تزریق گردید. نتایج الایزا از سرم موش های گروه تست نسبت به کنترل افزایش قابل ملاحظه ای در تیتر آنتی بادی نشان داد. میزان اتصال باکتری به اپی تلیوم روده در موش های ایمن و کنترل از طریق shedding مورد ارزیابی و بررسی قرار گرفت که نتایج نشان دهنده کاهش اتصال باکتری به اپی تلیوم روده موش های ایمن بود.

acinetobacter baumannii یک پاتوژن فرصت طلب مهم است که به عنوان عامل تعداد زیادی از عفونت های بیمارستانی شناخته می شود. تمایل گونه های بیمارستانی به تولید بیوفیلم و ارتباط بیوفیلم با عفونت زایی و مقاومت این باکتری به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها، به خوبی شناخته شده است. آنتی بادی های مونوکلونال علیه عوامل سطحی، می تواند برای مهار بیوفیلم و در نتیجه کمک به حل مشکلات ناشی از عفونت های این باکتری مورد استفاده قرار گیرد. مطالعه ی حاضر، به منظور غلبه بر تهدیدات ناشی از این پاتوژن، برای یافتن دومین های عمل کردی و حفظ شده از یک پروتئین سطحی دخیل در تولید بیوفیلم، با استفاده از ابزار بیوانفورماتیک، طراحی شده است. بیوفیلم پروتئین a. baumannii (bap) دارای یک هسته ی متشکل از تکرار های متوالی از هفت الگوی مختلف است که از a تا g نام گذاری شده اند. حفظ شده ترین قسمت ها و نیز دومین های هومولوگ با بالاترین امتیاز در همین هسته ی تکراری خصوصاً a ، b ، c و d یافت می شوند. توالی های مرتبط با bap از بانک های اطلاعاتی موجود استخراج شده و با توالی bap هم-ردیف شدند. فایل های هم ردیفی برای ساخت درخت های فیلوژنتیک به کار گرفته شدند. در این مطالعه محل قرار گیری پروتئین در خارج سلول و وجود سیگنال هدف سیستم ترشحی نوع اول در انتهای کربوکسیل پروتئین پیش بینی شد. همچنین ساختار های دوم و سوم پروتئین پیش بینی شد.در نهایت چهار ناحیه ی حفظ شده ی مهم از نظر ساختاری و عمل کردی از این پروتئین انتخاب گردیده و برای آن ها چهار جفت پرایمر طراحی شد. مطالعه ی آنتیژنسیته و حلالیت نشان می دهد که این نواحی کاندیدای مناسبی برای تولید آنتی بادی هستند.

اشریشیا کلی انتروهموراژیک (ehec) o157:h7 عامل بیماری التهاب روده خون ریزی دهنده می باشد و مهم ترین مخزن این باکتری گاو است. با وجود شیوع کم این باکتری، شدت بیماری های ناشی از اشریشیا کلی بیماری زای روده ای، نگرانی هایی راجع به ایجاد واکسن های موثر پدید می آورد(?). پس از تولید سمی شبیه شیگاتوکسین، ابتدایی ترین عامل بیماری زایی ehec o157:h7 کلونیزاسیون آن بر اپی تلیوم روده است که منجر به ایجاد آسیب های اتصال/تخریب توسط پروتئین های کدشده از جزایر بیماری زایی می گردد. این ژن ها از جمله شامل tir است که پروتئین کدشده از آن، به غشای سیتوپلاسمی سلول اپی تلیال میزبان وارد شده به عنوان گیرنده ی intimin- پروتئین سطحی ehec- عمل می کند. در این پژوهش قطعه ای کایمر با به کار بردن اپی توپ های موثر intimin (int282c) و tir(tir105) که با توالی [(eaaak)4] به عنوان اتصال دهنده به هم پیوسته بودند، ساخته شد. این سازه سنتز شد و روی وکتور pet28a+ زیرهمسانه سازی شد و در اشریشیا کلی bl21 با استفاده از iptg القا گردید. پروتئین کایمر نوترکیب خالص شده، به موش ها تزریق شد و افزایش معنادار آنتی بادی به کمک elisa مورد سنجش قرار گرفت. برای سنجش اثر آن به عنوان کاندیدایی برای حفاظت در برابر باکتری های زنده، بر اتصال باکتری به لایه ی اپی تلیال روده، چالش با استفاده از ehec o157:h7 انجام شد. در پانزده روز پس از خوراندن ???? باکتری به موش ها، ریزش باکتری به کمک تهیه سریال های رقت در ? گرم مدفوع مورد شمارش قرار گرفت. نتایج بیان گر کاهش سریع تر تعداد e. coli o157:h7 در مدفوع موش های گروه تست در مقایسه با گروه کنترل بود. سرانجام برش های بافتی از سکوم و کولون آماده شده و بین دوگروه مقایسه شد. تعداد باکتری های اتصال یافته در بافت های موش های ایمن شده(گروه تست) کم تر از تعداد آن در بافت های موش های ایمن نشده(گروه کنترل) بود.

