کلون سازی و بیان ژن رمزکننده آنزیم لاکاز قارچ Trametes در میزبان مخمری و تعیین خصوصیات کینتیکی و بیوشیمیایی آنزیم

لاکاز متعلق به خانواده پلی فنول اکسیداز است و به دلیل خواص ساختاری و عملکردی در حذف آلودگی­های زیست محیطی اهمیت بسیار زیادی دارد. اخیرا قابلیت اکسیداسیون مواد فنلی و غیر فنلی لاکاز مورد توجه بسیاری از محققان قرار گرفته است. هدف از این پژوهش، تولید لاکاز نوترکیب و تعیین خصوصیات بیوشیمایی و کینتیکی آنزیم است. از آنجائیکه قارچ Trametes قابلیت تولید مقدار اندک لاکاز را دارد، جهت تولید انبوه، توالی آمینواسیدی لاکاز شناسایی و توالی ژنی مطابق ترجیج کدونی میزبان مخمری Pichia pastoris، طراحی و سنتز شد. ژن لاکاز سنتزی تحت کنترل پروموتور قوی القایی AOX و سیگنال پپتید αMF در ناقل PpinkαHC کلون سازی و پس از انتقال به میزبان متیلوتروف Pichia pastoris داخل ژنوم اینتگره شد و به ترتیب در محیط­های بیانیBMGY  و القاییBMMY  با متانول به صورت خارج سلولی بیان شد. پس از بررسی­کمی وکیفی آنزیم، خصوصیات فیزیکوبیوشیمیایی آنزیم نوترکیب تعیین شد. بررسی فعالیت لاکازی سوپرناتانت مخمرهای ترانسفورم شده، بیان خارج سلولی آنزیم نوترکیب فعال را نشان داد. بررسی سوپرناتات نشان داد وزن مولکولی لاکاز نوترکیب 65 کیلو دالتون است. همچنین بررسی ویژگی­های بیوشیمیایی لاکاز نوترکیب، محدوده pH اسیدی وسیع با pH بهینه 8/4 و نتایج سنجش پروفایل دمایی، بهینه دمای C°60 را نشان داد. با بررسی پارامترهای کینتیکی، µM140= Km  تعیین شد که نتایج بدست آمده نشان داد لاکاز نوترکیب با مقدار تولید انبوه و خصوصیات فیزیکوشیمیایی مناسب با معیارهای صنعتی، به صورت فعال و خارج سلولی بیان شده است. آنزیم لاکاز نوترکیب بیان شده قابلیت کاربری در صنایع متعدد دارویی، غذایی و استفاده در بیوتکنولوژی جهت پاکسازی محیط زیست را دارد.