طراحی کنترل داخلی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز باکتری مایکوپلاسما به روش رقابتی

چکیده سابقه و هدف: مایکوپلاسماها مهمترین و جدی‌ترین آلوده‌کننده‌های فرآورده‌های بیولوژیک تولیدی در کشت‌های سلولی می‌باشند. تکنیک PCR جهت شناسایی سریع جنس مایکوپلاسما، از اولویت بالایی برخوردار است. اما یکی از معایب این روش، نداشتن کنترل داخلی است. هدف اصلی این مطالعه، استاندارد کردن تست PCR تشخیص جنس مایکوپلاسما از طریق ساخت کنترل داخلی به روش رقابتی است. مواد و روش‌ها: با استفاده از پرایمرهای ویژه‌ی هدف 16S rRNA، تست PCR جهت تشخیص مولکولی جنس مایکوپلاسما بهینه شد. پرایمرهای مرکب (Composite Primer) برای کنترل داخلی با استفاده از پرایمرهای ژن کینتوپلاست انگل لیشمانیا طراحی و سپس قطعه‌ی کنترل داخلی تکثیر گردید. هر دو محصول هدف و کنترل داخلی بعد از خالص‌سازی به پلاسمید PTZ57 R اتصال و سپس در باکتری اشرشیا کلی JM107 ترانسفورم و نهایتاً کلون گردید. یافته‌ها: اندازه‌ی محصول تشخیصی و کنترل داخلی به ترتیب 272bp و 672bp بود، که از نظر اندازه، اختلاف مطلوبی با هم داشتند. تعداد حداقل کنترل داخلی در هر واکنش، 1000 عدد تعیین شد. حساسیت تست PCR برای تشخیص جنس مایکوپلاسما، 10 باکتری به دست آمد. در تست ویژگی با عوامل مختلف، هیچ محصول ناخواسته‌ای مشاهده نشد. طیفی که در آن تکثیر کنترل داخلی مشاهده شد، بین صد تا ده میلیون باکتری بدست آمد. نتیجه‌گیری: در کنار سرعت و دقت بالای تکنیک PCR، نتایج منفی و مثبت کاذب که به دلیل وجود مهارکننده‌های واکنش PCR رخ می‌دهند، می‌تواند کارایی این روش را کاهش دهد. استفاده از یک DNA دیگر به عنوان کنترل داخلی می‌تواند این خطاها را شناسایی کند.