acinetobacter baumannii یک پاتوژن فرصت طلب مهم است که به عنوان عامل تعداد زیادی از عفونت-های بیمارستانی شناخته می شود. تمایل گونه های بیمارستانی به تولید بیوفیلم و ارتباط بیوفیلم با عفونت زایی و مقاومت این باکتری به طیف وسیعی از آنتی بیوتیک ها، به خوبی شناخته شده است. آنتی بادی های ایجاد شده علیه عوامل سطحی، می تواند برای مهار بیوفیلم و در نتیجه کمک به حل مشکلات ناشی از عفونت های این باکتری مورد استفاده قرار گیرد. مطالعه ی حاضر، به منظور غلبه بر تهدیدات ناشی از این پاتوژن با استفاده از زیر واحد 371 اسید آمینه ای از بخش های عملکردی و حفاظت شده از یک پروتئین سطحی دخیل در تولید بیوفیلم، برای ایجاد ایمنی در موش آزمایشگاهی، طراحی شده است. در این پژوهش موش های balb/c ، در سه نوبت با تزریق زیرپوستی پروتئین نوترکیب خالص، ایمن شده، هفت روز پس از آخرین یادآوری با سوش بیمارستانی آلوده شدند. مقایسه ی میزان بقا و آسیب های بافت کبد حیوانات ایمن با گروه کنترل، بیانگر نقش حفاظتی موأثر این ایمنی زایی است. در ضمن واکنش آنتی بادی ها علیه این زیر واحد با سویه های مختلف a. baumannii نشانه ی حفظ شدگی این زیر واحد در سویه های مختلف تولید کننده ی بیوفیلم است. این نتایج، به همراه اثر کاهنده ی این آنتی بادی ها بر روی تشکیل بیوفیلم a. baumannii ، نشان می دهد که این پروتئین می تواند گزینه ی مناسبی برای تولید یک واکسن جدید نوترکیب باشد.

عفونت با باکتری escherichia coli o157:h7 می تواند منجر به اسهال خونی یا سندرم اورمی همولیتیک با آسیب کلیوی (بیماری نادر اما کشنده) شود. پروتئین های intimin ، tir و espa فاکتورهای بیماری زای بیان شده توسط لوکوس lee باکتری e.coli انتروهموروژیک هستند. این باکتری به پروتئین espa به عنوان رابطی برای انتقال tir به سلول میزبان نیاز دارد و intimin در سطح قرار می گیرد که باکتری را به tir منتقل شده متصل می کند. در این تحقیق dna واکسن متشکل از ژن های eae, tir و espa برای بررسی ایمنی زایی مورد تزریق قرار گرفتند. ژن مولتی مر برو روی سه وکتور یوکاریوتی paav-mcs-gfp و pci-neo و pegfp-n1 کلون شد. paav-mcs-gfp و pegfp-n1 برای بررسی بیان ژن در سلول های t.293 مورد استفاده قرار گرفتند. و دو وکتور paav-mcs-gfp و pci-neo و به عنوان dna واکسن به کار رفتند. گروه های تست چهار بار با 50 میکروگرم paav-mcs-gfp و pci-neo مورد تزریق درون ماهیچه ای قرار گرفتند. موش های کنترل تحت همان شرایط وکتور pci-neo و pbs دریافت کردند. خون گیری قبل از تزریقات انجام شد. تیتراسیون سرم نشان داد که موش های balb/c تست تزریق شده با dna واکسن در مقایسه با گروه های کنترل به طور موفقیت آمیزی ایمن شده اند و در چالش با باکتری e.coli o157:h7 به صورت دهانی، محافظت نشان دادند. وکتورهای حاضر dna واکسنی بوجود آوردند که ایمنی محافظتی را به تنهایی یا در ترکیب با دیگر شیوه ها ایجاد می کنند. روش کار به شرح زیر بود: 1- طراحی وسنتز ژن نوترکیب وپرایمرهای اختصاصی آن 2- همسانه سازی قطعه ی موردنظر در وکتور dna واکسن و تراریخت نمودن آن در میزبان موقت 3- تخلیص وکتور همسانه سازی شده از میزبان موقت به مقدار زیاد 4- تزریق آن به موش وسنجش ایمنی زایی از طریق الایزا 5- خوراندن باکتری e.coli o157:h7 به موش و بررسی ایمنی زایی dna واکسن 6- انتقال وکتور dna واکسن به سلولهایt293 در محیط کشت و بر رسی بیان با استفاده از مارکر فلورسانس gfp که در زیر میکروسکوپ فلورسانت به رنگ سبز فسفوری دیده می شود.

در این پروژه به بررسی تجربی تأثیر قطر نانوذرات بر مشخصه های انتقال حرارت و افت فشار نانوسیال آب-اکسید تیتانیوم در کسرهای حجمی بین 0.002 و 0.02 در جریان مغشوش پرداخته شده است. بدین منظور از نانوذرات اکسید تیتانیوم با قطرهای متوسط 10، 20، 30 و 50 نانومتر برای تهیه نانوسیال استفاده گردیده است. برای انجام آزمایش ها دستگاهی به صورت مبدل دو لوله ای هم مرکز که دو جریان با جهت مخالف در آن ایجاد می شود، طراحی و ساخته شد. برای آن دسته از خواص ترموفیزیکی نانوسیال که امکان اندازه گیری وجود نداشته است از روابط موجود برای محاسبه متغیرهای مورد نظر استفاده شد. همچنین تأثیر روابط مختلف در محاسبه ضریب هدایت حرارتی نانوسیال بر عدد ناسلت متوسط مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان می دهد که عدد ناسلت متوسط و افت فشار نانوسیال با افزایش کسر حجمی نانوسیال و عدد رینولدز افزایش می یابند. همچنین نانوسیال در تمامی کسرهای حجمی و قطرهای مختلف مورد آزمایش مقادیر ناسلت متوسط و افت فشار بیشتری نسبت به آب دارد. افت فشار نانوسیال در کسرهای حجمی کوچک نزدیک به افت فشار آب می باشد. ضریب انتقال حرارت جابجایی، عدد ناسلت متوسط و افت فشار نانوسیال با تغییر قطر نانوذرات در کسرهای حجمی 002/0 و 005/0 تغییری نمی کنند. اما در کسرهای حجمی بالاتر و بازه خاصی از اعداد رینولدز، ضریب انتقال حرارت جابجایی، عدد ناسلت متوسط و افت فشار نانوسیال با کاهش اندازه نانوذرات از 50 نانومتر تا 20 نانومتر افزایش می یابند. عدد ناسلت متوسط با کاهش بیشتر قطر نانوذرات از 20 نانومتر به 10 نانومتر، کاهش خواهد یافت اما همچنان افزایش در افت فشار نانوسیال با کاهش قطر نانوذرات از 20 نانومتر به 10 نانومتر مشاهده می شود. عدد ناسلت متوسط نانوسیال بسته به عدد رینولدز و نوع رابطه بکار رفته برای محاسبه ضریب رسانندگی حرارتی نانوسیال می تواند تغییر کرده و یا بدون تغییر بماند.

listeria monocytogenes یک پاتوژن غذایی گرم مثبت، درون سلولی اختیاری و سریع الرشد فرصت طلب است که در بیماران مستعد از نظر ایمنی لیستریوزیس ایجاد می کند. میزان مرگ و میر لیستریوزیس بیش از 20% است. همچنین مننژیت، انسفالیت و مننگوانسفالیت و نیز سقط جنین در زنان باردار از عوارض عفونت با این باکتری است. acta و لیستریولیزین o (llo) دو فاکتور ویرولانس مهم این باکتری هستند. acta یکی از پروتئین های سطحی باکتری و llo یک همولیزین ایجاد کننده ی منفذ است که به خانواده ی سموم وابسته به کلسترول تعلق دارد. هر دو فاکتور ویرولانس در انتشار پاتوژن از سلولی به سلول دیگر دارای نقش حیاتی هستند. با توجه به این که بیشتر مطالعات صورت گرفته در مورد این باکتری با استفاده از مدل های موشی صورت گرفته و تعمیم نتایج آن به انسان کاملاً صحیح نیست، لذا در این مطالعه از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی برای مطالعه ی این دو فاکتور ویرولانس، به منظور تعیین نواحی موثر در ایمنی زایی، استفاده شده است. acta از جنبه ی اپیتوپ های سلول b و llo از لحاظ اپیتوپ های سلول t مورد بررسی قرار گرفتند. ساختار دوم و سوم این پروتئین نیز مورد بررسی قرار گرفت ناحیه ای حفاظت شده و عملکردی در acta معرفی شد که قادر است سلول های b را برای تولید آنتی بادی علیه این ناحیه برانگیزد. این ناحیه شامل بخش پایانه ی n و نیز بخش مرکزی توالی پروتئین مورد نظر است. وجود واحدهای تکراری، باردار بودن، آبدوستی، انعطاف پذیری، در دسترس بودن از نظر سطحی و ساختارهای دوم بتای موجود در این ناحیه از دلایل انتخاب آن به عنوان ناحیه ی قابل قبول برای تحریک سلول های b و تولید آنتی بادی علیه آن است. در مورد llo نیز اپیتوپ های سلول t پیش بینی شده و بر اساس آن ها دو سازه ی پروتئینی، یکی برای انسان و دیگری برای موش، طراحی شدند. ژن مربوط به این سازه ها نیز طراحی و از نظر کدون های مورد استفاده و نیز بسیاری از پارامترهای موثر در کارایی بیان، بهینه سازی شدند. تغییرات پس از ترجمه ای احتمالی که ممکن است سازه ها در سلول میزبان متحمل شوند نیز پیش بینی شد. پایداری mrna رونویسی شونده از روی این دو ژن نیز بررسی شد و نشان داده شد که ژن بهینه سازی شده mrna مناسب تری برای ترجمه دارد. همچنین جایگاه قرارگیری پروتئین ترجمه شده نیز در سلول یوکاریوتی پیش بینی شد (مسیر ترشحی). قرار گرفتن در مسیر ترشحی کارایی نامزدهای واکسن را از نظر تحریک سیستم ایمنی افزایش می دهد. در نهایت این دو سازه به عنوان یک نامزد واکسن dnaیی معرفی و راهکارهایی برای بهبود و کارایی بیشتر آن عرضه گردید. این راهکارها شامل افزودن سیگنال های مناسب نظیر سیگنال یوبی کوئیتین، قلاب gpi، موتیف شبه pest به ابتدای توالی، گزینش صحیح وکتور مناسب و نیز نحوه ی کارامد ایمنی زایی و عرضه ی این واکسن به میزبان است.

اشریشیاکلی سویه o157:h7 یکی از مهمترین پاتوژن های تولید کننده بیماری کولیت خونریزی دهنده در انسان می باشد. دام های اهلی اصلی ترین مخزن این باکتری بوده و بکارگیری واکسن بر علیه آن یکی از مهمترین را ه های پیشگیری این باکتری می باشد. پروتئین های intimin، tir و espa مهمترین فاکتورهای بیماریزایی این باکتری به حساب می آیند که توسط ژن های جزیره پاتوژنسیته lee تولید می شوند. پروتئین espa از پروتئین هایی است که در ساخت کانال ارتباطی در سیستم ترشحی نوع iii نقش داشته و مانند یک رابط سبب انتقال پروتئین tir به سلول میزبان می شود و در نهایت پروتئین intimin با اتصال به tir اتصال محکم و اختصاصی باکتری به سلول میزبان را سبب می شود. این اتصال باعث ایجاد ضایعه تخریب دیواره سلول یا a/e میزبان می گردد. فرضیه انجام تحقیق بر این اصل است که تولید دو عامل بیماریزا از سه مورد فوق به صورت کایمریک و به عنوان یک ایمونوژن خوراکی می تواند با تحریک مناسب سیستم ایمنی میزبان مانع کلونیزاسیون باکتری e. coli o157:h7 در حیوان شود. برای این منظور یک سازه ژنی حاوی قسمت های ایمنی زایeae (i) وtir (t) با استفاده از یک رابط پپتیدی به یکدیگر متصل و ژن آن به طور مصنوعی ساخته شد. این ژن مصنوعی براساس کدون های گیاه بهینه سازی و سپس تحت کنترل پروموتر camv35s در ناقل بیانی گیاه جهت بیان درون گیاه تنباکو کلون شد. در نهایت این گیاهان تراریخت حاوی این ایمونوژن دو گانه جهت بررسی ایمنی زایی به حیوان مدل به صورت خوراکی داده شد و سپس خون حیوان برای بررسی انتی بادی های تولید شده تحت آنالیزهای مولکولی قرار گرفت.

عفونت های اسهالی یکی از شایعترین بیماری ها در سراسر جهان هستند.دو جنس shigella و escherichia اعضای مهم خانواده انتروباکتریاسه ها ( enterobacteriaceae) و عامل اصلی اسهال های عفونی می باشند. شیگلا از طریق تهاجم به سلول های اپی تلیال روده باعث ایجاد اسهال وشیگلوزیس می شوند.یکی از کلیدی ترین پروتئین هایی که در تهاجم نقش دارد ipac است. باکتری های دیگری از جمله etecو ehecاز جمله عوامل عمده در ایجاد اسهال هستند.عامل بیماریزائی اصلی در etec ، cfa/iاست که از دو زیر واحد cfab و cfaeتشکیل شده است. در باکتری ehec، اولین مرحله برای عفونت زایی،اتصال پروتئینی به نام intimin به لایه اپی تلیال میباشد که توسط ژن eae کد می شود. بنابراین با تولید واکسنی شامل این سه پروتئین شاید بتوان از اتصال سه باکتری مذکور ومتعاقبا ایجاد اسهال جلوگیری کرد. هدف از این تحقیق طراحی و تولید پروتئین کایمر(cii) از سه ژن cfab, eae و ipac که بتواند برعلیه این سه باکتری ایمنی ایجاد کند. ژن کایمر ;cii که شامل نواحی ایمونوژیک سه پروتئین فوق بود طراحی و بهینه سازی کدونی شد. آنالیزهای بیوانفورماتیکی و ایمونوانفورتیکی بر روی ژن نوترکیب کایمر انجام شد. بعد از سنتز، این ژن در e. coli کلون و بیان شد. به منظور بررسی ایمنی زایی cii، موش، خوکچه هندی ورده سلولی caco-2 به عنوان مدل برای چالش باکتری های ehec،shigella وetec به ترتیب، انتخاب شدند. نتایج حاکی از این بود که پروتئین cii پاسخ ایمنی قوی القا میکند. بنابراین این پروتئین کایمر می تواند به عنوان یک کاندید واکسن بر علیه طیف گسترده ای از عفونت های اسهالی مورد مطالعه بیشتری قرار گیرد.

یکی از شایعترین عوامل ایجاد کننده بیماری اسهال که هر ساله سبب مرگ تعداد زیادی در جهان می شود باکتری های اشریشیا کلی انتروتوکسیژنیک (etec) ، شیگلا فلکسنری و اشریشیا کلی انتروهموراژیک (ehec ) می باشند. امکان به وجود آمدن ایمنی حفاظتی برعلیه این بیماری وجود دارد، لذا طراحی و ساخت واکسن علیه این بیماری از اهداف سازمان های بهداشتی نظیرwho می باشد.etec گروه متنوعی از پاتوژن ها هستند که توانایی تولید و حمل انتروتوکسین های حساس و مقاوم به حرارت را بعد از کلونیزاسیون در روده کوچک داردند . کلونیزاسیون ویژگی بیماری زایی ضروری برای etec می باشد. چسبندگی به واسطه فاکتور های کلونیزاسیون (cf ) صورت می گیرد . در این بین آنتی ژن cfa/i ، شایع ترین فاکتور ویرولانس جدا شده از etec است . cfa/i واجد یک ساختار ساقه مانند است که که شامل زیر واحد اصلی و عمده cfab و زیر واحد فرعیcfae است . زیر واحد cfab جزو پروتئین های متصل شونده به گلیکواسفنگولیپید ها می باشد ، به نظر می رسد این زیر واحد نقش حیاتی و مهمی را در اتصال باکتری به سلول های اپیتلیال روده کوچک بازی می کند و کاندید مناسبی برای تولید واکسن است . دراشریشیاکلی سویه o157:h7 پروتئین های intimin، tir و espa مهمترین فاکتورهای بیماریزایی این باکتری به حساب می آیند که توسط ژن های حاضر در جزیره پاتوژنسیته lee تولید می شوند. پروتئین espa بخش اصلی از پروتئین هایی است که در ساخت کانال ارتباطی در سیستم ترشحی نوع iii نقش داشته و مانند یک رابط سبب انتقال پروتئین tir به سلول میزبان می شود ( در اینجا انسان) و در نهایت پروتئین intimin با اتصال به tir ،اتصال باکتری به سلول میزبان را سبب می شود. این اتصال باعث ایجاد ضایعه تخریب دیواره سلول یا ae میزبان می گردد . ژن eae کد کننده پروتئین intimin است که این پروتئین برای کلونیزاسیون در موکوس روده و ایجاد ضایعه ae ضروری می باشد . از طرف دیگر شیگلا فلکسنری نیز برای تهاجم سلولی نیازمند کد کردن ژن هایی که در پلاسمید های تهاجمی باکتری ، است .اپرون mix-spa پروتئین های سیستم ترشحی تیپ iii را کد می کند که نقش ترانسفر کننده و افکتور را در ورود با کتری به داخل غشا و سیتوپلاسم سلول میزبان دارد . پروتئین های ipaa-d در این پروسه نقش مهمی را ایفا می کنند . در بین پروتئین هایی که به وسیله این سیستم ترشح می شوند ipac به عنوان تحریک کننده پلی مریزاسیون اکتین و شکل گیری فیلوپودا و لامیناپودا می باشد که از مهم ترین مراحل در ورود باکتری می باشد . در این تحقیق ما ژنهای ipac,intimin,cfab را در وکتور های pet-28a,pet-32a کلون کردیم .بعد از بیان و تخلیص پروتئین های نوترکیب ایجاد شده ایمنی ایجاد شده به وسیله آنها در موش و خوکچه هندی به عنوان یک واکسن trivalent بررسی شد . نتایج نشان داد که این واکسن کارایی بالایی در تحریک سیستم ایمنی همورال داشته و می تواند به عنوان یک کاندید واکسن مناسب مطرح شود . کلید واژه : اشریشیا کلی انتروهموراژیک ، اشریشیا کلی انتروتوکسیژنیک ، شیگلا فلکسنری ، واکسن trivalent ، ژن های ipac,intimin,cfab

چکیده اشریشیاکلی سویه o157:h7 یکی از عوامل بیماری زایی مهم انسان و دام می باشد. اتصال باکتری به سلول میزبان، اولین گام در تثبیت و بیماری زایی است که به واسطه سیستم ترشحی نوعiii صورت می گیرد. در این میان espa به عنوان اصلی ترین جزء تشکیل دهنده سیستم ترشحی ارتباط تنگاتنگی با اتصال اولیه ی باکتری به سلول میزبان دارد. . espa به سبب ساختار خود و قرار گرفتن آن در غشاء خارجی باکتری، یک ایمنی زای قوی می باشد. tirنیز پروتئینی است که پس از بیان در باکتری و از طریق سیستم ترشحی نوعiii به سلول میزبان منتقل و در غشاء آن مستقر می شود و نقش مهمی در اتصال باکتری به میزبان دارد. سیستم های بیان گیاهی به دلیل هزینه ی پایین تولید، انجام تغییرات پس از ترجمه ای مشابه سایر سلول های یوکاریوتی، تشکیل ساختار صحیح پروتئین تولیدی و عدم آلودگی محصولات به عوامل بیماری زای انسانی، توالی های سرطان زا، پریون ها، جایگزینی مناسب برای سیستم های بیانی مرسوم محسوب می شوند. بیان آنتی ژن عوامل بیماری زایی میکروبی و ویروسی در گیاهان جهت تولید واکسن های خوراکی مطلوبیت ویژه ای دارند. به ویژه اینکه سلول های گیاهی به عنوان میکروکپسول های طبیعی از آنتی ژن های واکسن هنگام عبور از دستگاه گوارش محافظت می کنند. پروتئین های ایمونوژنیک کلیدی عوامل بیماری زا می توانند در بافت های گیاهی بیان شده و به عنوان واکسن خوراکی به انسان یا حیوانات ارزشمند اقتصادی خورانده شود. دریافت دهانی واکسن به دلیل هزینه کمتر و انجام ساده تر جایگزین جذاب و مناسبی برای تزریق می باشد. همچنین شانس دست یافتن به ایمنی مخاطی علیه عوامل عفونی که از این سطوح وارد می شوند با دریافت دهانی افزایش می یابد. در این تحقیق برای تهیه ی سازه ی ژنی حاوی قسمت های ایمنی زایespa(e) وtir(t) که با استفاده از یک رابط پپتیدی به یکدیگر متصل شده بودند از روش soeing pcr استفاده گردید. این ژن مصنوعی براساس کدون های گیاه بهینه سازی شد. در ادامه سازه ی فوق جهت همسانه سازی به ناقل pjet منتقل گردید. پس از اطمینان از صحت همسانه سازی از طریق توالی یابی، سازه ی دوتایی et جایگزین ژن gus در ناقل بیانی گیاهی شد و تحت کنترل پیشبرنده دائمی camv 35s قرار گرفت. سپس ساختار تهیه شده به agrobacterium tumefaciens وارد گردید و از آن برای تراریختی ریز نمونه های توتون استفاده گردید. پس از دو روز هم کشتی توام با اگروباکتریوم روی محیط هم کشتی، ریز نمونه ها به محیط باززایی انتخابی حاوی کانامایسین منتقل شدند.شاخساره های باززایی شده با اندازه ی مناسب به محیط ریشه زایی انتقال یافتند. تائید تراریختی گیاه با آزمون pcr و با آغازگر های اختصاصی صورت گرفت. برای تائید بیان ژن کایمریک et،در سطح رونویسی از آزمون rt-pcr استفاده شد.

افزایش مقاومت باکتری های بیماری زا نسبت به آنتی بیوتیک ها، یکی از چالش های دهه های اخیر است. بنابراین در راستای مبارزه با عوامل بیماری زا یافتنعوامل ضدمیکروبی جدید و استفاده از آن ها ضروری می باشد. در این پژوهش فعالیت ضدمیکروبی پپتید هیبرید سکروپین-ملیتینcm11، (wklfkkilkvl-nh2)، بر روی سویه های استاندارد و ایزوله های بیمارستانی 7 گونه باکتری مورد ارزیابی قرار گرفت. از طرفی، برای کاهش هزینه درمان و اثر سایتوتوکسیک پپتید cm11، میانکنش آن با آنتی بیوتیک های رایج بررسی شد. همچنین خاصیت همولیزکنندگی آن و اثرسمیت آن بر روی سلول های سرطانی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که حداقل غلظت مهارکننده پپتید cm11 برای 6 سویه استاندارد برابر با (mg/l) 4 و برای کلبسیلا پنومونیه (mg/l)8 بود در حالی که این غلظت برای 90 درصد ایزوله های بیمارستانی تمامی سویه ها برابر با (mg/l)8 بود. نتایج روش سنجش زمان کشتن نشان داد، در غلظت 2x mic، تمام باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس بعد از 240 دقیقه کشته شدند درحالی که این زمان برای سویه های سودوموناس آئروژینوزا، کلبسیلا پنومونیه و سالمونلا تیفی موریوم 120 دقیقه بود. نتایج چکربورد نشان داد که میانکنش های پپتید با سیپروفلوکساسین (بر روی اشرشیا کولی)، نورفلوکساسین (برروی اسینتوباکتر بومانی و کلبسیلا پنومونیه)، سفتازیدیم (بر روی سودوموناس آئروژینوزا) و با پنی سیلین (بر روی استافیلوکوکوس اورئوس) ازنوع سینرژیست بوده و با آمپی سیلین و آمیکاسین خنثی بود و مابقی میانکنش های دیگر آنتی بیوتیک ها با پپتید در تمامی سویه ها از نوع افزایشی یا سینرژیسم جزئی بود. نتایج بررسی میزان سمیت این پپتید برای یوکاریوت ها نشان داد که این پپتید در غلظت (mg/l) 48 حدود 50% گلبول های قرمز را لیز می کند و در غلظت (mg/l) 12 بعد از 24 ساعت حدود 45% سلول های cho و 22% از سلول های هلا را از بین می برد . در واقع این غلظت ها از غلظت موثر بر پروکاریوت ها بیشتر است. این پژوهش اولین گام در بررسی و سنجش in vitro پپتید cm11 به عنوان آنتی بیوتیک جدید بودو نشان داد که این پپتید فعایت ضد میکروبی قابل توجه و از نوع باکتریوسایدال در برابر باکتری ها دارد. همچنین استفاده ترکیبی این پپتید با آنتی بیوتیک ها، می تواند در کاهش غلظت های مورد نیاز از آنتی بیوتیک در طی درمان موثر باشد. یافته های این پژوهش ، می تواند در دستیابی به داروهای جدید و کاربردی جهت درمان عفونت های حاصل از باکتری های مقاوم بیمارستانی موثر واقع شود.

سرطان سینه شایع ترین سرطان در میان زنان در جهان است. یکی از روش ها برای تشخیص سرطان سینه شناسایی نشانگرهای مرتبط به تومور است. موسین1 (muc1)، یک آنتی ژن مرتبط به تومور، گلیکوپروتئین غشایی است که توسط سلولهای اپی تلیال طبیعی بیان می شود و توسط کارسینوماهای با منشاء اپی تلیال بیانش افزایش می یابد. همچنین گیرنده فاکتور رشد اپیدرمال-2 (her2/erbb-2) متعلق به یکی از چهار عضو خانواده تیروزین کیناز نوع یک است که بیان بیش از حد آن با درجه بدخیمی سرطان سینه همراه است. این مطالعه به منظور تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی و طراحی یک پروتئین کایمریک نوترکیب حاوی آنتی ژن هایmuc1 وher2 برای بیان در میزبان پروکاریوتی e. coli)) به عنوان ابزار تشخیص سرطان پستان انجام شد.توالی های ایمنوژنیکmuc1 وher2 استخراج شد و توسط لینکر به یکدیگر متصل شدند. ساختار کایمریک توسط نرم افزارهای بیوانفورماتیک تجزیه و تحلیل شد. بهینه سازی، خالص سازی و ارزیابی بیان پروتئین کایمریک با استفاده از روش های وسترن بلات، الایزای غیر مستقیمi-elisa) ) و ایمونوهیستوشیمی (ihc) انجام شد. نتایج نشان دادند که ساختار کایمریک، دارای پایداری مناسب و دومین های ایمونوژن که در معرض قرار گرفته اند. وکتورpet-28a حاوی ژن کایمریک، بیان در سطح بالایی داشته است. پروتئین کایمریک نوترکیب با استفاده از وسترن بلات تایید شد و با استفاده از روش هایi-elisa و ihc مورد ارزیابی قرار گرفت.پس از آن پپتیدهای ترکیبی muc1 و her2، می توانند به عنوان آنتی ژن های پوششی در i-elisa برای تشخیص آنتی بادی ها بر علیه muc1 یا her2 در سرم انسانی مورد استفاده قرار گیرند.

استافیلوکوکوس اورئوس یکی از پاتوژن های مهم جدا شده از عفونت های بیمارستانی و اکتسابی اجتماع می باشد. با توجه به شیوع فزآینده سویه های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به چند نوع آنتی بیوتیک و همچنین مقاوم به ونکومایسین، راهکارهای جدیدی به منظور پیشگیری از رخداد عفونت استافیلوکوکوس اورئوس ضروری است. سویه های استافیلوکوکوس اورئوس طیف وسیعی از فاکتورهای بیماری زا را تولید می کنند، از این رو انتخاب کاندید های واکسن نوترکیب بر پایه چند فاکتور بیماری زا در مقایسه با کاندیدهای واکسن تک ظرفیتی علیه این سویه ها مؤثرتر واقع خواهد شد. در این مطالعه یک کاندید واکسن نوترکیب چند ظرفیتی بر پایه نواحی آنتی ژنیک سه فاکتور مهم بیماری زا که در اکثر سویه های استافیلوکوکوس اورئوس بیان می شوند، یعنی گاما همولیزین(hlg)، شاخص سطحی تنظیم آهنb (isdb) و کلامپینگ فاکتور (clfa) a، طراحی شد. آنالیزهای بیوانفورماتیکی جهت پیش بینی ساختار سازه سنتتیک و پایداری آن مورد استفاده قرار گرفت. اپی توپ های پیوسته و ناپیوسته b-cellشناسایی شد. پروتئین نوترکیب در وکتور بیانی (+) pet28a سنتز و در سویه بیانیe.coli bl21(de3) بیان شد. تخلیص پروتئین نوترکیب با استفاده از کروماتوگرافی میل پیوندی با رزین ni-nta انجام گرفت. سنجش میزان igg سرمی و عیار آنتی بادی القاء شده علیه پروتئین نوترکیب clfa-isdb-hlg (cih) بعد از هر سه مرحله ایمیونیزاسیون بر روی تک تک سرم های ایمن و غیرایمن با استفاده از آزمون الایزا صورت پذیرفت. سنجش سطح ایزوتایپ های igg سرمی igg1, igg2a, igg2b, igg3 نیز با استفاده از آزمون الایزا صورت پذیرفت. فعالیت عملکردی سرم های جمع آوری شده از هر سه گروه، در آزمون اپسونوفاگوسیتوز و با استفاده از ماکروفاژهای صفاقی موشی انجام گرفت. تمامی موش ها به مدت 7 روز بعد از چالش برای بررسی بقا پیگیری شدند. نتایج حاصل از چندین آنالیز بیوانفورماتیک نشان داد، پروتئین نوترکیب از لحاظ ساختاری دارای پایدار مناسبی بوده و به طور چشمگیری قابلیت تحریک سلول های ایمنی b-cell را خواهد داشت. نتایج حاصل از ایمیونیزاسیون موش های balb/c با پروتئین نوترکیب cihنیز حاکی از قدرت بالای آن در تحریک ایمنی همورال و افزایش قدرت اپسونوفاگوسیتوز است. در نتایج حاصل از چالش اختلاف معنادری در کاهش تعداد باکتری های جدا شده از نمونه های طحال موش های ایمن شده با پروتئین نوترکیب cih در مقایسه با گروه کنترل مشاهده گردید (004/0p=). ایمونیزاسیون موش ها با پروتئین نوترکیب cih همچنین سبب کاهش 5/28 درصدی میزان مرگ و میر در موش های ایمن در مقایسه با گروه کنترل شد. در مجموع نتایج حاصل نشان داد، پروتئین نوترکیب cih می تواند سبب القای پاسخ های ایمنی قوی و مؤثر در مقابل عفونت باکتریمی استافیلوکوکوس اورئوس در مدل موشی گردد.

توکسین بوتولینیوم تیپ a که توسط یک باکتری گرم مثبت بی هوازی تولید کنند? اسپور به نام کلاستریدیوم بوتولینیوم تولید می شود، با فعالیت آنزیمی مانع از رها شدن وزیکول حاوی نوروترنسمیتر تحریکی استیل کولین، در محل اتصال عصب- عضله شده و بنابراین به طور موقت از انتقال پیام عصبی و انقباض عضله جلوگیری می کند. امروزه، از این ویژگی توکسین در پزشکی برای درمان بعضی نقایص ماهیچه ای استفاده می شود. هدف این مطالعه تولید زنجیر? سبک توکسین بوتولینیوم تیپ a [bont/a (1- 448)] به صورت فیوژن با پپتید tat از خانواد? پپتیدهای نفوذ کننده به سلول (cell penetrating peptides) یا cpp و بررسی میزان جذب توکسین از سطح پوست و ارزیابی عملکرد آن بود. به طور خلاصه، ابتدا توالی dna زنجیر? سبک توکسین بوتولینیوم تیپ a که بخش کاتالیتیک توکسین است پس از برش با آنزیم های محدودگر مناسب، درون ناقل بیانی پروکاریوت، pet28a، که حاوی دنباله هیستیدین و توالی ژن مربوط به پپتید tat است، کلون گردید. بعد از ترانسفر ناقل بیانی میزبان باکتریایی و القای بیان با iptg، تأیید بیان به روش وسترن بلاتینگ با کمک آنتی بادی anti-his صورت گرفت. بعد از تخلیص،ورود پروتئین کایمریک تولید شده به کشت سلولی به روش وسترن بلاتینگ بررسی گردید. جهت بررسی فعالیت پروتئین نوترکیب به صورت in vitro، پروتئین snap-25 به عنوان سوبسترا استفاده شده و قطعات حاصل از هضم آنزیمی، با روش hplc جداسازی شدند. سر انجام، جذب سطحی آن از پوست حیوان آزمایشگاهی با کمک ایمونوهیستوشیمی مورد ارزیابی قرار گرفت.

سیتومگالو ویروس یکی از شایع ترین ویروس های بیماری زا در سراسر جهان است. در موارد عفونت مادرزادی منجر به اختلالات شدید عصبی و حتی مرگ جنین و در افراد با سرکوب ایمنی باعث بروز علائم بالینی شدیدی می شود. از میان تمامی استراتژی های واکسیناسیون، واکسن های بر پایه اپی توپ های شاخص ایمنی زا (epitope-based vaccine)، بهترین راهکار برای پیشگیری از ابتلا به این ویروس می باشند. در این مطالعه اپی توپ های شاخص از آنتی ژن های گلیکوپروتئین b و فسفوپروتئین 65 و 150 ویروس که بهترین محرک های ایمنی هومورال و سلولار می باشند، انتخاب گردید. با کمک الگوریتم های بیوانفورماتیکی، سازه ژنی طراحی و آنتی ژنیسیتی آن توسط نرم افزار vaxijen بررسی گردید. سایر نرم افزارها جهت سنجش پایداری mrna و نقشه یابی اپی توپ ها به کار برده شد و نهایتا سفارش سنتز ژن صورت گرفت. در ادامه قطعه ژنی در یک وکتور یوکاریوتی مناسب واکسن dna ساب کلون گردیده و با انتقال آن به لاین سلول یوکاریوتی مناسب و انجام تکنیک وسترن، بیان ترانس ژن در شرایط in vitro بررسی گردید. نتایج این مطالعه نشان می دهد وکتور نوترکیب، کاندید خوبی جهت ادامه مراحل و ارزیابی در مدل آزمایشگاهی می باشد.